ကိုယ်ခံအားစနစ် ပြုပြင်ပြောင်းလဲပေးသော ဇီဝဖြစ်စဉ် ဖြစ်စဉ်များသည် အကျိတ် အဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင် (TME) ၏ အဓိက အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်သော်လည်း ခြွင်းချက်အနည်းငယ်မှလွဲ၍ ၎င်းတို့၏ အထောက်အထားများကို အများစု မသိရှိရသေးပါ။ ဤနေရာတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အဆင့်မြင့် serous carcinoma (HGSC) ရှိသော လူနာများ၏ အကျိတ်များနှင့် ရေဖျဉ်းရောဂါများမှ အကျိတ်များနှင့် T ဆဲလ်များကို ဤကွဲပြားသော TME အခန်းများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို ဖော်ထုတ်ရန် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ ရေဖျဉ်းရောဂါနှင့် အကျိတ်ဆဲလ်များတွင် ဇီဝဖြစ်စဉ် ဖြစ်စဉ် ကွာခြားချက်များ ကျယ်ပြန့်စွာ ရှိသည်။ ရေဖျဉ်းရောဂါနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ အကျိတ်စိမ့်ဝင်သော T ဆဲလ်များသည် 1-methylnicotinamide (MNA) တွင် သိသိသာသာ ကြွယ်ဝပါသည်။ T ဆဲလ်များတွင် MNA အဆင့် မြင့်မားနေသော်လည်း၊ nicotinamide N-methyltransferase (S-adenosylmethionine မှ nicotinamide သို့ methyl အုပ်စုများ လွှဲပြောင်းခြင်းကို အရှိန်မြှင့်ပေးသော အင်ဇိုင်း) ၏ ဖော်ပြမှုသည် fibroblasts နှင့် အကျိတ်ဆဲလ်များအတွက်သာ ကန့်သတ်ထားသည်။ လုပ်ဆောင်ပုံအရ၊ MNA သည် အကျိတ်ကို အားပေးသည့် cytokine tumor necrosis factor alpha ကို ထုတ်လွှတ်ရန် T ဆဲလ်များကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ ထို့ကြောင့်၊ TME မှ ဆင်းသက်လာသော MNA သည် T ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်ခံအား ထိန်းညှိမှုတွင် ပါဝင်ပြီး လူသားကင်ဆာကုသမှုအတွက် အလားအလာရှိသော ကိုယ်ခံအားကုထုံးပစ်မှတ်တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
အကျိတ်မှရရှိသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်များသည် အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေး ကိုယ်ခံအားအပေါ် နက်ရှိုင်းစွာ ဟန့်တားနိုင်သော အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိနိုင်ပြီး၊ ၎င်းတို့သည် ရောဂါတိုးတက်မှုအတွက် အဓိကမောင်းနှင်အားအဖြစ်လည်း ဆောင်ရွက်နိုင်ကြောင်း အထောက်အထားများ ပိုမိုများပြားလာသည်နှင့်အမျှ ပြသနေသည် (1)။ Warburg အကျိုးသက်ရောက်မှုအပြင်၊ မကြာသေးမီက ကင်ဆာဆဲလ်များ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်အခြေအနေနှင့် အကျိတ်အဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင် (TME) ၏ ကိုယ်ခံအားအခြေအနေနှင့် ၎င်း၏ဆက်နွယ်မှုကို ဖော်ပြရန် စတင်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ မောက်စ်မော်ဒယ်များနှင့် လူသား T ဆဲလ်များအပေါ် လေ့လာမှုများအရ ဂလူတာမင်းဇီဝဖြစ်စဉ် (2)၊ အောက်ဆီဒေးရှင်းဇီဝဖြစ်စဉ် (3) နှင့် ဂလူးကို့စ်ဇီဝဖြစ်စဉ် (4) တို့သည် မတူညီသော ကိုယ်ခံအားဆဲလ်မျိုးကွဲများတွင် သီးခြားစီလုပ်ဆောင်နိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဤလမ်းကြောင်းများရှိ ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်များစွာသည် T ဆဲလ်များ၏ အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေးလုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားသည်။ coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) ၏ ပိတ်ဆို့ခြင်းသည် T ဆဲလ်များ၏ ပွားများမှုကို ပျက်စီးစေနိုင်ပြီး ခန္ဓာကိုယ်တွင် BH4 တိုးလာခြင်းသည် CD4 နှင့် CD8 မှ ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးသော အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေး ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ kynurenine ၏ ကိုယ်ခံအားနှိမ်နင်းရေးအကျိုးသက်ရောက်မှုကို BH4 (5) ကို ထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် ကယ်တင်နိုင်သည်။ isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma တွင်၊ enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ထုတ်လွှတ်မှုသည် T ဆဲလ်လှုပ်ရှားမှု၊ မျိုးပွားခြင်းနှင့် cytolysis လှုပ်ရှားမှုကို ဟန့်တားသည် (6)။ မကြာသေးမီက၊ glycolysis ၏ ဘေးထွက်ပစ္စည်းဖြစ်သော methylglyoxal ကို myeloid မူလအစရှိသော suppressor ဆဲလ်များမှ ထုတ်လုပ်ပြီး methylglyoxal ၏ T ဆဲလ်လွှဲပြောင်းမှုသည် effector T ဆဲလ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ကုသမှုတွင်၊ methylglyoxal ၏ ကြားနေခြင်းသည် myeloid-derived suppressor cells (MDSC) ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ကျော်လွှားနိုင်ပြီး mouse မော်ဒယ်များတွင် checkpoint blockade ကုထုံးကို synergistically မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည် (7)။ ဤလေ့လာမှုများသည် T ဆဲလ်လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိရာတွင် TME-derived metabolites များ၏ အဓိကအခန်းကဏ္ဍကို အတူတကွ အလေးပေးဖော်ပြသည်။
T ဆဲလ် လုပ်ဆောင်ချက် ချို့ယွင်းမှုကို သားဥအိမ်ကင်ဆာတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ဖော်ပြထားပါသည် (8)။ ၎င်းသည် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် hypoxia နှင့် ပုံမှန်မဟုတ်သော အကျိတ်သွေးကြောများ (9) တွင် မွေးရာပါ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများကြောင့်ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် ဂလူးကို့စ်နှင့် ထရစ်ပတိုဖန်ကို လက်တစ်အက်ဆစ်နှင့် kynurenine ကဲ့သို့သော ဘေးထွက်ပစ္စည်းများအဖြစ် ပြောင်းလဲခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ ဆဲလ်ပြင်ပ လက်တိတ် အလွန်အကျွံ သုံးစွဲခြင်းသည် interferon-γ (IFN-γ) ထုတ်လုပ်မှုကို လျော့နည်းစေပြီး myelosuppressive မျိုးကွဲအုပ်စုများ ကွဲပြားမှုကို မောင်းနှင်သည် (10၊ 11)။ ထရစ်ပတိုဖန် သုံးစွဲမှုသည် T ဆဲလ်ပွားများမှုကို တိုက်ရိုက် ဟန့်တားပြီး T ဆဲလ် receptor အချက်ပြမှုကို ဟန့်တားသည် (12-14)။ ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်များ ရှိနေသော်လည်း၊ ကိုယ်ခံအား ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အလုပ်များစွာကို အကောင်းဆုံး မီဒီယာကို အသုံးပြု၍ in vitro T ဆဲလ် မွေးမြူရေးတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည် သို့မဟုတ် in vivo တွင် homologous mouse မော်ဒယ်များတွင်သာ ကန့်သတ်ထားပြီး၊ ၎င်းတို့နှစ်ခုစလုံးသည် လူသားကင်ဆာများ၏ မတူကွဲပြားမှုနှင့် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ မက်ခရိုနှင့် မိုက်ခရိုပတ်ဝန်းကျင်ကို အပြည့်အဝ ထင်ဟပ်မထားပါ။
သားဥအိမ်ကင်ဆာ၏ အဖြစ်များသော လက္ခဏာတစ်ခုမှာ ဝမ်းဗိုက်အတွင်း ပျံ့နှံ့ခြင်းနှင့် ရေဖျဉ်းကျခြင်း ပေါ်လာခြင်းဖြစ်သည်။ ရေဖျဉ်းကျခြင်းတွင် ဆဲလ်အရည်များ စုပုံလာခြင်းသည် အဆင့်မြင့်ရောဂါနှင့် ရောဂါခန့်မှန်းချက် ညံ့ဖျင်းခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည် (15)။ အစီရင်ခံစာများအရ ဤထူးခြားသော အခန်းသည် အောက်ဆီဂျင်နည်းပါးပြီး vascular endothelial growth factor (VEGF) နှင့် indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) အဆင့်မြင့်မားပြီး T regulatory cell များနှင့် myeloid inhibitory cell များ (15-18) မှ စိမ့်ဝင်သည်။ ရေဖျဉ်းကျခြင်း၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပတ်ဝန်းကျင်သည် အကျိတ်ကိုယ်တိုင်နှင့် ကွဲပြားနိုင်သောကြောင့် ဝမ်းဗိုက်အတွင်း T ဆဲလ်များ၏ ပြန်လည်ပရိုဂရမ်းမင်းသည် မရှင်းလင်းပါ။ ထို့အပြင်၊ အကျိတ်ပတ်ဝန်းကျင်တွင်ရှိသော ရေဖျဉ်းကျခြင်းနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်များအကြား အဓိကကွာခြားချက်များနှင့် မတူကွဲပြားမှုသည် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များ စိမ့်ဝင်မှုနှင့် အကျိတ်များတွင် ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်ချက်ကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေနိုင်ပြီး နောက်ထပ်သုတေသနပြုလုပ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။
ဤပြဿနာများကို ဖြေရှင်းရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အာရုံခံဆဲလ်ခွဲခြင်းနှင့် အရည်ခရိုမာတိုဂရပ်ဖီ tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) နည်းလမ်းကို ဒီဇိုင်းထုတ်ခဲ့ပြီး မတူညီသောဆဲလ်အမျိုးအစားများ (CD4 + နှင့် CD8 + T ဆဲလ်များအပါအဝင်) အပြင် အကျိတ်များအတွင်းနှင့် အကျိတ်များအကြားကို လေ့လာခဲ့သည်။ ၎င်း၏ဇီဝဖြစ်စဉ်များသည် လူနာ၏ တူညီသော ရေဝပ်နှင့် အကျိတ်ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ ဆဲလ်များကို လွှမ်းခြုံထားသည်။ ဤအဓိကလူဦးရေများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်အခြေအနေ၏ အလွန်ရှင်းလင်းသောပုံတူကို ပေးစွမ်းရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤနည်းလမ်းကို high-dimensional flow cytometry နှင့် single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) တို့နှင့် တွဲဖက်အသုံးပြုပါသည်။ ဤနည်းလမ်းသည် အကျိတ် T ဆဲလ်များတွင် 1-methylnicotinamide (MNA) အဆင့်တွင် သိသိသာသာတိုးလာမှုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး in vitro စမ်းသပ်ချက်များအရ T ဆဲလ်လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ် MNA ၏ ကိုယ်ခံအားစနစ်ကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲနိုင်သော အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ယခင်က မသိရှိခဲ့ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ဤနည်းလမ်းသည် အကျိတ်များနှင့် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များအကြား အပြန်အလှန်ဇီဝဖြစ်စဉ် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို ဖော်ထုတ်ပေးပြီး T ဆဲလ်အခြေခံ သားဥအိမ်ကင်ဆာ ကိုယ်ခံအားကုထုံးကုသမှုအတွက် အသုံးဝင်နိုင်သည့် ကိုယ်ခံအားထိန်းညှိဇီဝဖြစ်စဉ်များအကြောင်း ထူးခြားသောထိုးထွင်းသိမြင်မှုများကို ပေးစွမ်းသည်။ ကုသမှုအခွင့်အလမ်းများ။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အတွက် high-dimensional flow cytometry ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည် [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယ လှုပ်ရှားမှု [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) တို့သည် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များနှင့် အကျိတ်ဆဲလ်လူဦးရေကို ခွဲခြားသတ်မှတ်သည့် ပုံမှန်အမှတ်အသားများဖြစ်သည် (ဇယား S2 နှင့် ပုံ S1A)။ ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ T ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ရေဝပ်ခြင်းနှင့် အကျိတ်ဆဲလ်များသည် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုအဆင့် ပိုမိုမြင့်မားသော်လည်း မိုက်တိုခွန်ဒရီယ လှုပ်ရှားမှုတွင် ကွာခြားချက်နည်းပါးကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ အကျိတ်ဆဲလ်များ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ၏ ပျမ်းမျှ ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုသည် T ဆဲလ်များထက် သုံးဆမှ လေးဆအထိရှိပြီး CD4 + T ဆဲလ်များ၏ ပျမ်းမျှ ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုသည် CD8 + T ဆဲလ်များထက် ၁.၂ ဆဖြစ်ပြီး ၎င်းသည် Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) တွင် တူညီသော TME တွင်ပင် ဇီဝဖြစ်စဉ်လိုအပ်ချက်များ မတူညီကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ 1A)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနဲ့၊ အကျိတ်ဆဲလ်တွေမှာ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ဟာ CD4 + T ဆဲလ်တွေနဲ့ ဆင်တူပြီး ဆဲလ်အမျိုးအစားနှစ်ခုလုံးရဲ့ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ဟာ CD8 + T ဆဲလ်တွေထက် ပိုမိုမြင့်မားပါတယ် (ပုံ 1B)။ ယေဘုယျအားဖြင့် ဒီရလဒ်တွေက ဇီဝဖြစ်စဉ်အဆင့်ကို ဖော်ပြပါတယ်။ အကျိတ်ဆဲလ်တွေရဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်လှုပ်ရှားမှုဟာ CD4 + T ဆဲလ်တွေထက် ပိုမိုမြင့်မားပြီး CD4 + T ဆဲလ်တွေရဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်လှုပ်ရှားမှုဟာ CD8 + T ဆဲလ်တွေထက် ပိုမိုမြင့်မားပါတယ်။ ဆဲလ်အမျိုးအစားအားလုံးမှာ ဒီအကျိုးသက်ရောက်မှုတွေရှိနေပေမယ့်၊ CD4 + နဲ့ CD8 + T ဆဲလ်တွေရဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်အခြေအနေ ဒါမှမဟုတ် အကျိတ်တွေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် ရေဖျဉ်းရောဂါမှာ သူတို့ရဲ့ ဆွေမျိုးအချိုးအစားတွေမှာ တသမတ်တည်း ကွာခြားချက်မရှိပါဘူး (ပုံ 1C)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနဲ့၊ CD45 ဆဲလ်အပိုင်းမှာ၊ အကျိတ်ထဲက EpCAM+ ဆဲလ်တွေရဲ့ အချိုးအစားဟာ ရေဖျဉ်းရောဂါနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် တိုးလာပါတယ် (ပုံ 1D)။ EpCAM+ နဲ့ EpCAM- ဆဲလ်အစိတ်အပိုင်းတွေကြားက ရှင်းလင်းတဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်ကွာခြားချက်ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ EpCAM+ (အကျိတ်) ဆဲလ်တွေမှာ EpCAM- ဆဲလ်တွေထက် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုနဲ့ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက် ပိုမိုမြင့်မားပြီး TME မှာ အကျိတ်ဆဲလ်တွေမှာ ဖိုင်ဘရိုဘလတ်စ်တွေရဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်လှုပ်ရှားမှုထက် များစွာပိုမိုမြင့်မားပါတယ် (ပုံ 1၊ E နဲ့ F)။
(A နှင့် B) ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှု (2-NBDG) ၏ အလယ်အလတ် fluorescence intensity (MFI) (A) နှင့် CD4 + T ဆဲလ်များ (MitoTracker အနီရင့်ရောင်) ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယ activity (B) ကိုယ်စားပြုဂရပ်များ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဇယားကွက်ဒေတာ (ညာဘက်)၊ CD8 + T ဆဲလ်များနှင့် EpCAM + CD45-tumor ဆဲလ်များ။ (C) ဝမ်းဗိုက်အတွင်းအရည်ကြည်နှင့် အကျိတ်တွင် CD4 + နှင့် CD8 + ဆဲလ်များ (CD3 + T ဆဲလ်များ၏) အချိုး။ (D) ဝမ်းဗိုက်အတွင်းအရည်ကြည်နှင့် အကျိတ်တွင် EpCAM + အကျိတ်ဆဲလ်များ၏ အချိုး (CD45−)။ (E နှင့် F) EpCAM + CD45-အကျိတ်နှင့် EpCAM-CD45-matrix ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှု (2-NBDG) (E) နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယ activity (MitoTracker အနီရင့်ရောင်) (F) ကိုယ်စားပြုဂရပ်များ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဇယားကွက်ဒေတာ (ညာဘက်) ဝမ်းဗိုက်အတွင်းအရည်ကြည်နှင့် အကျိတ်ဆဲလ်များ။ (G) flow cytometry ဖြင့် CD25၊ CD137 နှင့် PD1 ဖော်ပြမှု၏ ကိုယ်စားပြုဂရပ်များ။ (H နှင့် I) CD4 + T ဆဲလ်များ (H) နှင့် CD8 + T ဆဲလ်များ (I) ပေါ်တွင် CD25၊ CD137 နှင့် PD1 ဖော်ပြမှု။ (J နှင့် K) CCR7 နှင့် CD45RO ၏ ဖော်ပြမှုအပေါ် အခြေခံထားသော Naive၊ central memory (Tcm)၊ effector (Teff) နှင့် effector memory (Tem) phenotypes။ ascites နှင့် tumors များတွင် CD4 + T ဆဲလ်များ (J) နှင့် CD8 + T ဆဲလ်များ (K) ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဇယားဒေတာ (ညာဘက်)။ paired t-test (*P<0.05၊ **P<0.01 နှင့် ***P<0.001) မှ ဆုံးဖြတ်ထားသော P တန်ဖိုးများ။ မျဉ်းသည် ကိုက်ညီသော လူနာများကို ကိုယ်စားပြုသည် (n = 6)။ FMO၊ fluorescence အနုတ်တစ်၊ MFI၊ median fluorescence intensity။
နောက်ထပ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ အလွန်အမင်း ဖြေရှင်းနိုင်သော T ဆဲလ် phenotype အခြေအနေအကြား အခြားသိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားချက်များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ အကျိတ်များတွင် activated (ပုံ 1၊ G မှ I) နှင့် effector memory (ပုံ 1၊ J နှင့် K) များသည် ascites (CD3 + T ဆဲလ်များ၏ အချိုးအစား) ထက် များစွာပိုမိုအဖြစ်များသည်။ အလားတူပင်၊ activation markers (CD25 နှင့် CD137) နှင့် depletion markers [programmed cell death protein 1 (PD1)] ၏ ဖော်ပြမှုဖြင့် phenotype ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့် ဤလူဦးရေ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများ မတူညီသော်လည်း (ပုံ S1၊ B မှ E)၊ naive၊ effector သို့မဟုတ် memory subsets များအကြား သိသာထင်ရှားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ကွဲပြားမှုများကို တသမတ်တည်း မတွေ့ရှိရကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ S1၊ F မှ I)။ ဤရလဒ်များကို စက်သင်ယူမှုနည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ် phenotypes များကို အလိုအလျောက် သတ်မှတ်ရန် အတည်ပြုခဲ့သည် (21)၊ ၎င်းသည် လူနာ၏ ascites တွင် အရိုးတွင်းခြင်ဆီဆဲလ် အများအပြား (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ရှိနေခြင်းကို ထပ်မံဖော်ပြခဲ့သည် (ပုံ S2A)။ ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိထားသော ဆဲလ်အမျိုးအစားအားလုံးထဲတွင် ဤမိုင်လွိုက်ဆဲလ်လူဦးရေသည် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်လှုပ်ရှားမှု အမြင့်ဆုံးကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ S2၊ B မှ G)။ ဤရလဒ်များသည် HGSC လူနာများတွင် ရေဖျဉ်းရောဂါနှင့် အကျိတ်များတွင် တွေ့ရှိရသော ဆဲလ်အမျိုးအစားများစွာကြား ပြင်းထန်သော ဇီဝဖြစ်စဉ်ကွာခြားချက်များကို မီးမောင်းထိုးပြနေပါသည်။
TIL ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများကို နားလည်ရန် အဓိကစိန်ခေါ်မှုမှာ လုံလောက်သော သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှု၊ အရည်အသွေးနှင့် အရေအတွက်ရှိသော T ဆဲလ်နမူနာများကို အကျိတ်များမှ ခွဲထုတ်ရန် လိုအပ်ခြင်းဖြစ်သည်။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ flow cytometry ကို အခြေခံ၍ sorting နှင့် bead enrichment နည်းလမ်းများသည် ဆဲလ် metabolite profiles များတွင် ပြောင်းလဲမှုများ ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည် (၂၂-၂၄)။ ဤပြဿနာကို ကျော်လွှားရန်အတွက်၊ LC-MS/MS ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းမပြုမီ ခွဲစိတ်ဖြတ်တောက်ထားသော လူသားသားဥအိမ်ကင်ဆာမှ TIL ကို ခွဲထုတ်ပြီး ခွဲထုတ်ရန် bead enrichment နည်းလမ်းကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် (ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများကိုကြည့်ပါ၊ ပုံ ၂က)။ metabolite ပြောင်းလဲမှုများအပေါ် ဤပရိုတိုကော၏ အလုံးစုံသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက်၊ အထက်ဖော်ပြပါ bead ခွဲထုတ်ခြင်းအဆင့်ပြီးနောက် ကျန်းမာသောအလှူရှင်များမှ အသက်ဝင်စေသော T ဆဲလ်များ၏ metabolite profiles များကို bead ခွဲထုတ်ခြင်းမဟုတ်ဘဲ ရေခဲပေါ်တွင် ကျန်ရှိနေသော ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါသည်။ ဤအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ဤအခြေအနေနှစ်ခုကြားတွင် မြင့်မားသော correlation ရှိကြောင်း (r = 0.77) နှင့် metabolites ၈၆ မျိုးအုပ်စု၏ နည်းပညာဆိုင်ရာ repeatability သည် repeatability မြင့်မားကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၂ခ)။ ထို့ကြောင့် ဤနည်းလမ်းများသည် ဆဲလ်အမျိုးအစား ကြွယ်ဝမှုဖြစ်စဉ်ကို ဖြတ်သန်းနေသော ဆဲလ်များတွင် တိကျသော ဇီဝဖြစ်စဉ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး၊ HGSC တွင် သီးခြား ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် ပထမဆုံးသော မြင့်မားသော resolution ပလက်ဖောင်းကို ပံ့ပိုးပေးပြီး လူများအား ဆဲလ်တိကျမှု လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဇီဝဖြစ်စဉ် ပရိုဂရမ်ကို ပိုမိုနက်ရှိုင်းစွာ နားလည်နိုင်စေပါသည်။
(က) သံလိုက်ပုတီးစေ့ ကြွယ်ဝမှု၏ ပုံကြမ်းပုံ။ LC-MS/MS ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ၊ ဆဲလ်များသည် သံလိုက်ပုတီးစေ့ ကြွယ်ဝမှု သုံးကြိမ်ဆက်တိုက် ကြုံတွေ့ရမည် သို့မဟုတ် ရေခဲပေါ်တွင် ရှိနေမည်ဖြစ်သည်။ (ခ) ဇီဝဖြစ်စဉ် ပေါများမှုအပေါ် ကြွယ်ဝမှုအမျိုးအစား၏ အကျိုးသက်ရောက်မှု။ ကြွယ်ဝမှုအမျိုးအစားတစ်ခုစီအတွက် တိုင်းတာမှု သုံးကြိမ်၏ ပျမ်းမျှ ± SE။ မီးခိုးရောင်မျဉ်းသည် 1:1 ဆက်နွယ်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ဝင်ရိုးတံဆိပ်တွင် ပြသထားသော ထပ်ခါတလဲလဲ တိုင်းတာမှုများ၏ အတန်းတွင်း ဆက်စပ်မှု (ICC)။ NAD၊ nicotinamide adenine dinucleotide။ (ဂ) လူနာဇီဝဖြစ်စဉ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ လုပ်ငန်းစဉ်၏ ပုံကြမ်းပုံ။ ဝမ်းဗိုက်ရေဝပ် သို့မဟုတ် အကျိတ်များကို လူနာများထံမှ စုဆောင်းပြီး အေးခဲအောင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ နမူနာတစ်ခုစီ၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်ကို flow cytometry ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး ကျန်နမူနာများကို CD4+၊ CD8+ နှင့် CD45- ဆဲလ်များအတွက် ကြွယ်ဝမှု သုံးကြိမ် ခံယူခဲ့သည်။ ဤဆဲလ်အပိုင်းအစများကို LC-MS/MS ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ (ဃ) စံသတ်မှတ်ထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ် ပေါများမှု၏ အပူမြေပုံ။ dendrogram သည် နမူနာများအကြား Euclidean အကွာအဝေး၏ Ward ၏ clustering ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (င) နမူနာဇီဝဖြစ်စဉ်မြေပုံ၏ အဓိကအစိတ်အပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (PCA)၊ နမူနာတစ်ခုစီ၏ ပုံတူသုံးခုကိုပြသထားပြီး၊ တူညီသောလူနာထံမှ နမူနာများကို မျဉ်းတစ်ကြောင်းဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ (စ) လူနာပေါ်တွင် အခြေအနေသတ်မှတ်ထားသော နမူနာ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပရိုဖိုင်၏ PCA (ဆိုလိုသည်မှာ၊ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းထပ်တူကျမှုကို အသုံးပြုခြင်း)၊ နမူနာအမျိုးအစားကို ခုံးအခွံဖြင့် ကန့်သတ်ထားသည်။ PC1၊ အဓိကအစိတ်အပိုင်း 1; PC2၊ အဓိကအစိတ်အပိုင်း 2။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤကြွယ်ဝမှုနည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ HGSC လူနာခြောက်ဦး၏ မူလ ascites နှင့် အကျိတ်များရှိ CD4 +၊ CD8 + နှင့် CD45-ဆဲလ်အပိုင်းအစများရှိ metabolites ၉၉ ခုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (ပုံ 2C၊ ပုံ S3A နှင့် ဇယား S3 နှင့် S4)။ စိတ်ဝင်စားသောလူဦးရေသည် မူလကြီးမားသောသက်ရှိဆဲလ်နမူနာ၏ ၂% မှ ၇၀% အထိရှိပြီး ဆဲလ်အချိုးအစားသည် လူနာများအကြား အလွန်ကွဲပြားသည်။ beads များကို ခွဲထုတ်ပြီးနောက်၊ စိတ်ဝင်စားသောကြွယ်ဝသောအပိုင်းအစ (CD4+၊ CD8+ သို့မဟုတ် CD45-) သည် ပျမ်းမျှအားဖြင့် နမူနာရှိ သက်ရှိဆဲလ်အားလုံး၏ ၈၅% ကျော်ရှိသည်။ ဤကြွယ်ဝမှုနည်းလမ်းသည် လူ့အကျိတ်တစ်ရှူးဇီဝဖြစ်စဉ်မှ ဆဲလ်လူဦးရေကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်စေပြီး၊ နမူနာကြီးများမှ လုပ်ဆောင်ရန်မဖြစ်နိုင်ပါ။ ဤပရိုတိုကောကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ ဤကောင်းစွာလက္ခဏာရပ်ပြထားသော ကိုယ်ခံအားနှိမ်နင်းသည့်ဇီဝဖြစ်စဉ်နှစ်ခုဖြစ်သည့် l-kynurenine နှင့် adenosine တို့သည် အကျိတ် T ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် အကျိတ်ဆဲလ်များတွင် မြင့်မားနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (ပုံ S3၊ B နှင့် C)။ ထို့ကြောင့်၊ ဤရလဒ်များသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ ဆဲလ်ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် mass spectrometry နည်းပညာ၏ လူနာတစ်ရှူးများတွင် ဇီဝဗေဒအရအရေးကြီးသောဇီဝဖြစ်စဉ်များကို ရှာဖွေနိုင်စွမ်းကို ပြသသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် လူနာများအတွင်းနှင့် လူနာများအကြား ဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ပြင်းထန်သော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ခွဲခြားမှုကိုလည်း ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 2D နှင့် ပုံ S4A)။ အထူးသဖြင့် အခြားလူနာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လူနာ 70 တွင် ကွဲပြားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 2E နှင့် ပုံ S4B)၊ ၎င်းသည် လူနာများအကြား သိသာထင်ရှားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ မတူကွဲပြားမှု ရှိနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ အခြားလူနာများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက (1.2 မှ 2 လီတာ၊ ဇယား S1)၊ လူနာ 70 တွင် စုဆောင်းရရှိသော ရေဝပ်ပမာဏ စုစုပေါင်း (80 ml) မှာ နည်းပါးကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ အဓိက အစိတ်အပိုင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွင်း လူနာအချင်းချင်း မတူကွဲပြားမှုကို ထိန်းချုပ်ခြင်း (ဥပမာ၊ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ထပ်တူကျသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြုခြင်း) သည် ဆဲလ်အမျိုးအစားများအကြား တသမတ်တည်း ပြောင်းလဲမှုများကို ပြသပြီး ဆဲလ်အမျိုးအစားများနှင့်/သို့မဟုတ် အဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင်ကို ဇီဝဖြစ်စဉ်ပရိုဖိုင်အရ ရှင်းရှင်းလင်းလင်း စုစည်းထားသည် (ပုံ 2F)။ တစ်ခုတည်းသော ဇီဝဖြစ်စဉ်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အလေးပေးဖော်ပြခဲ့ပြီး ဆဲလ်အမျိုးအစားများနှင့် အဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင်အကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ တွေ့ရှိရသည့် အပြင်းထန်ဆုံး ကွာခြားချက်မှာ CD45- ဆဲလ်များနှင့် အကျိတ်ထဲသို့ စိမ့်ဝင်သော CD4+ နှင့် CD8+ ဆဲလ်များတွင် များသောအားဖြင့် ကြွယ်ဝသော MNA ဖြစ်သည်ကို သတိပြုသင့်သည် (ပုံ 3A)။ CD4 + ဆဲလ်များအတွက် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုသည် အထင်ရှားဆုံးဖြစ်ပြီး CD8 + ဆဲလ်များရှိ MNA သည်လည်း ပတ်ဝန်းကျင်၏ သက်ရောက်မှုကို ပြင်းထန်စွာ ခံရပုံရသည်။ သို့သော် ၎င်းသည် အရေးမကြီးပါ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် လူနာခြောက်ဦးတွင် သုံးဦးကိုသာ အကျိတ် CD8+ ရမှတ်များအတွက် အကဲဖြတ်နိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ MNA အပြင်၊ ရေဝပ်ခြင်းနှင့် အကျိတ်များရှိ ဆဲလ်အမျိုးအစားအမျိုးမျိုးတွင် TIL တွင် လက္ခဏာမပြသော အခြားဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများသည်လည်း ကွဲပြားစွာ ကြွယ်ဝသည် (ပုံ S3 နှင့် S4)။ ထို့ကြောင့် ဤဒေတာသည် နောက်ထပ်သုတေသနအတွက် အလားအလာကောင်းသော ကိုယ်ခံအားစနစ်ကို ထိန်းညှိပေးသည့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများ အစုံအလင်ကို ဖော်ပြသည်။
(က) ရေဝပ်ခြင်းနှင့် အကျိတ်မှ CD4+၊ CD8+ နှင့် CD45- ဆဲလ်များတွင် MNA ၏ ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသော ပါဝင်မှု။ box plot သည် interquartile range (frame whisker) ထက် 1.5 ဆအထိ median (line)၊ interquartile range (frame hinge) နှင့် data range ကို ပြသထားသည်။ Patient Materials and Methods တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ P တန်ဖိုး (*P<0.05 နှင့် **P<0.01) ကိုဆုံးဖြတ်ရန် လူနာ၏ limma တန်ဖိုးကို အသုံးပြုပါ။ (ခ) MNA ဇီဝဖြစ်စဉ်၏ ပုံကြမ်းပုံ (60)။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများ- S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide။ အင်ဇိုင်းများ (အစိမ်းရောင်): NNMT၊ nicotinamide N-methyltransferase; SIRT၊ sirtuins; NAMPT၊ nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1၊ aldehyde oxidase 1; NRK၊ nicotinamide riboside kinase; NMNAT၊ nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1၊ purine nucleoside phosphorylase။ (C) ရေဝပ်ရောဂါ (မီးခိုးရောင်) နှင့် အကျိတ်၏ scRNA-seq ၏ t-SNE (အနီရောင်၊ လူနာ n = 3)။ (D) scRNA-seq ကို အသုံးပြု၍ ဖော်ထုတ်ထားသော မတူညီသော ဆဲလ်လူဦးရေတွင် NNMT ဖော်ပြမှု။ (E) SK-OV-3၊ လူ့သန္ဓေသားကျောက်ကပ် (HEK) 293T၊ T ဆဲလ်များနှင့် MNA-treated T ဆဲလ်များတွင် NNMT နှင့် AOX1 ၏ ဖော်ပြမှု။ ခေါက်ထားသော ဖော်ပြမှုကို SK-OV-3 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ ပြသထားသည်။ SEM ပါသော ဖော်ပြမှုပုံစံကို ပြသထားသည် (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် 6 ဦး)။ ၃၅ ထက်ကြီးသော Ct တန်ဖိုးများကို မတွေ့ရှိနိုင်ဟု ယူဆသည် (UD)။ (F) SK-OV-3၊ HEK293T၊ T ဆဲလ်များနှင့် 8mM MNA ဖြင့် ကုသထားသော T ဆဲလ်များတွင် SLC22A1 နှင့် SLC22A2 ၏ ဖော်ပြမှု။ ခေါက်ထားသော ဖော်ပြမှုကို SK-OV-3 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြထားသည်။ SEM ပါရှိသော ဖော်ပြမှုပုံစံကို ပြသထားသည် (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် ၆ ဦး)။ ၃၅ ထက်ကြီးသော Ct တန်ဖိုးများကို မတွေ့ရှိနိုင်ဟု ယူဆသည် (UD)။ (G) MNA ဖြင့် ပေါင်းစပ်ပြီး ၇၂ နာရီအကြာတွင် အသက်ဝင်သော ကျန်းမာသော အလှူရှင် T ဆဲလ်များတွင် ဆဲလ် MNA ပါဝင်မှု။ SEM ပါရှိသော ဖော်ပြမှုပုံစံကို ပြသထားသည် (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် ၄ ဦး)။
MNA ကို nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; ပုံ 3B) မှတစ်ဆင့် S-adenosyl-1-methionine (SAM) မှ နီကိုတီနမိုက် (NA) သို့ မီသိုင်းအုပ်စုကို လွှဲပြောင်းခြင်းဖြင့် ထုတ်လုပ်သည်။ NNMT သည် လူသားကင်ဆာအမျိုးမျိုးတွင် အလွန်အကျွံဖော်ပြခံရပြီး မျိုးပွားခြင်း၊ ကျူးကျော်ခြင်းနှင့် metastasis တို့နှင့် ဆက်စပ်နေသည် (25-27)။ TME ရှိ T ဆဲလ်များရှိ MNA ၏ရင်းမြစ်ကို ပိုမိုနားလည်ရန်အတွက်၊ HGSC လူနာသုံးဦး၏ ascites နှင့် အကျိတ်များရှိ ဆဲလ်အမျိုးအစားများတစ်လျှောက် NNMT ၏ဖော်ပြမှုကို သွင်ပြင်လက္ခဏာဖော်ပြရန် scRNA-seq ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (ဇယား S5)။ ဆဲလ် ၆၅၀၀ ခန့်ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချက်အရ ascites နှင့် tumor ပတ်ဝန်းကျင်များတွင် NNMT ဖော်ပြမှုကို ယူဆရသော fibroblast နှင့် tumor cell လူဦးရေများသို့သာ ကန့်သတ်ထားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3၊ C နှင့် D)။ PTPRC (CD45 +) ကို ဖော်ပြသော မည်သည့်လူဦးရေတွင်မဆို ထင်ရှားသော NNMT ဖော်ပြမှုမရှိပါ (ပုံ 3D နှင့် ပုံ S5A)၊ ၎င်းသည် metabolite spectrum တွင် တွေ့ရှိရသည့် MNA ကို T ဆဲလ်များထဲသို့ ထည့်သွင်းထားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ aldehyde oxidase 1 (AOX1) ၏ ဖော်ပြမှုသည် MNA ကို 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) သို့မဟုတ် 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲပေးသည်။ ပုံ 3B) သည် COL1A1 ကို ဖော်ပြသော fibroblasts လူဦးရေအတွက်သာ ကန့်သတ်ထားသည် (ပုံ S5A)၊ ၎င်းသည် T ဆဲလ်များတွင် ရိုးရာ MNA ဇီဝြဖစ်ပျက်မှုစွမ်းရည်မရှိကြောင်း အတူတကွ ညွှန်ပြသည်။ ဤ MNA နှင့် ဆက်စပ်သော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုပုံစံကို HGSC လူနာများမှ ascites မှ ဒုတိယလွတ်လပ်သော ဆဲလ်ဒေတာအစုံကို အသုံးပြု၍ အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ S5B; n = 6) (16)။ ထို့အပြင်၊ MNA ဖြင့် ကုသထားသော ကျန်းမာသော donor T ဆဲလ်များ၏ quantitative polymerase chain reaction (qPCR) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ထိန်းချုပ်မှု SK-OV-3 သားဥအိမ်အကျိတ်ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက NNMT သို့မဟုတ် AOX1 သည် ဖော်ပြခြင်း မရှိသလောက်ဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3E)။ ဤမမျှော်လင့်ထားသော ရလဒ်များက MNA ကို fibroblasts သို့မဟုတ် အကျိတ်များမှ TME ရှိ အနီးနားရှိ T ဆဲလ်များထဲသို့ ထုတ်လွှတ်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
ကိုယ်စားလှယ်လောင်းများတွင် soluble carrier 22 (SLC22) မိသားစု (SLC22A1, SLC22A2 နှင့် SLC22A3) မှ encode လုပ်ထားသော organic cation transporters 1 မှ 3 (OCT1, OCT2 နှင့် OCT3) မိသားစု ပါဝင်သော်လည်း၊ MNA ၏ အလားအလာရှိသော transporters များကို မသတ်မှတ်ရသေးပါ (28)။ ကျန်းမာသော donor T ဆဲလ်များမှ mRNA ၏ QPCR သည် SLC22A1 ၏ expression အဆင့်နိမ့်သော်လည်း SLC22A2 ၏ အဆင့်များကို မတွေ့ရှိနိုင်ဘဲ၊ ၎င်းသည် ယခင်က စာပေများတွင် ဖော်ပြခဲ့ကြောင်း အတည်ပြုသည် (ပုံ 3F) (29)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့် SK-OV-3 ovarian tumor cell line သည် transporters နှစ်ခုလုံး၏ မြင့်မားသောအဆင့်များကို ဖော်ပြခဲ့သည် (ပုံ 3F)။
ပြင်ပ MNA ကို စုပ်ယူနိုင်စွမ်းရှိတဲ့ T ဆဲလ်တွေရှိမရှိ စမ်းသပ်ဖို့အတွက် ကျန်းမာတဲ့ donor T ဆဲလ်တွေကို MNA ပါဝင်မှု အမျိုးမျိုးရှိတဲ့နေရာမှာ ၇၂ နာရီကြာ မွေးမြူခဲ့ပါတယ်။ exogenous MNA မရှိတဲ့အခါ MNA ရဲ့ ဆဲလ်ပါဝင်မှုကို မတွေ့ရှိနိုင်ပါဘူး (ပုံ 3G)။ ဒါပေမယ့် exogenous MNA နဲ့ ကုသထားတဲ့ activated T ဆဲလ်တွေဟာ ဆဲလ်တွေထဲမှာ MNA ပါဝင်မှု ပမာဏပေါ်မူတည်ပြီး 6 mM MNA အထိ တိုးလာတာကို ပြသခဲ့ပါတယ် (ပုံ 3G)။ ဒီရလဒ်က transporter expression အဆင့်နိမ့်ပြီး intracellular MNA ဇီဝဖြစ်စဉ်အတွက် တာဝန်ရှိတဲ့ အဓိကအင်ဇိုင်းမရှိပေမယ့် TIL ကတော့ MNA ကို စုပ်ယူနိုင်သေးတယ်ဆိုတာ ညွှန်ပြနေပါတယ်။
လူနာများ၏ T ဆဲလ်များနှင့် in vitro MNA စုပ်ယူမှုစမ်းသပ်မှုများတွင် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများ၏ ရောင်စဉ်တန်းသည် ကင်ဆာနှင့်ဆက်စပ်နေသော fibroblasts (CAF) များသည် MNA ကိုထုတ်လွှတ်ပြီး အကျိတ်ဆဲလ်များသည် TIL ၏ phenotype နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိပေးနိုင်ခြင်းဖြစ်နိုင်ခြေကို တိုးစေသည်။ T ဆဲလ်များအပေါ် MNA ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် ကျန်းမာသော donor T ဆဲလ်များကို MNA ရှိနေခြင်း သို့မဟုတ် မရှိခြင်းတွင် in vitro တွင် အသက်ဝင်စေပြီး ၎င်းတို့၏ မျိုးပွားခြင်းနှင့် cytokine ထုတ်လုပ်မှုတို့ကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အမြင့်ဆုံးဆေးပမာဏဖြင့် MNA ထည့်သွင်းပြီး ၇ ရက်အကြာတွင် လူဦးရေနှစ်ဆတိုးလာမှုအရေအတွက်သည် အသင့်အတင့်လျော့ကျသွားပြီး ဆေးပမာဏအားလုံးတွင် တက်ကြွမှုကို ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည် (ပုံ ၄က)။ ထို့အပြင်၊ exogenous MNA ကိုကုသခြင်းသည် tumor necrosis factor-α (TNFα; ပုံ ၄ခ) ကိုဖော်ပြသော CD4 + နှင့် CD8 + T ဆဲလ်များ၏ အချိုးအစားတိုးလာစေခဲ့သည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ IFN-γ ၏ intracellular ထုတ်လုပ်မှုသည် CD4 + T ဆဲလ်များတွင် သိသိသာသာလျော့နည်းသွားသော်လည်း CD8 + T ဆဲလ်များတွင်မူ မလျော့ကျဘဲ interleukin 2 (IL-2; ပုံ ၄၊ C နှင့် D) တွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုမရှိပါ။ ထို့ကြောင့် MNA ကုသထားသော T ဆဲလ်မွေးမြူခြင်းမှ supernatants များ၏ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) သည် TNFα တွင် သိသိသာသာတိုးလာခြင်း၊ IFN-γ တွင် လျော့ကျခြင်းနှင့် IL-2 တွင် ပြောင်းလဲမှုမရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၄၊ E မှ G)။ IFN-γ လျော့ကျခြင်းက MNA သည် T ဆဲလ်များ၏ anti-tumor activity ကို ဟန့်တားရာတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ T ဆဲလ်မှတစ်ဆင့် cytotoxicity ပေါ်တွင် MNA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို တုပရန်အတွက် green fluorescent protein (GFP) -CAR-T) ဆဲလ်များမှ ထိန်းညှိထားသော folate receptor α နှင့် CAR-T (GFP) ကို ပစ်မှတ်ထားသော chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) ဆဲလ်များကို ကျန်းမာသော donor peripheral blood mononuclear cells (PBMC) မှ ထုတ်လုပ်သည်။ CAR-T ဆဲလ်များကို MNA ရှိနေချိန်တွင် ၂၄ နာရီကြာ မွေးမြူပြီးနောက် effector to target ratio 10:1 တွင် folate receptor α ကို ဖော်ပြသော human SK-OV-3 ovarian tumor cells များနှင့် တွဲဖက်မွေးမြူခဲ့သည်။ MNA ကုသမှုသည် FRα-CAR-T ဆဲလ်များ၏ သတ်ဖြတ်ခြင်းလုပ်ဆောင်ချက်ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် adenosine ဖြင့် ကုသထားသော FRα-CAR-T ဆဲလ်များနှင့် ဆင်တူပါသည် (ပုံ 4H)။
(က) ၇ ရက်မြောက်နေ့တွင် မွေးမြူခြင်းမှ တိုက်ရိုက်ရရှိသော အသက်ရှင်နိုင်သော ဆဲလ်အရေအတွက်နှင့် လူဦးရေ နှစ်ဆတိုးလာခြင်း (PD)။ ဘားဂရပ်သည် ကျန်းမာသော အလှူရှင်ခြောက်ဦး၏ ပျမ်းမျှ + SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ အနည်းဆုံး n = လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ၃ ခုမှ အချက်အလက်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (ခ မှ ဃ) CD3/CD28 နှင့် IL-2 တို့ကို ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ MNA အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် ၇ ရက်ကြာ T ဆဲလ်များကို အသက်ဝင်စေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ၊ ဆဲလ်များကို GolgiStop ပါသော PMA/ionomycin ဖြင့် ၄ နာရီကြာ လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ T ဆဲလ်များတွင် TNFα (ခ) ဖော်ပြမှု။ အသက်ရှင်သော ဆဲလ်များတွင် TNFα ဖော်ပြမှု၏ ဥပမာပုံ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဇယားအချက်အလက် (ညာဘက်)။ T ဆဲလ်များတွင် IFN-γ (C) နှင့် IL-2 (ဃ) ဖော်ပြမှု။ cytokines များ၏ ဖော်ပြမှုကို flow cytometry ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ ဘားဂရပ်သည် ပျမ်းမျှ (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် ၆ ဦး) + SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ P တန်ဖိုးကို ဆုံးဖြတ်ရန် variance နှင့် ထပ်ခါတလဲလဲ တိုင်းတာမှုများ (*P<0.05 နှင့် **P<0.01) ၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြုပါ။ အနည်းဆုံး n = လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ၃ ခုမှ အချက်အလက်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (E မှ G) CD3/CD28 နှင့် IL-2 တို့ကို T ဆဲလ်များကို ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ MNA အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် ၇ ရက်ကြာ အသက်ဝင်စေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ PMA/ionomycin လှုံ့ဆော်မှု ၄ နာရီမတိုင်မီနှင့် ပြုလုပ်ပြီးနောက်တွင် ထိုအလယ်အလတ်ကို စုဆောင်းခဲ့သည်။ TNFα (E), IFN-γ (F) နှင့် IL-2 (G) တို့၏ အာရုံစူးစိုက်မှုကို ELISA ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ ဘားဂရပ်သည် ပျမ်းမျှ (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် ၅ ဦး) + SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ variance ၏ one-way analysis နှင့် ထပ်ခါတလဲလဲ တိုင်းတာမှုများကို အသုံးပြု၍ P တန်ဖိုးကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (*P<0.05)။ အစက်ချမျဉ်းသည် ရှာဖွေတွေ့ရှိမှု၏ ထောက်လှမ်းမှု ကန့်သတ်ချက်ကို ညွှန်ပြသည်။ (H) ဆဲလ် lysis assay။ FRα-CAR-T သို့မဟုတ် GFP-CAR-T ဆဲလ်များကို adenosine (250μM) သို့မဟုတ် MNA (10 mM) ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ချိန်ညှိခဲ့သည် သို့မဟုတ် ကုသမှုမခံယူဘဲထားခဲ့သည် (Ctrl)။ SK-OV-3 ဆဲလ်များ၏ ရာခိုင်နှုန်း သတ်ဖြတ်မှုကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ P တန်ဖိုးကို Welch t စမ်းသပ်မှု (*P<0.5 နှင့် **P<0.01) ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
MNA-မှီခိုသော TNFα ဖော်ပြမှု စည်းမျဉ်း၏ ယန္တရားဆိုင်ရာ နားလည်မှုရရှိရန်အတွက်၊ MNA ကုသထားသော T ဆဲလ်များ၏ TNFα mRNA ပြောင်းလဲမှုများကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည် (ပုံ 5A)။ MNA ဖြင့် ကုသထားသော ကျန်းမာသော donor T ဆဲလ်များသည် TNFα ကူးယူမှုအဆင့်တွင် နှစ်ဆတိုးလာမှုကို ပြသခဲ့ပြီး MNA သည် TNFα ကူးယူမှု စည်းမျဉ်းပေါ်တွင် မှီခိုနေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဤဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော စည်းမျဉ်းယန္တရားကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ TNFα ကို ထိန်းညှိပေးသော လူသိများသော ကူးယူမှုအချက်နှစ်ခုဖြစ်သည့် activated T cell nuclear factor (NFAT) နှင့် specific protein 1 (Sp1) တို့ကို proximal TNFα promoter (30) နှင့် MNA ချိတ်ဆက်မှုကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ TNFα promoter တွင် NFAT ချိတ်ဆက်သည့်နေရာ ၆ ခုနှင့် Sp1 ချိတ်ဆက်သည့်နေရာ ၂ ခု ပါဝင်ပြီး နေရာတစ်ခုတွင် ထပ်နေသည် [-55 base pairs (bp) from the 5'cap] (30)။ Chromatin immunoprecipitation (ChIP) က MNA ဖြင့် ကုသသောအခါ၊ Sp1 သည် TNFα promoter နှင့် ချိတ်ဆက်မှုသည် သုံးဆတိုးလာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ NFAT ပါဝင်မှုလည်း တိုးလာပြီး အရေးပါမှု နီးကပ်လာသည် (ပုံ 5B)။ ဤဒေတာသည် MNA သည် Sp1 ကူးယူခြင်းမှတစ်ဆင့် TNFα ၏ ဖော်ပြမှုကို ထိန်းညှိပေးပြီး NFAT ၏ ဖော်ပြမှုကို အနည်းစုအားဖြင့် ထိန်းညှိပေးကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
(က) MNA မပါဘဲ ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော T ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင်၊ MNA ဖြင့် ကုသထားသော T ဆဲလ်များတွင် TNFα ဖော်ပြမှု၏ အလွှာပြောင်းလဲမှု။ SEM ဖြင့် ဖော်ပြမှုပုံစံကို ပြသထားသည် (n = ကျန်းမာသော အလှူရှင် ၅ ဦး)။ အနည်းဆုံး n = လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ၃ ခုမှ အချက်အလက်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (ခ) NFAT နှင့် Sp1 ပြီးနောက် 8 mM MNA ဖြင့် သို့မဟုတ် မဖြင့် ကုသထားသော T ဆဲလ်များ၏ TNFα ပရိုမိုတာကို (Ctrl) နှင့် PMA/ionomycin လှုံ့ဆော်မှုဖြင့် ၄ နာရီကြာ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ Immunoglobulin G (IgG) နှင့် H3 ကို immunoprecipitation အတွက် negative နှင့် positive control များအဖြစ် အသီးသီး အသုံးပြုခဲ့သည်။ ChIP ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းက MNA ကုသထားသော ဆဲလ်များတွင် TNFα ပရိုမိုတာနှင့် Sp1 နှင့် NFAT ချိတ်ဆက်မှုသည် control နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အဆပေါင်းများစွာ တိုးလာကြောင်း ပြသသည်။ အနည်းဆုံး n = လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ၃ ခုမှ အချက်အလက်များကို ကိုယ်စားပြုသည်။ multiple t-tests ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ထားသော P တန်ဖိုး (*** P <0.01)။ (ဂ) HGSC ၏ ascites နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင်၊ T ဆဲလ်များ (non-cytotoxic) သည် အကျိတ်တွင် TNF ၏ ဖော်ပြမှု တိုးလာသည်ကို ပြသသည်။ အရောင်များသည် မတူညီသော လူနာများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ပြသထားသောဆဲလ်များကို ကျပန်းနမူနာယူ၍ ၃၀၀ အထိ ခုန်ကျော်ခြင်းကို ကန့်သတ်ရန် jitter လုပ်ထားသည် (** Padj = 0.0076)။ (D) သားဥအိမ်ကင်ဆာအတွက် MNA ၏ အဆိုပြုထားသော မော်ဒယ်။ MNA ကို TME ရှိ အကျိတ်ဆဲလ်များနှင့် fibroblasts များတွင် ထုတ်လုပ်ပြီး T ဆဲလ်များမှ စုပ်ယူသည်။ MNA သည် Sp1 ၏ TNFα promoter နှင့် ချိတ်ဆက်မှုကို တိုးမြင့်စေပြီး TNFα မှတ်တမ်းရေးသားခြင်းနှင့် TNFα cytokine ထုတ်လုပ်မှု တိုးလာစေသည်။ MNA သည် IFN-γ ကိုလည်း လျော့ကျစေသည်။ T ဆဲလ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်းသည် သတ်နိုင်စွမ်းကို လျော့ကျစေပြီး အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို အရှိန်မြှင့်စေသည်။
အစီရင်ခံစာများအရ TNFα သည် ရှေ့နှင့်နောက် အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေးနှင့် အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေး အာနိသင်များ ရှိသော်လည်း သားဥအိမ်ကင်ဆာ၏ ကြီးထွားမှုနှင့် ပျံ့နှံ့မှုကို မြှင့်တင်ရာတွင် လူသိများသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည် (၃၁-၃၃)။ အစီရင်ခံစာများအရ သားဥအိမ်ကင်ဆာရှိသော လူနာများတွင် ရေမျိုပြွန်နှင့် အကျိတ်တစ်ရှူးများတွင် TNFα ၏ ပါဝင်မှုသည် ကင်ဆာမဟုတ်သော တစ်ရှူးများထက် ပိုမိုမြင့်မားသည် (၃၄-၃၆)။ ယန္တရားအရ TNFα သည် သွေးဖြူဥများ၏ အသက်ဝင်မှု၊ လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ပွားများမှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်ပြီး ကင်ဆာဆဲလ်များ၏ phenotype ကို ပြောင်းလဲနိုင်သည် (၃၇၊ ၃၈)။ ဤတွေ့ရှိချက်များနှင့် ကိုက်ညီစွာ၊ ကွဲပြားသော မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက ရေမျိုပြွန်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အကျိတ်တစ်ရှူးများရှိ T ဆဲလ်များတွင် TNF သိသိသာသာ မြင့်တက်လာကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၅ဂ)။ TNF ဖော်ပြမှု တိုးလာမှုသည် non-cytotoxic phenotype ရှိသော T ဆဲလ်လူဦးရေတွင်သာ ထင်ရှားသည် (ပုံ S5A)။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့်၊ ဤဒေတာသည် MNA သည် HGSC တွင် ကိုယ်ခံအားနှိမ်နင်းရေးနှင့် အကျိတ်မြှင့်တင်ရေး အာနိသင်နှစ်မျိုးရှိသည်ဟူသော အမြင်ကို ထောက်ခံပါသည်။
flow cytometry ကိုအခြေခံသည့် fluorescent labeling သည် TIL ဇီဝဖြစ်စဉ်ကိုလေ့လာရန် အဓိကနည်းလမ်းဖြစ်လာခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုများအရ ဒုတိယ lymphoid အင်္ဂါများမှ peripheral blood lymphocytes သို့မဟုတ် T ဆဲလ်များနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက murine နှင့် human TIL များသည် glucose စုပ်ယူမှုပိုမိုမြင့်မားသည် (4, 39) နှင့် mitochondrial function တဖြည်းဖြည်းဆုံးရှုံးခြင်း (19, 40) ရှိကြောင်းပြသခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင် အလားတူရလဒ်များကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သော်လည်း၊ အဓိကဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုမှာ ဖြတ်တောက်ထားသော tumor တစ်ရှူးမှ tumor ဆဲလ်များနှင့် TIL ၏ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို နှိုင်းယှဉ်ရန်ဖြစ်သည်။ ယခင်အစီရင်ခံစာအချို့နှင့်ကိုက်ညီစွာ၊ ascites နှင့် tumor များမှ tumor (CD45-EpCAM +) ဆဲလ်များသည် CD8 + နှင့် CD4 + T ဆဲလ်များထက် glucose စုပ်ယူမှုပိုမိုမြင့်မားပြီး tumor ဆဲလ်များ၏ glucose စုပ်ယူမှုမြင့်မားခြင်းကို T ဆဲလ်များနှင့်နှိုင်းယှဉ်နိုင်ကြောင်းထောက်ခံသည်။ T ဆဲလ်ယှဉ်ပြိုင်မှု၏အယူအဆ။ TME။ သို့သော် tumor ဆဲလ်များ၏ mitochondrial activity သည် CD8 + T ဆဲလ်များထက်ပိုမိုမြင့်မားသော်လည်း mitochondrial activity သည် CD4 + T ဆဲလ်များနှင့်ဆင်တူသည်။ ဤရလဒ်များသည် oxidative metabolism သည် tumor ဆဲလ်များအတွက်အရေးကြီးသည်ဟူသော ပေါ်ထွက်လာသောအကြောင်းအရာကို အားဖြည့်ပေးသည် (41, 42)။ CD8 + T ဆဲလ်များသည် CD4 + T ဆဲလ်များထက် အောက်ဆီဒေးရှင်း ချို့ယွင်းမှုကို ပိုမိုခံစားရနိုင်ခြေရှိနိုင်သည်ဟုလည်း ၎င်းတို့က အကြံပြုထားသော်လည်း၊ သို့မဟုတ် CD4 + T ဆဲလ်များသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် ဂလူးကို့စ်မှလွဲ၍ အခြားကာဗွန်ရင်းမြစ်များကို အသုံးပြုနိုင်ကြောင်းလည်း အကြံပြုထားသည် (43၊ 44)။ ရေငတ်ခြင်းတွင် CD4 + T effectors၊ T effector memory နှင့် T central memory ဆဲလ်များအကြား ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှု သို့မဟုတ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်တွင် ကွာခြားချက်မရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိခဲ့ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ အလားတူပင်၊ အကျိတ်များရှိ CD8 + T ဆဲလ်များ၏ ကွဲပြားမှုအခြေအနေသည် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုပြောင်းလဲမှုများနှင့် မသက်ဆိုင်ဘဲ၊ in vitro တွင် ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော T ဆဲလ်များနှင့် in vivo တွင် လူသား TIL ဆဲလ်များအကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်ကို မီးမောင်းထိုးပြသည် (22)။ ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်များကို ဘက်မလိုက်သော အလိုအလျောက်ဆဲလ်လူဦးရေ ခွဲဝေမှုကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့်လည်း အတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် အကျိတ်ဆဲလ်များထက် ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက် ပိုမိုမြင့်မားသော CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ဆဲလ်များသည် ပျံ့နှံ့နေသော်လည်း Metabolic active cell population ရှိကြောင်း ထပ်မံဖော်ပြခဲ့သည်။ ဤလူဦးရေသည် scRNA-seq ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော myeloid suppressor ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် plasmacytoid dendritic ဆဲလ်များ၏ ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော subpopulation ကို ကိုယ်စားပြုနိုင်သည်။ ဤနှစ်မျိုးလုံးသည် လူသားမျိုးဥအိမ်အကျိတ်များတွင် တွေ့ရှိရသော်လည်း [45]၊ ဤ myeloid မျိုးစုကို ဖော်ပြရန် နောက်ထပ်အလုပ် လိုအပ်ပါသည်။
flow cytometry-based နည်းလမ်းများသည် ဆဲလ်အမျိုးအစားများအကြား ဂလူးကို့စ်နှင့် အောက်ဆီဒေးရှင်းဇီဝဖြစ်စဉ်တွင် ယေဘုယျကွာခြားချက်များကို ရှင်းလင်းစေနိုင်သော်လည်း၊ TME တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဇီဝဖြစ်စဉ်အတွက် ဂလူးကို့စ် သို့မဟုတ် အခြားကာဗွန်ရင်းမြစ်များမှ ထုတ်လုပ်သော တိကျသောဇီဝဖြစ်စဉ်များကို မဆုံးဖြတ်ရသေးပါ။ ပေးထားသော TIL အစုအဖွဲ့သို့ ဇီဝဖြစ်စဉ်များ ရှိနေခြင်း သို့မဟုတ် မရှိခြင်း သတ်မှတ်ခြင်းသည် ဖြတ်ထုတ်ထားသောတစ်ရှူးမှ ဆဲလ်လူဦးရေကို သန့်စင်ရန် လိုအပ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ mass spectrometry နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ကျွန်ုပ်တို့၏ ဆဲလ်ကြွယ်ဝမှုနည်းလမ်းသည် ကိုက်ညီသောလူနာနမူနာများတွင် T ဆဲလ်များနှင့် အကျိတ်ဆဲလ်လူဦးရေများတွင် ကွဲပြားစွာကြွယ်ဝသော ဇီဝဖြစ်စဉ်များအကြောင်း ထိုးထွင်းသိမြင်မှုများကို ပေးစွမ်းနိုင်သည်။ ဤနည်းလမ်းသည် fluorescence-activated cell sorting ထက် အားသာချက်များရှိသော်လည်း၊ အချို့သောဇီဝဖြစ်စဉ်စာကြည့်တိုက်များသည် မွေးရာပါတည်ငြိမ်မှုနှင့်/သို့မဟုတ် မြန်ဆန်သောလည်ပတ်မှုနှုန်းကြောင့် ထိခိုက်နိုင်သည် (22)။ သို့သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏နည်းလမ်းသည် အသိအမှတ်ပြုထားသော ကိုယ်ခံအားနှိမ်နင်းသည့်ဇီဝဖြစ်စဉ်နှစ်ခုဖြစ်သည့် adenosine နှင့် kynurenine တို့ကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပြီး အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းတို့သည် နမူနာအမျိုးအစားများအကြား အလွန်ကွဲပြားသောကြောင့်ဖြစ်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ အကျိတ်များနှင့် TIL မျိုးကွဲများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် သားဥအိမ် TME တွင် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ပိုမိုထိုးထွင်းသိမြင်စေပါသည်။ ပထမဦးစွာ၊ flow cytometry ကို အသုံးပြု၍ အကျိတ်များနှင့် CD4 + T ဆဲလ်များအကြား မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်တွင် ကွာခြားချက်မရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ သို့သော်၊ LC-MS/MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ဤလူဦးရေအကြား ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများ ပေါများမှုတွင် သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး TIL ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ၎င်း၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ နိဂုံးချုပ်ချက်များကို ဂရုတစိုက် အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုရန် လိုအပ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဒုတိယအချက်အနေဖြင့်၊ MNA သည် အကျိတ်များမဟုတ်ဘဲ CD45-ဆဲလ်များနှင့် T ဆဲလ်များအကြား ascites ရှိ အကြီးမားဆုံး ကွာခြားချက်ရှိသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ compartmentalization နှင့် အကျိတ်တည်နေရာသည် TIL ဇီဝဖြစ်စဉ်အပေါ် ကွဲပြားသော အကျိုးသက်ရောက်မှုများ ရှိနိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် ပေးထားသော microenvironment တွင် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော မတူညီမှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။ တတိယအချက်အနေဖြင့်၊ MNA ထုတ်လုပ်သော အင်ဇိုင်း NNMT ၏ ဖော်ပြမှုသည် အဓိကအားဖြင့် CAF တွင် ကန့်သတ်ထားပြီး၊ ၎င်းသည် အကျိတ်ဆဲလ်များတွင် အနည်းငယ်သာ ကန့်သတ်ထားသော်လည်း၊ တွေ့ရှိနိုင်သော MNA အဆင့်များကို အကျိတ်မှဆင်းသက်လာသော T ဆဲလ်များတွင် တွေ့ရှိရသည်။ သားဥအိမ် CAF တွင် NNMT ၏ အလွန်အကျွံဖော်ပြမှုသည် ကင်ဆာကို အားပေးသည့် အကျိုးသက်ရောက်မှု ရှိပြီး၊ CAF ဇီဝဖြစ်စဉ်၊ အကျိတ်ကျူးကျော်မှုနှင့် metastasis (27) တို့ကို မြှင့်တင်ပေးခြင်းကြောင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်သည်။ TIL ၏ အလုံးစုံအဆင့်သည် အလယ်အလတ်ဖြစ်သော်လည်း၊ CAF ရှိ NNMT ၏ ဖော်ပြမှုသည် Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenchymal subtype နှင့် နီးကပ်စွာ ဆက်စပ်နေပြီး၊ ၎င်းသည် ရောဂါခန့်မှန်းချက် ညံ့ဖျင်းခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည် (27၊ 46၊ 47)။ နောက်ဆုံးတွင်၊ MNA ယိုယွင်းမှုအတွက် တာဝန်ရှိသော အင်ဇိုင်း AOX1 ၏ ဖော်ပြမှုသည် CAF လူဦးရေတွင်သာ ကန့်သတ်ထားပြီး၊ ၎င်းသည် T ဆဲလ်များသည် MNA ကို ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲနိုင်စွမ်း မရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဤရလဒ်များသည် ဤတွေ့ရှိချက်ကို အတည်ပြုရန် နောက်ထပ်အလုပ် လိုအပ်သော်လည်း၊ T ဆဲလ်များတွင် MNA အဆင့်မြင့်မားခြင်းသည် ကိုယ်ခံအားကို ဖိနှိပ်သော CAF အဏုကြည့်ပတ်ဝန်းကျင် ရှိနေခြင်းကို ညွှန်ပြနိုင်သည်ဟူသော အယူအဆကို ထောက်ခံပါသည်။
MNA သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးပစ္စည်းများ၏ ဖော်ပြမှုအဆင့်နိမ့်ခြင်းနှင့် MNA ဇီဝဖြစ်စဉ်တွင်ပါဝင်သော အဓိကပရိုတင်းများ၏ မတွေ့ရှိနိုင်သောအဆင့်များကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင် T ဆဲလ်များတွင် MNA ရှိနေခြင်းသည် မမျှော်လင့်ထားပေ။ NNMT သို့မဟုတ် AOX1 နှစ်ခုလုံးကို scRNA-seq ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် လွတ်လပ်သော cohorts နှစ်ခု၏ targeted qPCR ဖြင့် မတွေ့ရှိနိုင်ပါ။ ဤရလဒ်များက MNA ကို T ဆဲလ်များမှ ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ခြင်းမဟုတ်ဘဲ ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ TME မှ စုပ်ယူခြင်းဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ In vitro စမ်းသပ်ချက်များအရ T ဆဲလ်များသည် exogenous MNA စုပုံလေ့ရှိကြောင်း ပြသသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ in vitro လေ့လာမှုများအရ exogenous MNA သည် T ဆဲလ်များတွင် TNFα ၏ဖော်ပြမှုကိုလှုံ့ဆော်ပေးပြီး Sp1 ကို TNFα promoter နှင့်ချိတ်ဆက်မှုကို မြှင့်တင်ပေးကြောင်းပြသခဲ့သည်။ TNFα တွင် anti-tumor နှင့် anti-tumor လုပ်ဆောင်ချက်နှစ်မျိုးလုံးရှိသော်လည်း၊ သားဥအိမ်ကင်ဆာတွင် TNFα သည် သားဥအိမ်ကင်ဆာကြီးထွားမှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည် (31-33)။ သားဥအိမ်အကျိတ်ဆဲလ်မွေးမြူခြင်းတွင် TNFα ကိုပျက်ပြယ်စေခြင်း သို့မဟုတ် မောက်စ်မော်ဒယ်များတွင် TNFα အချက်ပြမှုကိုဖယ်ရှားခြင်းသည် TNFα ကြားခံ ရောင်ရမ်းမှု cytokine ထုတ်လုပ်မှုတိုးတက်စေပြီး အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားနိုင်သည် (32၊ 35)။ ထို့ကြောင့်၊ ဤကိစ္စတွင်၊ TME မှဆင်းသက်လာသော MNA သည် autocrine loop မှတစ်ဆင့် TNFα-dependent ယန္တရားမှတစ်ဆင့် pro-inflammatory metabolite အဖြစ်လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး သားဥအိမ်ကင်ဆာဖြစ်ပွားခြင်းနှင့် ပျံ့နှံ့ခြင်းကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည် (31)။ ဤဖြစ်နိုင်ခြေအပေါ်အခြေခံ၍ TNFα ပိတ်ဆို့ခြင်းကို သားဥအိမ်ကင်ဆာအတွက် အလားအလာရှိသော ကုထုံးဆိုင်ရာအေးဂျင့်အဖြစ် လေ့လာလျက်ရှိသည် (37၊ 48၊ 49)။ ထို့အပြင်၊ MNA သည် CAR-T ဆဲလ်များ၏ သားဥအိမ်အကျိတ်ဆဲလ်များအပေါ် cytotoxicity ကို ထိခိုက်စေပြီး MNA ကြားခံ ကိုယ်ခံအားနှိမ်နင်းမှုအတွက် နောက်ထပ်အထောက်အထားကို ပေးစွမ်းသည်။ စုပေါင်း၍ ဤရလဒ်များသည် အကျိတ်များနှင့် CAF ဆဲလ်များသည် ဆဲလ်ပြင်ပ TME ထဲသို့ MNA ကို ထုတ်လွှတ်သည့် မော်ဒယ်တစ်ခုကို အကြံပြုထားသည်။ (i) TNF ကြောင့်ဖြစ်သော သားဥအိမ်ကင်ဆာကြီးထွားမှုလှုံ့ဆော်မှုနှင့် (ii) MNA ကြောင့်ဖြစ်သော T ဆဲလ်ဆိုက်တိုတောက်ဆစ်ခ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို တားဆီးခြင်းမှတစ်ဆင့် ၎င်းသည် အကျိတ်နှစ်ထပ်အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိနိုင်သည် (ပုံ 5D)။
အဆုံးသတ်အနေနဲ့၊ အလျင်အမြန်ဆဲလ်ကြွယ်ဝစေခြင်း၊ ဆဲလ်တစ်ခုတည်းဖြင့် အစီအစဉ်ရှာဖွေခြင်းနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပရိုဖိုင်းပြုလုပ်ခြင်းတို့ကို ပေါင်းစပ်အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ဤလေ့လာမှုသည် HGSC လူနာများတွင် အကျိတ်များနှင့် ရေအိတ်ဆဲလ်များအကြား ကြီးမားသော ကိုယ်ခံအားမက်တာဘိုလိုမစ်ကွာခြားချက်များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ဤပြည့်စုံသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် T ဆဲလ်များအကြား ဂလူးကို့စ်စုပ်ယူမှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားလှုပ်ရှားမှုတွင် ကွာခြားချက်များရှိကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး MNA ကို ဆဲလ်မဟုတ်သော ကိုယ်ပိုင်အုပ်ချုပ်ခွင့်ရ ကိုယ်ခံအား ထိန်းညှိပေးသည့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းအဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ဤဒေတာများသည် TME သည် လူသားကင်ဆာများတွင် T ဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို မည်သို့အကျိုးသက်ရောက်သည်အပေါ် သက်ရောက်မှုရှိသည်။ T ဆဲလ်များနှင့် ကင်ဆာဆဲလ်များအကြား အာဟာရဓာတ်များအတွက် တိုက်ရိုက်ယှဉ်ပြိုင်မှုကို တင်ပြထားသော်လည်း၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများသည် အကျိတ်တိုးတက်မှုကို မြှင့်တင်ရန်နှင့် endogenous ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုများကို နှိမ်နင်းရန် သွယ်ဝိုက်သော ထိန်းညှိပေးသူများအဖြစ်လည်း လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။ ဤထိန်းညှိပေးသည့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပစ္စည်းများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အခန်းကဏ္ဍကို နောက်ထပ်ဖော်ပြချက်သည် အကျိတ်ဆန့်ကျင်ရေး ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုကို မြှင့်တင်ရန်အတွက် အခြားနည်းဗျူဟာများကို ဖွင့်လှစ်ပေးနိုင်သည်။
လူနာနမူနာများနှင့် ဆေးခန်းအချက်အလက်များကို Canadian Tissue Repository Network မှ အသိအမှတ်ပြုထားသော BC ကင်ဆာအကျိတ်တစ်ရှူးသိုလှောင်ရုံမှတစ်ဆင့် ရယူခဲ့ပါသည်။ BC ကင်ဆာသုတေသနကျင့်ဝတ်ကော်မတီနှင့် British Columbia တက္ကသိုလ် (H07-00463) မှ အတည်ပြုထားသော ပရိုတိုကောအရ၊ လူနာအားလုံး၏ နမူနာများနှင့် ဆေးခန်းဒေတာများသည် အကြောင်းကြားထားသော ရေးသားထားသော သဘောတူညီချက်ကို ရရှိခဲ့သည် သို့မဟုတ် ၎င်းတို့၏ သဘောတူညီချက်ကို တရားဝင်စွန့်လွှတ်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို အသိအမှတ်ပြု BioBank (BRC-00290) တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ အသေးစိတ်လူနာဝိသေသလက္ခဏာများကို ဇယား S1 နှင့် S5 တွင် ပြသထားသည်။ အေးခဲသိမ်းဆည်းရန်အတွက်၊ လူနာ၏အကျိတ်နမူနာကို စက်ပိုင်းဆိုင်ရာပြိုကွဲစေရန် ခွဲစိတ်ဓားကို အသုံးပြုပြီး 100-micron filter မှတစ်ဆင့် တွန်းပို့ကာ ဆဲလ်တစ်ခုတည်းကို ဆိုင်းထိန်းစနစ်ဖြင့် ထုတ်ပေးပါသည်။ လူနာ၏ ရေမျိုပြွန်ကို ဆဲလ်များကို အလုံးလိုက်ဖြစ်စေပြီး supernatant ကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် 4°C တွင် 1500 rpm ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ အကျိတ်နှင့် ရေဖျဉ်းရောဂါမှရရှိသောဆဲလ်များကို အပူပေးထားသော လူ့ AB သွေးရည်ကြည် ၅၀% (Sigma-Aldrich)၊ RPMI-1640 ၄၀% (Thermo Fisher Scientific) နှင့် dimethyl sulfoxide ၁၀% တို့တွင် အေးခဲအောင်ထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။ ဤထိန်းသိမ်းထားသော တစ်ခုတည်းသောဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းပစ္စည်းများကို အရည်ပျော်စေပြီး အောက်တွင်ဖော်ပြထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာများနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဆုံးဖြတ်ချက်ချရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။
ပြီးပြည့်စုံသော အလတ်စားတွင် 0.22 μm စစ်ထုတ်ထားသော 50:50 ဖြည့်စွက်ထားသော RPMI 1640: AimV ပါဝင်သည်။ RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ကို 10% အပူပေးပြီး အသက်မဝင်စေသော human AB serum (Sigma-Aldrich)၊ 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)၊ 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific)၊ 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) solution (Thermo Fisher Scientific) နှင့် 50 μMB-mercaptoethanol တို့ ပါဝင်သည်။ AimV (Invitrogen) ကို 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) နှင့် 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ flow cytometer staining buffer တွင် 0.22μm filtered phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) ကို 3% heat-inactivated AB human serum (Sigma) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ cell enrichment buffer တွင် 0.22μm filtered PBS နှင့် 0.5% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။
၃၇°C ပြည့်စုံသော အလတ်စားတွင်၊ ဆဲလ်များကို 10 nM MT DR နှင့် 100 μM 2-NBDG တို့ဖြင့် မိနစ် ၃၀ ကြာ ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ ထို့နောက်၊ ဆဲလ်များကို viability dye eF506 ဖြင့် ၄°C တွင် ၁၅ မိနစ်ကြာ ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ FC Block (eBioscience) နှင့် Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) တွင် ဆဲလ်များကို ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး (ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအရ) flow cytometer staining buffer တွင် ရောစပ်ကာ အခန်းအပူချိန်တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့် incubate လုပ်ပါ။ flow cytometry staining buffer တွင် ၄°C တွင် မိနစ် ၂၀ ကြာ antibodies များဖြင့် ဆဲလ်များကို ဆေးဆိုးပါ။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ flow cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) တွင် ဆဲလ်များကို ပြန်လည်ရောစပ်ပါ။ ဆဲလ်အရေအတွက်ဒေတာကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် SpectroFlo နှင့် FlowJo V10 ကို အသုံးပြုပြီး ဒေတာဖန်တီးရန် GraphPad Prism 8 ကို အသုံးပြုပါ။ 2-NBDG နှင့် MT DR ၏ အလယ်အလတ် fluorescence intensity (MFI) ကို log-normalized လုပ်ပြီးနောက် ကိုက်ညီသောလူနာများကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားရန် စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် paired t test ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဖြစ်ရပ် ၄၀ အောက်ရှိသော လူဦးရေအားလုံးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ ဖယ်ရှားပါ။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ဒေတာမြင်ယောင်မှုကို မလုပ်ဆောင်မီ မည်သည့်အနုတ်လက္ခဏာတန်ဖိုးများအတွက်မဆို MFI တန်ဖိုးကို ၁ ထည့်ပါ။
အထက်ဖော်ပြပါ လုပ်ငန်းစဉ် panel ၏ manual gating ဗျူဟာကို ဖြည့်စွက်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် FlowJo တွင် ဆဲလ်သေများကို ဖယ်ရှားပြီးနောက် population သို့ ဆဲလ်များကို အလိုအလျောက် သတ်မှတ်ရန် shape restriction tree (FAUST) (21) မှ အပြည့်အစုံ annotation ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ မှားယွင်းစွာ ခွဲဝေချထားပုံရသော (PD1+ နှင့် PD1-tumor ဆဲလ်များကို ပေါင်းစပ်ခြင်း) နှင့် ထိန်းသိမ်းထားသော populations များကို ပေါင်းစည်းရန် output ကို ကိုယ်တိုင်စီမံခန့်ခွဲပါသည်။ နမူနာတစ်ခုစီတွင် populations စုစုပေါင်း ၁၁ ခုအတွက် ပျမ်းမျှ 2% ကျော်သော ဆဲလ်များ ပါဝင်သည်။
PBMC ကို သွေးဖြူဥခွဲထုတ်ပစ္စည်းများမှ ခွဲထုတ်ရန် Ficoll gradient density centrifugation ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (STEMCELL Technologies)။ CD8 + T ဆဲလ်များကို CD8 MicroBeads (Miltenyi) ကို အသုံးပြု၍ PBMC မှ ခွဲထုတ်ခဲ့ပြီး ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်အတိုင်း TransAct (Miltenyi) ကို အသုံးပြု၍ complete medium တွင် ၂ ပတ်ကြာ တိုးချဲ့ခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ပါ၀င်သော complete medium တွင် ၅ ရက်ထားပြီးနောက် TransAct ဖြင့် ပြန်လည်လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်အတိုင်း ၇ ရက်မြောက်နေ့တွင် human CD45 MicroBeads (Miltenyi) ကို ဆက်တိုက် သုံးကြိမ် ဆဲလ်များကို ကြွယ်ဝစေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို flow cytometry analysis (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) အတွက် aliquot လုပ်ခဲ့ပြီး LC-MS/MS analysis အတွက် ဆဲလ်တစ်သန်းကို သုံးကြိမ် aliquot လုပ်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို အောက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း LC-MS/MS ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ion number 1,000 ဖြင့် ပျောက်ဆုံးနေသော metabolite တန်ဖိုးကို ကျွန်ုပ်တို့ ခန့်မှန်းတွက်ချက်ခဲ့သည်။ နမူနာတစ်ခုစီကို စုစုပေါင်းအိုင်းယွန်းနံပါတ် (TIC) ဖြင့် ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီး လော်ဂရစ်သမ်နည်းဖြင့်ပြောင်းလဲကာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ MetaboAnalystR တွင် အလိုအလျောက် ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်သည်။
လူနာတစ်ဦးချင်းစီ၏ ဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းစနစ်ကို အရည်ပျော်စေပြီး 40 μm filter မှတစ်ဆင့် complete medium (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) ထဲသို့ စစ်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ၊ MicroBeads (Miltenyi) ကို အသုံးပြု၍ သံလိုက်ပုတီးခွဲခြင်းဖြင့် အပြုသဘောရွေးချယ်မှု သုံးကြိမ်ဆက်တိုက် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး CD8+၊ CD4+ နှင့် CD45- ဆဲလ်များအတွက် နမူနာများကို (ရေခဲပေါ်တွင်) ကြွယ်ဝစေရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ဆဲလ်များကို ဆဲလ်ကြွယ်ဝမှု buffer (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး ရေတွက်သည်။ ဆဲလ်များကို human CD8 ပုတီး၊ human CD4 ပုတီး သို့မဟုတ် human CD45 ပုတီး (Miltenyi) ဖြင့် 4°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက် cell enrichment buffer ဖြင့် ဆေးကြောခဲ့သည်။ နမူနာကို LS column (Miltenyi) မှတစ်ဆင့် ဖြတ်သန်းစေပြီး positive နှင့် negative အပိုင်းအစများကို စုဆောင်းသည်။ ဆဲလ်ပြန်လည်ရယူခြင်းအဆင့်ကို လျှော့ချရန်နှင့် အများဆုံးဖြစ်စေရန်အတွက် CD8-fraction ကို CD4+ enrichment ၏ ဒုတိယအကျော့အတွက် အသုံးပြုပြီး CD4-fraction ကို နောက်ဆက်တွဲ CD45-enrichment အတွက် အသုံးပြုသည်။ ခွဲထုတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တစ်လျှောက်လုံး ဖျော်ရည်ကို ရေခဲပေါ်တွင်ထားပါ။
ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် နမူနာများပြင်ဆင်ရန်အတွက် ဆဲလ်များကို ရေခဲအေးဆားရည်ဖြင့် တစ်ကြိမ်ဆေးကြောပြီး ၈၀% မီသနော ၁ မီလီလီတာကို နမူနာတစ်ခုစီထဲသို့ထည့်ကာ အရည်နိုက်ထရိုဂျင်တွင် လှည့်ပတ်၍ ရေခဲအောင်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို ရေခဲပျော်ဝင်စေသည့် စက်ဝန်းသုံးကြိမ်ပြုလုပ်ပြီး ၄°C တွင် ၁၅ မိနစ်ကြာ ၁၄,၀၀၀ rpm ဖြင့် centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများပါ၀င်သည့် supernatant ကို ခြောက်သွေ့သည်အထိ အငွေ့ပျံစေသည်။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများကို ၀.၀၃% ဖော်မစ်အက်ဆစ် ၅၀ μl တွင် ပြန်လည်ပျော်ဝင်စေပြီး ရောနှောရန် လှည့်ပတ်စေပြီးနောက် အပျက်အစီးများကို ဖယ်ရှားရန် centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။
အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲသည့်အရာများကို ထုတ်ယူပါ။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ သုတေသနအတွက် supernatant ကို မြင့်မားသောစွမ်းဆောင်ရည်ရှိသော အရည် chromatography ပုလင်းထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ batch effect များကို ကာကွယ်ရန်အတွက် နမူနာတစ်ခုစီကို အလားတူဆဲလ်အရေအတွက်ဖြင့် ကုသရန် ကျပန်းကုသမှု protocol ကို အသုံးပြုပါ။ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) တွင် ယခင်ကထုတ်ဝေခဲ့သော ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲသည့်အရာများ၏ qualitative assessment ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ Chromatographic analysis နှင့် peak area integration ကို MultiQuant version 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ပျောက်ဆုံးနေသော metabolite တန်ဖိုးကို ခန့်မှန်းရန် ion count 1000 ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ နမူနာတစ်ခုစီ၏ TIC ကို နမူနာလုပ်ဆောင်ခြင်းမှ instrumental analysis မှ မိတ်ဆက်ပေးသော ပြောင်းလဲမှုများကို ပြင်ဆင်ရန် တွေ့ရှိထားသော metabolite တစ်ခုစီ၏ normalized peak area ကို တွက်ချက်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ TIC ကို normalized လုပ်ပြီးနောက်၊ MetaboAnalystR(51) (default parameter) ကို logarithmic conversion နှင့် automatic norm line scaling အတွက် အသုံးပြုသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် နမူနာအမျိုးအစားများအကြား metabolome ကွာခြားချက်များကို exploratory analysis ပြုလုပ်ရန်အတွက် vegan R package ပါသော PCA ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး လူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် partial redundancy analysis ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ နမူနာများအကြား Euclidean အကွာအဝေးကို cluster လုပ်ရန် heat map dendrogram တစ်ခုတည်ဆောက်ရန် Ward နည်းလမ်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ cell အမျိုးအစားနှင့် microenvironment တစ်ခုလုံးတွင် differently rich metabolites များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် standardized metabolite abundance တွင် limma (52) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ရှင်းလင်းချက်ကို ရိုးရှင်းစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် model ကို သတ်မှတ်ရန် group mean parameter ကို အသုံးပြုပြီး microenvironment ရှိ cell အမျိုးအစားများကို အုပ်စုတစ်ခုစီ (n = 6 အုပ်စု) အဖြစ် ထည့်သွင်းစဉ်းစားသည်။ သိသာထင်ရှားမှုစမ်းသပ်မှုအတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် metabolite တစ်ခုချင်းစီအတွက် ထပ်ခါတလဲလဲတိုင်းတာမှုသုံးကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ မှားယွင်းသောမိတ္တူကူးခြင်းကိုရှောင်ရှားရန်အတွက် လူနာကို limma ဒီဇိုင်းတွင် အတားအဆီးတစ်ခုအဖြစ် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ မတူညီသောလူနာများအကြား metabolites များ၏ ကွာခြားချက်များကိုစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ လူနာများပါဝင်သည့် limma မော်ဒယ်ကို ပုံသေနည်းလမ်းဖြင့် ချိန်ညှိခဲ့သည်။ ဆဲလ်အမျိုးအစားနှင့် Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg ပြင်ဆင်ချက်) ၏ microenvironment အကြား ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသော contrast ၏ အရေးပါမှုကို ကျွန်ုပ်တို့အစီရင်ခံပါသည်။
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) ကို အသုံးပြု၍ vigor enrichment ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ 10x 5′gene expression protocol ကို အသုံးပြု၍ single-cell transcriptome sequencing ကို အသက်ရှင်နေသော frozen ascites နှင့် tumor နမူနာအားလုံးတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ tumor နမူနာတစ်ခုမှ viability နည်းပါးခြင်းကြောင့် ၎င်းပါဝင်မှုကို တားဆီးထားသော်လည်း ကိုက်ညီသော tumor နှင့် ascites ရှိသော case ငါးခုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ လူနာများစွာ ရွေးချယ်နိုင်စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 10x chromium controller ၏ lanes များတွင် လူနာတစ်ဦးစီ၏ နမူနာများကို ပေါင်းစပ်ခဲ့ပြီး ascites နှင့် tumor နေရာများကို သီးခြားစီ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ sequencing ပြုလုပ်ပြီးနောက် [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome;] ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် အကျိတ်နှင့် ရေဖျဉ်းရောဂါအတွက် ပျမ်းမျှဖတ်ရှုမှု ၇၃,၄၈၈ နှင့် ၄၁,၃၇၈ အသီးသီး]]၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် CellSNP နှင့် Vireo (53) ကိုအသုံးပြုခဲ့သည် (CellSNP အနေဖြင့် အခြေခံသည်။ GRCh38 မှပေးသော common human SNP (VCF) ကို donor identity အဖြစ်သတ်မှတ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူနာ၏ genotype status (IBS) ၏ အနီးစပ်ဆုံး identity (IBS) ကို ကောက်ချက်ချရန် SNPRelate ကိုအသုံးပြုသည်၊ သတ်မှတ်ထားခြင်းမရှိသောဆဲလ်များနှင့် duplexes အဖြစ်ခွဲခြားထားသောဆဲလ်များနှင့် ရေဖျဉ်းရောဂါနှင့် tumor နမူနာများအကြားရှိ matching donor များ (54) ကို ဖယ်ထုတ်သည်။ ဤတာဝန်ကို အခြေခံ၍ downstream analysis အတွက် tumor နှင့် ascites တွင် များပြားသော cell representation ရှိသော case သုံးခုကို ကျွန်ုပ်တို့ထိန်းသိမ်းထားသည်။ scater (55) နှင့် scran (56) BioConductor packaging တွင် mass filtration step ကိုလုပ်ဆောင်ပြီးနောက်၊ ၎င်းသည် analysis အတွက် ဆဲလ် ၆၉၇၅ ခု (အကျိတ်နှင့် ရေဖျဉ်းရောဂါမှ ဆဲလ် ၂၇၉၂ ခုနှင့် ၄၁၈၃ ခု အသီးသီး) ကို ရရှိခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် Jaccard ကိုအခြေခံ၍ shared nearest neighbor network (SNN) ၏ igraph's (57) Louvain clustering ကို အသုံးပြုသည်။ ဖော်ပြချက်အားဖြင့် ဆဲလ်အစုအဝေးသို့ အကွာအဝေး။ အစုအဝေးများကို marker gene expression အပေါ်အခြေခံ၍ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ဆဲလ်အမျိုးအစားများအဖြစ် လက်ဖြင့် မှတ်ချက်ပြုခဲ့ပြီး t-SNE ဖြင့် မြင်ယောင်ခဲ့သည်။ Cytotoxic T ဆဲလ်များကို ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတိန်းဖော်ပြမှုနည်းသော subclusters များမှအပ CD8A နှင့် GZMA ၏ ဖော်ပြမှုဖြင့် သတ်မှတ်သည်။ Izar et al. (16) ၏ ထုတ်ဝေထားသော ဒေတာကို ကျွန်ုပ်တို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတို့၏ t-SNE ထည့်သွင်းခြင်းအပါအဝင်၊ ကိုယ်ခံအားဆဲလ် markers များနှင့် NNMT ဖော်ပြမှုအကြား ဖော်ပြမှုထပ်တူကျမှုကို ထိန်းချုပ်နိုင်သည်။
PBMC ကို Ficoll gradient density centrifugation ဖြင့် leukocyte separation products (STEMCELL Technologies) မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ CD3 + ဆဲလ်များကို CD3 beads (Miltenyi) ကို အသုံးပြု၍ PBMC မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ MNA ရှိနေခြင်း သို့မဟုတ် မရှိခြင်းတွင် CD3+ ဆဲလ်များကို plate-bound CD3 (5μg/ml)၊ soluble CD28 (3μg/ml) နှင့် IL-2 (300 U/ml; Proleukin) တို့ဖြင့် အသက်ဝင်စေခဲ့သည်။ ချဲ့ထွင်မှု၏ နောက်ဆုံးနေ့တွင်၊ အသက်ရှင်နိုင်မှု (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) နှင့် မျိုးပွားနိုင်မှု (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) တို့ကို flow cytometry ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ PMA (20 ng/ml) နှင့် ionomycin (1μg/ml) ဖြင့် ဆဲလ်များကို GolgiStop ဖြင့် ၄ နာရီကြာ လှုံ့ဆော်ခြင်းဖြင့် effector function ကို အကဲဖြတ်ပြီး CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) နှင့် TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) ကို စောင့်ကြည့်ပါ။ PMA (20 ng/ml) နှင့် ionomycin (1μg/ml) ဖြင့် qPCR နှင့် ChIP ဆဲလ်များကို ၄ နာရီကြာ လှုံ့ဆော်ပါ။ ELISA supernatant ကို PMA (20 ng/ml) နှင့် ionomycin (1 μg/ml) ဖြင့် လှုံ့ဆော်ခြင်းမပြုမီနှင့် လှုံ့ဆော်ပြီးနောက် ၄ နာရီကြာ စုဆောင်းခဲ့သည်။
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ကို အသုံးပြု၍ RNA ကို ခွဲထုတ်ရန် ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို လိုက်နာပါ။ နမူနာကို တစ်သားတည်းဖြစ်အောင် လုပ်ရန် QIAshredder (QIAGEN) ကို အသုံးပြုပါ။ ဖြည့်စွက် DNA (cDNA) ကို ပေါင်းစပ်ရန် မြင့်မားသော စွမ်းရည်ရှိသော RNA မှ cDNA ကိရိယာ (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြုပါ။ အောက်ပါ probe များဖြင့် (ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ) မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြုပါ- Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] နှင့် Hs01010726_m1 (SLC22A2)။ နမူနာများကို StepOnePlus real-time PCR စနစ် (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) တွင် MicroAmp optical film ပါရှိသော 96-well reaction plate (Applied Biosystems) တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ၃၅ ထက်ကျော်လွန်သော မည်သည့် Ct တန်ဖိုးကိုမဆို ထောက်လှမ်းမှု ကန့်သတ်ချက်ထက် ကျော်လွန်ပြီး ထောက်လှမ်း၍မရဟု ယူဆပါသည်။
ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း ChIP ကိုလုပ်ဆောင်ပါ (58)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ဆဲလ်များကို formaldehyde (နောက်ဆုံးပါဝင်မှု 1.42%) ဖြင့်ကုသပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 10 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။ ရေခဲပေါ်တွင် 10 မိနစ်ကြာ ဖြည့်စွက်ထားသော swelling buffer (25 mM Hepes၊ 1.5 mM MgCl2၊ 10 mM KCl နှင့် 0.1% NP-40) ကို အသုံးပြုပြီးနောက် (58) တွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း immunoprecipitation buffer တွင် ပြန်လည်ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ ထို့နောက် နမူနာကို အောက်ပါစက်ဝန်းများဖြင့် sonicated လုပ်ခဲ့သည်- စက်ဝန်း 10 ခု (1-second pulses 20 ခု) နှင့် 40 စက္ကန့် static time။ ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) နှင့် SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antibodies များကို နမူနာဖြင့် 4°CC တွင် တစ်ညလုံးလှုပ်ပါ။ ၄°C တွင် နမူနာနှင့်အတူ ပရိုတင်း A အမှုန်အမွှားများ (Thermo Fisher Scientific) ကို ၁ နာရီကြာ ညင်သာစွာလှုပ်ခါပြီး incubate လုပ်ပါ၊ ထို့နောက် DNA ကို ကြွယ်ဝစေရန် chelex အမှုန်အမွှားများ (Bio-Rad) ကို အသုံးပြုပြီး ပရိုတင်းချေဖျက်ရန်အတွက် proteinase K (Thermo Fisher) ကို အသုံးပြုပါ။ TNFα promoter ကို PCR ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်- forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp product)။ ရုပ်ပုံများကို Image Lab (Bio-Rad) မှ ထုတ်လုပ်ပြီး ImageJ software ကို အသုံးပြု၍ ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည်။
ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ supernatant ကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း စုဆောင်းခဲ့သည်။ ဆုံးဖြတ်ချက်ကို human TNFα ELISA kit (Invitrogen)၊ human IL-2 ELISA kit (Invitrogen) နှင့် human IFN-γ ELISA kit (Abcam) တို့၏ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအတိုင်း ဆောင်ရွက်ခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ supernatant ကို TNFα နှင့် IL-2 ကို ရှာဖွေရန် 1:100 နှင့် IFN-γ ကို ရှာဖွေရန် 1:3 ဖြင့် ရောစပ်ခဲ့သည်။ 450 nm တွင် absorbance ကို တိုင်းတာရန် EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ကို အသုံးပြုပါ။
PBMC ကို Ficoll gradient density centrifugation ဖြင့် leukocyte separation products (STEMCELL Technologies) မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ CD3 + ဆဲလ်များကို CD3 beads (Miltenyi) ကို အသုံးပြု၍ PBMC မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ MNA ရှိနေခြင်း သို့မဟုတ် မရှိခြင်းတွင် CD3+ ဆဲလ်များကို plate-bound CD3 (5μg/ml)၊ soluble CD28 (3μg/ml) နှင့် IL-2 (300 U/ml; Proleukin) တို့ဖြင့် ၃ ရက်ကြာ activate လုပ်ခဲ့သည်။ ၃ ရက်အကြာတွင် ဆဲလ်များကို စုဆောင်းပြီး 0.9% saline ဖြင့် ဆေးကြောခဲ့ပြီး pellet ကို snap frozen လုပ်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်ရေတွက်မှုကို 123count eBeads များကို အသုံးပြု၍ flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ထုတ်ယူထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲသည့်ပစ္စည်းများ။ အခြောက်ခံထားသော ထုတ်ယူမှုကို 4000 cell equivalents/μl အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းခဲ့သည်။ reversed-phase chromatography (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) နှင့် CORTECS T3 column (2.1×150 mm, particle size 1.6-μm, pore size 120-Å; #186008500, Waters) ဖြင့် နမူနာကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါ။ electrospray ionization သည် positive mode တွင် လည်ပတ်သည့် Polar mass spectrometer (6470, Agilent)။ Mobile phase A သည် 0.1% formic acid (H2O တွင်)၊ mobile phase B သည် 90% acetonitrile၊ 0.1% formic acid ဖြစ်သည်။ LC gradient သည် 100% A အတွက် 0 မှ 2 မိနစ်၊ 99% B အတွက် 2 မှ 7.1 မိနစ် နှင့် 99% B အတွက် 7.1 မှ 8 မိနစ်ဖြစ်သည်။ ထို့နောက် column ကို 0.6 ml/min စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် mobile phase A ဖြင့် 3 မိနစ်ပြန်လည်ချိန်ညှိပါ။ စီးဆင်းမှုနှုန်းမှာ 0.4 ml/min ဖြစ်ပြီး column chamber ကို 50°C အထိအပူပေးသည်။ MNA ၏ pure chemical standard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ကိုအသုံးပြု၍ retention time (RT) နှင့် transformation (RT = 0.882 minutes, transformation 1 = 137→94.1, transformation 2 = 137→92 , Conversion 3 = 137→78) ကိုသတ်မှတ်ရန်ဖြစ်သည်။ transition သုံးခုစလုံးသည် မှန်ကန်သော retention time တွင်ဖြစ်ပေါ်သောအခါ၊ transition 1 ကို တိကျမှုရှိစေရန် ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အတွက်အသုံးပြုသည်။ MNA (Toronto Research Chemical Company) ၏ စံမျဉ်းကွေးကို စတော့ရည် (1 mg/ml) ကို ခြောက်ကြိမ်ဆက်တိုက်ရောစပ်ခြင်းဖြင့် ထုတ်ပေးပြီး 0.1၊ 1.0၊ 10 နှင့် 100 ng/ml နှင့် 1.0 နှင့် 10μg/ml အသီးသီး အရည်စံနှုန်းများရရှိရန် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထောက်လှမ်းမှုကန့်သတ်ချက်မှာ 1 ng/ml ဖြစ်ပြီး linear response မှာ 10 ng/ml နှင့် 10μg/ml အကြားတွင်ရှိသည်။ LC/MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် နမူနာနှင့် စံနှစ်မိုက်ခရိုလီတာ ထိုးသွင်းမှုတစ်ခုစီကို အသုံးပြုပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပလက်ဖောင်း၏ တည်ငြိမ်မှုကိုသေချာစေရန် ရောနှောအရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုနမူနာကို ရှစ်ကြိမ်ထိုးသွင်းတိုင်း လုပ်ဆောင်သည်။ MNA ကုသထားသော ဆဲလ်နမူနာအားလုံး၏ MNA တုံ့ပြန်မှုများသည် assay ၏ linear range အတွင်းရှိသည်။ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို MassHunter quantitative analysis software (v9.0, Agilent) ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
ဒုတိယမျိုးဆက် αFR-CAR တည်ဆောက်ပုံကို Song et al. (59) မှ ရယူထားသည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် တည်ဆောက်ပုံတွင် အောက်ပါအကြောင်းအရာများ ပါဝင်သည်- CD8a leader sequence၊ human αFR-specific single-chain variable fragment၊ CD8a hinge and transmembrane region၊ CD27 intracellular domain နှင့် CD3z intracellular domain။ CAR sequence အပြည့်အစုံကို GenScript မှ ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် transduction efficiency ကို အကဲဖြတ်ရန်အသုံးပြုသည့် GFP expression cassette ၏ အထက်ပိုင်းရှိ ဒုတိယမျိုးဆက် lentiviral expression vector ထဲသို့ clone လုပ်ခဲ့သည်။
Lentivirus ကို HEK293T ဆဲလ်များ [American Type Culture Collection (ATCC)] ၏ transfection ဖြင့် ထုတ်လုပ်သည်။ fetal bovine serum (FBS) ၁၀% နှင့် PenStrep ၁% ပါဝင်သော Dulbecco ၏ modified Eagle medium တွင် ကြီးထွားစေပြီး CAR-GFP vector နှင့် The packaging plasmids (psPAX2 နှင့် pMD2.G, Addgene) တို့သည် lipofection amine (Sigma-Aldrich) ကိုအသုံးပြုသည်။ ဗိုင်းရပ်စ်ပါဝင်သော supernatant ကို transfection ပြုလုပ်ပြီး ၄၈ နာရီနှင့် ၇၂ နာရီအကြာတွင် စုဆောင်းကာ filter လုပ်ကာ ultracentrifugation ဖြင့် စုစည်းသည်။ transduction မပြုလုပ်မချင်း -၈၀°C တွင် စုစည်းထားသော viral supernatant ကို သိမ်းဆည်းပါ။
PBMC များကို Ficoll gradient density centrifugation ဖြင့် ကျန်းမာသော donor leukocyte separation products (STEMCELL Technologies) မှ ခွဲထုတ်ထားသည်။ CD8+ ဆဲလ်များကို PBMC မှ ခွဲထုတ်ရန် positive selection CD8 microbeads (Miltenyi) ကိုအသုံးပြုပါ။ TransAct (Miltenyi) ဖြင့် T ဆဲလ်များကို TexMACS medium [Miltenyi; 3% heat-inactivated human serum၊ 1% PenStrep နှင့် IL-2 (300 U/ml) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်] တွင် လှုံ့ဆော်ပါ။ လှုံ့ဆော်ပြီး ၂၄ နာရီအကြာတွင် T ဆဲလ်များကို lentivirus (ဆဲလ် ၁၀၆ ခုလျှင် 10 μl ပြင်းအားရှိသော ဗိုင်းရပ်စ် supernatant) ဖြင့် transduce လုပ်ခဲ့သည်။ Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ ပေါ်တွင်) တွင် transduction လုပ်ပြီး ၁ ရက်မှ ၃ ရက်အကြာတွင် အနည်းဆုံး 30% ၏ transduction စွမ်းဆောင်ရည်ကို ပြသရန် ဆဲလ်များ၏ GFP expression ကို အကဲဖြတ်ပါ။
CAR-T ဆဲလ်များကို Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်) တွင် အောက်ပါအခြေအနေများအောက်တွင် ၂၄ နာရီကြာ မွေးမြူခဲ့သည်- ကုသမှုမခံယူရသေးသော၊ 250 μM adenosine သို့မဟုတ် 10 mM MNA ဖြင့် ကုသထားသည်။ ကြိုတင်ကုသမှုပြီးနောက်၊ CAR-T ဆဲလ်များကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောပြီး SK-OV-3 ဆဲလ် ၂၀,၀၀၀ [ATCC; McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) တွင် 10% FBS နှင့် 1% PenStrep ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်- 1 ၏ effector နှင့် target ratio ကို ဖြည့်စွက်ထားသော Immunocult medium တွင် triplicate ဖြင့် မြှင့်တင်ခဲ့သည်။ digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော SK-OV-3 ဆဲလ်များနှင့် SK-OV-3 ဆဲလ်များကို အသီးသီး negative နှင့် positive controls အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ပူးတွဲပြုစုပျိုးထောင်ခြင်း ၂၄ နာရီအကြာတွင်၊ supernatant ကို စုဆောင်းပြီး lactate dehydrogenase (LDH) ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) အရ တိုင်းတာခဲ့သည်။ LDH supernatant ကို LDH buffer တွင် 1:50 ဖြင့် ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ သတ်ဖြတ်မှုရာခိုင်နှုန်းကို အောက်ပါဖော်မြူလာကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်- သတ်ဖြတ်မှုရာခိုင်နှုန်း = ပြင်ဆင်မှုရာခိုင်နှုန်း / အများဆုံးသတ်ဖြတ်မှုနှုန်း x 100%၊ ပြင်ဆင်မှုရာခိုင်နှုန်း = ပူးတွဲပြုစုပျိုးထောင်-T ဆဲလ်များသာ နှင့် အများဆုံးသတ်ဖြတ်မှုနှုန်း = အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှု-အနုတ်လက္ခဏာ ထိန်းချုပ်မှု။
စာသား သို့မဟုတ် ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများတွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် GraphPad Prism 8၊ Microsoft Excel သို့မဟုတ် R v3.6.0 ကို အသုံးပြုပါ။ လူနာတစ်ဦးတည်းမှ နမူနာများစွာ (ဥပမာ ရေဖျဉ်းရောဂါနှင့် အကျိတ်) စုဆောင်းပါက၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် paired t test ကို အသုံးပြုသည် သို့မဟုတ် လူနာကို သင့်လျော်သလို linear သို့မဟုတ် generalized model တွင် random effect အဖြစ် ထည့်သွင်းသည်။ metabolomics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ importance test ကို triplicate ဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။
ဤဆောင်းပါးအတွက် ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများအတွက် http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ကိုကြည့်ပါ။
ဤသည်မှာ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ၏ စည်းကမ်းချက်များအောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသော အခမဲ့ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုနိုင်သော ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ဖြစ်ပြီး မူရင်းလက်ရာသည် မှန်ကန်ကြောင်း အခြေခံအားဖြင့် နောက်ဆုံးအသုံးပြုမှုသည် စီးပွားဖြစ်အကျိုးအမြတ်အတွက် မဟုတ်သရွေ့ မည်သည့်မီဒီယာဖြင့်မဆို အသုံးပြုခြင်း၊ ဖြန့်ဖြူးခြင်းနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခြင်းကို ခွင့်ပြုထားသည်။ ကိုးကားချက်။
မှတ်ချက်- စာမျက်နှာသို့ သင်အကြံပြုထားသော ပုဂ္ဂိုလ်သည် သင်သည် အီးမေးလ်ကို မြင်စေလိုကြောင်းနှင့် ၎င်းသည် spam မဟုတ်ကြောင်း သိရှိစေရန်အတွက် သင့်အီးမေးလ်လိပ်စာကို ပေးရန်သာ ကျွန်ုပ်တို့ တောင်းဆိုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မည်သည့်အီးမေးလ်လိပ်စာကိုမျှ မရယူပါ။
ဒီမေးခွန်းကို သင်ဟာ လာရောက်လည်ပတ်သူ ဟုတ်မဟုတ် စမ်းသပ်ဖို့နဲ့ အလိုအလျောက် spam တင်သွင်းမှုကို ကာကွယ်ဖို့ အသုံးပြုပါတယ်။
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Jalph Ruder (J.R. Dell)၊ G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA သည် T ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်ခံအား နှိမ်နင်းမှုတွင် ပါဝင်ပြီး လူသားကင်ဆာကုသမှုအတွက် အလားအလာရှိသော ကိုယ်ခံအားကုထုံးပစ်မှတ်တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Jalph Ruder (J.R. Dell)၊ G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA သည် T ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်ခံအား နှိမ်နင်းမှုတွင် ပါဝင်ပြီး လူသားကင်ဆာကုသမှုအတွက် အလားအလာရှိသော ကိုယ်ခံအားကုထုံးပစ်မှတ်တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
© 2021 သိပ္ပံတိုးတက်မှုအတွက် အမေရိကန်အသင်း။ မူပိုင်ခွင့်ကိုလက်ဝယ်ထားသည်။ AAAS သည် HINARI၊ AGORA၊ OARE၊ CHORUS၊ CLOCKSS၊ CrossRef နှင့် COUNTER ၏ ပါတနာဖြစ်သည်။ ScienceAdvances ISSN 2375-2548။