Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS အတွက် ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော browser ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ compatibility mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ site ကို ပြသပါမည်။
ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများနှင့်မတူဘဲ၊ အင်းဆက်ပိုးမွှားများသည် အထီးဘက်လိုက်သော လိင်စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းများ ချို့တဲ့သည်ဟု ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ယူဆကြသည်။ Anopheles gambiae တွင်၊ ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) သည် အမများ ပေါင်းစပ်သောအခါ ဥဖွံ့ဖြိုးမှုကို ထိန်းချုပ်ရန် ဆင့်ကဲပြောင်းလဲလာပုံရသည်2 နှင့် အထီးများ လိင်မှတစ်ဆင့် ကူးပြောင်းသောအခါ မိတ်လိုက်ခြင်းကို ဆန့်ကျင်သည့်ကာလကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်3။ ဥဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် မိတ်လိုက်ခြင်းသည် မရှိမဖြစ် မျိုးပွားမှုဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများဖြစ်သောကြောင့်၊ အမ Anopheles ခြင်များသည် ဤဟော်မုန်းအချက်ပြမှုများကို မည်သို့ပေါင်းစပ်သည်ကို နားလည်ခြင်းသည် ငှက်ဖျားရောဂါထိန်းချုပ်ရေး အစီအစဉ်အသစ်များ ဒီဇိုင်းရေးဆွဲခြင်းကို အထောက်အကူပြုနိုင်သည်။ ဤနေရာတွင်၊ ဤမျိုးပွားမှုလုပ်ဆောင်ချက်များကို ecdysteroid-activating/inactivating အင်ဇိုင်းများ၏ ရှုပ်ထွေးသောကွန်ရက်မှတစ်ဆင့် ကွဲပြားသော လိင်စတီးရွိုက်များဖြင့် ထိန်းညှိထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ပြပါသည်။ လိင်မှတစ်ဆင့် ကူးပြောင်းပြီးနောက် အမ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ လက်ခံမှုကို ပိတ်ပစ်ပြီး dephosphorylation ဖြင့် လှုံ့ဆော်ခြင်းဖြင့် မိဘအုပ်ထိန်းမှုကို ကာကွယ်ပေးသည့် အထီးသီးသန့် အောက်ဆီဒေးရှင်း ecdysone၊ 3-dehydro-20E (3D20E) ကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ၊ 3D20E လွှဲပြောင်းမှုသည် Plasmodium ကူးစက်မှုအတွင်း ဥဖွံ့ဖြိုးမှုကို ထိန်းသိမ်းပေးသော မျိုးပွားမှုဆိုင်ရာ မျိုးရိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုကိုလည်း လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့ပြီး ကူးစက်ခံရသော အမများ၏ ကျန်းမာရေးကို သေချာစေသည်။ အမမှဆင်းသက်လာသော 20E သည် လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာတုံ့ပြန်မှုရှိသော်လည်း 20E-inhibiting kinases များကို တားဆီးပြီးနောက် မိတ်လိုက်သည့် သတ္တဝါများအား ဥများဥနိုင်စေပါသည်။ ဤအထီးသီးသန့် အင်းဆက်စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းကို ဖော်ထုတ်ခြင်းနှင့် အမျိုးသမီးများ၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ လက်ခံနိုင်စွမ်း၊ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းနှင့် Plasmodium နှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုတို့ကို ထိန်းညှိရာတွင် ၎င်း၏ အခန်းကဏ္ဍသည် ငှက်ဖျားရောဂါပိုးသယ်ဆောင်သော ခြင်များ၏ မျိုးပွားမှုအောင်မြင်မှုကို လျှော့ချရန် အလားအလာရှိကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
လူသားငှက်ဖျားကပ်ပါးကောင်များ၏ တစ်ခုတည်းသော သယ်ဆောင်သည့် အနောဖလိခြင်များတွင် ပိုးသတ်ဆေးယဉ်ပါးမှု ကျယ်ပြန့်စွာဖြစ်ပွားခြင်းကြောင့် ငှက်ဖျားရောဂါဖြစ်ပွားမှုနှင့် သေဆုံးမှုများ ထပ်မံမြင့်တက်လာနေပါသည်။ ဤခြင်များ၏ မိတ်လိုက်ခြင်းဇီဝဗေဒသည် ငှက်ဖျားရောဂါထိန်းချုပ်ရေး အစီအစဉ်အသစ်များအတွက် အထူးဆွဲဆောင်မှုရှိသော ပစ်မှတ်တစ်ခုဖြစ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် အမများသည် တစ်ကြိမ်သာ မိတ်လိုက်ကြသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ဤတစ်ကြိမ်တည်း မိတ်လိုက်ခြင်းကို မြုံစေခြင်းသည် လယ်ကွင်းရှိ ခြင်ဦးရေကို လျှော့ချရန် အလားအလာကောင်းတစ်ခု ဖြစ်လိမ့်မည်။
အမျိုးသမီးများသည် အမျိုးသားများထံမှ titer မြင့်မားသော စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းများ ရရှိပြီးနောက် လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ မစွမ်းဆောင်နိုင်တော့ပါ။ နောက်ထပ် မိတ်လိုက်ရာတွင် အခက်အခဲဖြစ်စေသော အချက်မှာ ပိုးလောင်းအဆင့်တွင် အမွေးအမှင်ထွက်ခြင်း သံသရာကို ထိန်းညှိပေးသည့် စတီးရွိုက်ဟော်မုန်း 20-hydroxyecdysone (20E) ဖြစ်ကြောင်း လေ့လာမှုများက ပြသထားသည်။ အထီးများ၏ 20E ကို ပေါင်းစပ်ပြီး လွှဲပြောင်းပေးနိုင်သော စွမ်းရည်သည် အာဖရိကတွင် ပျံ့နှံ့နေပြီး Anopheles gambiae အပါအဝင် ငှက်ဖျားရောဂါ၏ အန္တရာယ်အရှိဆုံး သယ်ဆောင်သူများ ပါဝင်သည့် Cellia7 မျိုးစိတ်ခွဲ၏ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည့် Anopheles မျိုးစိတ်များတွင် အထူးပြောင်းလဲလာခဲ့သည်။ ဤမျိုးစိတ်များတွင် အမများသည် သွေးစားတိုင်း 20E ထုတ်လုပ်ပြီး 20E သည် မျိုးဥကြွေခြင်း သံသရာကို မောင်းနှင်သောကြောင့် ၎င်းသည် အထူးသတိပြုသင့်သည် (ကိုးကားချက် 8 ကိုကြည့်ပါ)။ သို့သော် အမများသည် ၎င်းတို့၏ မိတ်လိုက်နိုင်စွမ်းကို မထိခိုက်စေဘဲ ecdysone ၏ မတူညီသော အရင်းအမြစ်နှစ်ခုမှ အချက်ပြမှုများကို မည်သို့ပေါင်းစပ်သည် (အထီးလွှဲပြောင်းခြင်းနှင့် သွေးကျွေးခြင်း လှုံ့ဆော်ခြင်း) အကြောင်း အနည်းငယ်သာ သိရှိကြသည်။ အမှန်မှာ အမများထုတ်လုပ်သော 20E သည် လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ သည်းမခံနိုင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါက၊ ၎င်းသည် အပျိုစင်နို့တိုက်သတ္တဝါများတွင် မျိုးမအောင်ခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ဤခြင်များတွင် အလွန်အဖြစ်များသော အပြုအမူတစ်ခုဖြစ်သည်။
ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ရှင်းလင်းချက်တစ်ခုမှာ A. gambiae အထီးများသည် ပြုပြင်ထားသော အထီးသီးသန့် ecdysone ကို လွှဲပြောင်းပေးပြီး၊ ၎င်းသည် အမမျိုးပွားလမ်းကြောင်းတွင် အချက်ပြမှုရေတံခွန်ကို အသက်ဝင်စေပြီး မိတ်လိုက်ခြင်း မတည်ငြိမ်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ သို့သော်၊ ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများတွင် estrogen နှင့် androgen ကဲ့သို့သော စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းများစွာရှိသော်လည်း (ကိုးကားချက် ၉ တွင် ပြန်လည်သုံးသပ်ထားသည်)၊ ကျွန်ုပ်တို့ သိရှိသလောက်၊ androgenic-biased steroids များကို အင်းဆက်များတွင် မဖော်ထုတ်နိုင်သေးပါ။
ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ပြုပြင်မွမ်းမံသည့် စတီးရွိုက်များကို ရှာဖွေရာတွင် လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ ရင့်ကျက်သော A. gambiae ၏ အထီး အထီး ဆက်စပ်ဂလင်း (MAG) ရှိ စတီးရွိုက် ဟော်မုန်းများ၏ စာရင်းကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ရန် စတင်ခဲ့ပါသည်။ ယခင်က အသုံးပြုခဲ့သော တိကျမှုနည်းသော နည်းလမ်းအစား tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) နှင့် တွဲဖက်ထားသော high performance liquid chromatography ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခင်ရလဒ်ကို အတည်ပြုသည့် ecdysone (E) နှင့် 20E ကို ဤတစ်ရှူးတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ သို့သော်၊ နမူနာတွင် 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 ဖော်မြူလာနှင့် ကိုက်ညီသော အောက်ဆီဒေးရှင်း ဖော့စဖောရီလိတ် စတီးရွိုက်များက လွှမ်းမိုးထားပါသည် (ပုံ ၁)။ အခြားပုံစံများတွင် 3-dehydro-20E (3D20E) နှင့် 20E-22-phosphate (20E22P) တို့ ပါဝင်သည်။ 3D20E22P ၏ HPLC-MS/MS အချက်ပြမှု ပြင်းထန်မှုသည် ၎င်း၏ dephosphorylated ပုံစံ 3D20E ထက် နှစ်ဆပိုမိုမြင့်မားပြီး E နှင့် 20E ထက် သုံးဆပိုမိုမြင့်မားပါသည် (ပုံ ၁)။ အခြားအစိတ်အပိုင်းများတွင် ခန္ဓာကိုယ်နှင့် မျိုးပွားလမ်းကြောင်းအောက်ပိုင်း၏ (LRT; Extended Data Fig. 1a)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မကြာသေးမီက ပိတ်လိုက်သော (၁ ရက်သားအောက်) အထီးနှင့် အမများတွင် ecdysteroids များကိုလည်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး MAG တွင်သာ 3D20E နှင့် 3D20E22P ကို ​​တွေ့ရှိခဲ့သည်။ E၊ 20E နှင့် 20E22P တို့ကို လိင်နှစ်မျိုးလုံးတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည် (Extended Data Fig. 1b)။ ဤဒေတာများအရ A. gambiae အရွယ်ရောက်ပြီးသော အထီးများသည် အမများမှ မထုတ်လုပ်သော ၎င်းတို့၏ MAGs တွင် ပြုပြင်ပေးသော ဟော်မုန်းများ၏ မြင့်မားသော titers များကို ထုတ်လုပ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
MAG နှင့် အမ LRT (atria၊ seminal vesicles နှင့် parovarium အပါအဝင်) ကို ၄ ရက်သား (၄ ရက်သား) အပျိုစင်အထီးများနှင့် အပျိုစင်နှင့် မိတ်လိုက်အမများ (0.5၊ 3 နှင့် 12 hpm) မှ ခွဲစိတ်ခဲ့သည်။ ဤတစ်ရှူးများရှိ Ecdysone ကို HPLC-MS/MS (mean ± sem; unpaired t-test, two-sided, false discovery rate (FDR) corrected; NS, non-substantial; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: ၃ နာရီ vs ၀.၅ နာရီ၊ P = 0.035; ၁၂ နာရီ vs ၃ နာရီ၊ P = 0.0015; ၁၂ နာရီ vs ၀.၅ နာရီ၊ P = 0.030 . 3D20E22P: ၃ နာရီ vs ၀.၅ နာရီ၊ P = 0.25; ၁၂ နာရီ vs ၃ နာရီ၊ P = ၀.၀၀၃၂; ၁၂ နာရီ vs ၀.၅ နာရီ၊ P = ၀.၀၁၅)။ ဒေတာများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားသုံးခုမှ ဖြစ်သည်။ စိတ်ဝင်စားဖွယ် ecdysone တစ်ခုစီအတွက် အမြင့်ဆုံးဧရိယာကို ခြင်အရေအတွက်ဖြင့် တွက်ချက်ပြီး ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Ecdysone ကို အောက်ပါအတိုင်း အရောင်ဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်- E၊ အစိမ်းရောင်၊ 20E၊ လိမ္မော်ရောင်၊ 20E22P၊ ခရမ်းရောင်၊ 3D20E၊ အပြာရောင်၊ 3D20E22P၊ ပန်းရောင်။ ထည့်သွင်းမှုသည် y-ဝင်ရိုးပေါ်ရှိ စကေးကို မြှင့်တင်ပေးပြီး ecdysone အဆင့် နိမ့်ကျမှုကို ပြသသည်။
3D20E22P နှင့် 3D20E တို့ကို မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း လွှဲပြောင်းပေးခြင်း ရှိ၊ မရှိ စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် အမ LRT များကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲစိတ်စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ အပျိုစင်များတွင် ecdysone ကို မတွေ့ရှိရသော်လည်း၊ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် LRT တွင် 3D20E22P များစွာကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ အချိန်နှင့်အမျှ လျော့နည်းသွားသော်လည်း (မိတ်လိုက်ပြီးနောက် 0.5 နာရီ၊ hpm) 3D20E အဆင့်များသည် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာခဲ့သည် (ပုံ ၁)။ ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော 3D20E ကို စံအဖြစ် အသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ မိတ်လိုက် LRT များတွင် ဤစတီးရွိုက်ဟော်မုန်းပမာဏသည် 20E ထက် အနည်းဆုံး 100 ဆ ပိုများကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (Extended Data Table 1)။ ထို့ကြောင့်၊ 3D20E22P သည် မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း အမ LRT သို့ လွှဲပြောင်းပေးသော အဓိက အထီး ecdysone ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်း၏ dephosphorylated ပုံစံ၊ 3D20E သည် မိတ်လိုက်ပြီးနောက် မကြာမီတွင် အလွန်ပေါများလာပါသည်။ ၎င်းသည် အမ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် ဇီဝဗေဒတွင် နောက်ဆုံး ecdysone အတွက် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍကို ညွှန်ပြသည်။
စိတ်ကြိုက်တည်ဆောက်ထားသော ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ ပိုက်လိုင်းကို အသုံးပြု၍ RNA sequencing (RNA-seq) dataset အသစ် (ပုံ ၂က) ကို ထုတ်လုပ်ပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ecdysone kinase (EcK)၊ ecdysone oxidase (EO) နှင့် ecdysone encoding 20E-modified phosphatase gene (EPP) ကို မျိုးပွားတစ်ရှူးများတွင် ဖော်ပြသည်ကို ရှာဖွေခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကိုယ်စားလှယ်လောင်း EPP gene တစ်ခုနှင့် အလားအလာရှိသော EcK gene နှစ်ခု (EcK1 နှင့် EcK2) ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သော်လည်း ကောင်းမွန်သော ကိုယ်စားလှယ်လောင်း EO gene ကို ရှာမတွေ့ခဲ့ပါ။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ၊ တစ်ဦးချင်း EPP gene များကို Gambian MAGs တွင် မြင့်မားသောအဆင့် (98.9th percentile) တွင် ဖော်ပြခဲ့သော်လည်း အမ LRTs တွင် မဖော်ပြခဲ့ပါ (ပုံ ၂ခ)၊ ဤအမတစ်ရှူးတွင် 3D20E22P ၏ dephosphorylation ဖြစ်ပေါ်ခဲ့သောကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ မျှော်လင့်ချက်များနှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း အထီး EPP ကို ​​လွှဲပြောင်းပေးနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယုံကြည်ပါသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် အမပရိုတင်းကို ဖုံးကွယ်ရန် in vivo stable isotope labeling ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ အမ atrium တွင် MS မှ ဖော်ထုတ်ထားသော အင်ဇိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည် (ပုံ ၂ဂ နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား ၁)။ MAG နှင့် မိတ်လိုက်သော (သို့သော် အပျိုမဟုတ်သော) အမ LRT တွင် EPP ရှိနေခြင်းကို သီးခြားပဋိပစ္စည်းများကို အသုံးပြု၍လည်း အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ ၂ဃ)။
(က)၊ EcKs၊ EOs နှင့် EPPs များကို အင်ကုဒ်လုပ်ထားသော မျိုးဗီဇများအတွက် လိင်တစ်ခုစီ၏ မျိုးပွားတစ်ရှူးများကို ရှာဖွေရန် စိတ်ကြိုက်တည်ဆောက်ထားသော ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ ပိုက်လိုင်းတစ်ခု။ မြှားများဘေးရှိ နံပါတ်များသည် အဆင့်တစ်ခုစီတွင် အမျိုးသားနှင့် အမျိုးသမီး ကိုယ်စားလှယ်လောင်းအရေအတွက်ကို ညွှန်ပြသည်။ ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် အမျိုးသားများတွင် ဖော်ပြထားသော EPP မျိုးဗီဇ (EPP) တစ်ခုနှင့် EcK မျိုးဗီဇ (EcK1) တစ်ခုနှင့် လိင်နှစ်မျိုးလုံးတွင် ဖော်ပြသော်လည်း ကိုယ်စားလှယ်လောင်း EO မျိုးဗီဇကို မထုတ်ပေးသော EcK မျိုးဗီဇ (EcK2) တစ်ခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ (ခ)၊ အပျိုစင် (V) နှင့် မိတ်လိုက်ခြင်း (M) Anopheles gambiae နှင့် Anopheles albicans တစ်ရှူးများတွင် ကိုယ်စားလှယ်လောင်း မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုကို နှိုင်းယှဉ်သည့် အပူမြေပုံ။ Spca၊ မျိုးအောင်ခြင်း၊ MAGs၊ အမျိုးသားများတွင် ဆက်စပ်ဂလင်းများ၊ ခန္ဓာကိုယ်၏ အခြားအစိတ်အပိုင်းများ၊ ရင်သား၊ အတောင်၊ ခြေထောက်၊ အဆီကိုယ်ထည်နှင့် လိင်နှစ်မျိုးလုံးတွင် အတွင်းအင်္ဂါများနှင့် အမျိုးသမီးများတွင် သားဥအိမ်များ ပါဝင်သည်။ EcK2 သည် ဂမ်ဘီယာနိုင်ငံ၏ MAG နှင့် atria နှစ်ခုလုံးတွင် များစွာဖော်ပြသော်လည်း EPP ကို ​​MAG တွင်သာ တွေ့ရှိရသည်။c၊ အထီးသုက်ရည်အုပ်စု 3၊ 12 နှင့် 24 hpm တွင် အမျိုးသမီး atria သို့ ရွှေ့ပြောင်းခြင်း၏ Proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အပေါများဆုံးပရိုတိန်း 67 မျိုးရှိကြောင်း ပြသထားသည်။ အမများကို ပရိုတိန်းအားလုံးကို တံဆိပ်ကပ်ရန် (နှင့် ဖုံးကွယ်ရန်) 15N ပါဝင်သော အစားအစာဖြင့် မွေးမြူခဲ့သည်။ တံဆိပ်မကပ်ထားသော အထီးများကို တံဆိပ်ကပ်ထားသော အမများနှင့် မိတ်လိုက်ခဲ့ပြီး အမ LRT များကို proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် 3၊ 12 နှင့် 24 hpm တွင် ခွဲစိတ်ခဲ့သည် (သုက်ရည်ပရိုတိန်းများစာရင်းအပြည့်အစုံအတွက် Supplementary Table 1 ကိုကြည့်ပါ)။ Inset၊ EPP၊ Eck1 နှင့် EcK2 တို့ကို ဤတစ်ရှူးများ၏ proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဖြင့် အပျိုစင်အထီးများ၏ MAG တွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။d၊ EPP ကို ​​မိတ်လိုက်သော အမများ၏ MAG နှင့် LRT တွင် western blot ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သော်လည်း အပျိုစင်အမများ သို့မဟုတ် အထီးများ သို့မဟုတ် အမျိုးသမီးခန္ဓာကိုယ်၏ ကျန်အပိုင်းများတွင် မတွေ့ရှိခဲ့ပါ။ အမြှေးပါးများကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း anti-actin (loading control) နှင့် anti-EPP antibodies များဖြင့် စမ်းသပ်ထားသည်။ အထီးအားလုံးသည် အပျိုစင်များဖြစ်သည်။ gel source data အတွက် Supplementary Figure 1 ကိုကြည့်ပါ။ Western blots များကို နှစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အလားတူရလဒ်များရရှိခဲ့သည်။
EPP ၏ ecdysteroid phosphosphatase လုပ်ဆောင်ချက်ကို MAG မှခွဲထုတ်ထားသော 3D20E22P ဖြင့် HPLC-MS/MS ဖြင့် incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက် အတည်ပြုခဲ့သည် (Extended Data Fig. 2a)။ ထို့အပြင်၊ RNA-mediated interference (RNAi) ဖြင့် EPP ကို ​​silenced လုပ်သောအခါ၊ ဤအထီးများ၏ မျိုးပွားတစ်ရှူးများတွင် phosphatase လုပ်ဆောင်ချက် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3a)၊ EPP-silenced အထီးများနှင့် မိတ်လိုက်သော အမများသည် မျိုးရိုးဗီဇ silencing တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းရှိနေသော်လည်း dephosphorylated 3D20E အချိုးအစား A လျော့နည်းသွားသည်ကို ပြသခဲ့သည် (Extended Data Fig. 2b,c)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ တူညီသောခြင်များတွင် 20E22P/20E အချိုးတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိခဲ့ပါ၊ ၎င်းသည် အင်ဇိုင်းသည် 3D20E22P အတွက် သီးသန့်ဖြစ်သည်ဟု အကြံပြုနိုင်သည် (ပုံ 3b)။
a။ double-stranded EPP RNA (dsEPP) သို့မဟုတ် double-stranded GFP RNA (dsGFP) ထိန်းချုပ်မှုများကို အသုံးပြု၍ EPP silencing ကြောင့် MAG တွင် phosphatase လုပ်ဆောင်ချက် လျော့နည်းသွားသည်။ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင် MAG pool ၂၀ ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး (P = 0.0046၊ paired t-test၊ two-sided)၊ သီးခြားအစက်များဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်။b။ EPP-silenced အထီးများနှင့် မိတ်လိုက်သော အမများတွင် 3 hpm တွင် dephosphorylated 3D20E အချိုးအစား သိသိသာသာ နည်းပါးသော်လည်း (P = 0.0043၊ unpaired t-test၊ two-sided)၊ 20E အဆင့်များကိုမူ ထိခိုက်မှု မရှိခဲ့ပါ (P = 0.063၊ unpaired)။ t-စမ်းသပ်မှု၊ နှစ်ဖက်စလုံး)။ အမ ၁၃၊ ၁၆ နှင့် ၁၉ ကောင်စီပါဝင်သော အုပ်စုသုံးခုမှ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± sem အဖြစ် တင်ပြထားသည်။c၊ EPP-silenced အထီးများနှင့် မိတ်လိုက်သော အမများသည် ပြန်လည်မိတ်လိုက်နှုန်း သိသိသာသာ မြင့်မားသည် (P = 0.0002၊ Fisher ၏ တိကျသောစမ်းသပ်မှု၊ နှစ်ဖက်စလုံး)။ အမများကို ၎င်းတို့၏ မိတ်လိုက်မှုအခြေအနေကို သေချာစေရန် ဦးစွာ မိတ်လိုက်ရန် အတင်းအကျပ်ခိုင်းစေခဲ့သည်။ ၂ ရက်အကြာတွင် ၎င်းတို့အား transgene ၏ quantitative PCR ထောက်လှမ်းခြင်းဖြင့် ပြန်လည်မိတ်လိုက်နှုန်းကို အကဲဖြတ်ရန် transgenic သုက်ပိုးသယ်ဆောင်ထားသော အခြားအထီးများနှင့် ဆက်သွယ်ခဲ့သည်။ d၊ EPP-silenced အထီးများနှင့် မိတ်လိုက်သော သွေးကျွေးထားသော အမများသည် မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (P < 0.0001; Mann-Whitney စမ်းသပ်မှု၊ နှစ်ဖက်) နှင့် ဥအရေအတွက် အနည်းငယ် လျော့နည်းသွားသည် (P = 0.088, Mann-Whitney စမ်းသပ်မှု၊ နှစ်ဖက်)၊ သို့သော် ဥဥနှုန်းကို မထိခိုက်ပါ (P = 0.94, Fisher's exact test, နှစ်ဖက်)။ panel အားလုံးတွင် n သည် ဇီဝဗေဒအရ လွတ်လပ်သော ခြင်နမူနာအရေအတွက်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ NS၊ အရေးမကြီးပါ။*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001။
ထို့နောက်၊ အမများတွင် မိတ်လိုက်ခြင်းကို ခံနိုင်ရည်ရှိစေရန် ecdysone dephosphorylation သည် အရေးကြီးခြင်း ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ၊ EPP လျော့နည်းသွားသော အထီးများနှင့် မိတ်လိုက်သော အမများသည် နောက်ထပ် (transgenic) အထီးများနှင့် ထိတွေ့သောအခါ ထိန်းချုပ်မှုအမများ (10.4%) ထက် များစွာပိုမိုမြင့်မားသော ကြိမ်နှုန်း (44.9%) ဖြင့် ပြန်လည်မိတ်လိုက်ကြသည် (ပုံ 3c)။ မျိုးအောင်နိုင်စွမ်းတွင် သိသိသာသာ ကျဆင်းခြင်း (ပုံ 3d၊ ဘယ်ဘက်) နှင့် ဤအမများဥသော ဥအရေအတွက် အနည်းငယ်ကျဆင်းခြင်း (ပုံ 3d၊ အလယ်) ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ အမများဥသော ဥရာခိုင်နှုန်း (မိတ်လိုက်ခြင်းဖြင့် အမများတွင် ထွက်ပေါ်လာသော နောက်ထပ်တုံ့ပြန်မှု)) မှာမူ သက်ရောက်မှုမရှိပါ (ပုံ 3d၊ ညာဘက်)။ 3D20E22P အတွက် EPP ၏ တွေ့ရှိရသည့် သီးခြားဖြစ်မှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင်၊ ဤရလဒ်များက မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း လွှဲပြောင်းပေးသော EPP မှ 3D20E ကို အသက်ဝင်စေခြင်းသည် အမများ နောက်ထပ်မိတ်လိုက်ခြင်းကို လက်ခံနိုင်စွမ်းကို ပိတ်ပစ်ရာတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားပြီး၊ ယခင်က 20E ၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ လွှဲပြောင်းမှုနှင့် ပတ်သက်၍ ယူဆခဲ့သော အပြုအမူတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် ဤအထီးသီးသန့်ဟော်မုန်းသည် အမများ၏ မျိုးအောင်နိုင်စွမ်းကိုလည်း ပြင်းထန်စွာ သက်ရောက်မှုရှိသည်။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော 3D20E (ပုံ ၄က-ဂ) နှင့် စီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင်သော 20E ကို အသုံးပြု၍ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ ရင့်ကျက်သော အပျိုစင်များတွင် ထိုးဆေးစမ်းသပ်မှုများတွင် 20E နှင့် 3D20E ၏ လုပ်ဆောင်ချက်များကို နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါသည်။ ပြင်းအားနှစ်မျိုးလုံးတွင် အမများ၏ မိတ်လိုက်ခြင်းအပေါ် အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို ပိတ်ရာတွင် 3D20E သည် 20E ထက် သိသိသာသာ ပိုမိုထိရောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၄ဃ)။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ LRT (ထိုးပြီးနောက် 1,066 pg vs. မိတ်လိုက်ပြီးနောက် 2,022 pg) ရှိ 3D20E ၏ ဇီဝကမ္မဗေဒအဆင့်၏ ထက်ဝက်သည် ထိုးပြီးနောက် အမြင့်ဆုံးပြင်းအား 18 pg မိတ်လိုက်ပြီးနောက် 24 နာရီအတွင်း 20E (ထိုးပြီးနောက် 361 pg) ၏ ဇီဝကမ္မဗေဒအဆင့်ထက် 20 ဆ မြင့်မားသော ခံနိုင်ရည်မရှိသော အမများ၏ အချိုးအစားကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ တိုးချဲ့ဒေတာဇယား ၁)။ ဤရလဒ်သည် 20E ၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာလွှဲပြောင်းမှုသည် မိတ်လိုက်ခြင်းကို ဆန့်ကျင်သည့်ကာလများကို မဖြစ်စေသည်ဟူသော အယူအဆနှင့် ကိုက်ညီပြီး မိဘနှင့်ကလေးဆက်ဆံရေးကို သေချာစေရာတွင် အဓိကအချက်တစ်ခုအဖြစ် 3D20E ကို ထောက်ပြသည်။ အပျိုစင်အမများတွင် ဥဥခြင်းစမ်းသပ်မှုများတွင် 3D20E သည် 20E ထက် သိသိသာသာ ပိုမိုတက်ကြွသည် (ပုံ ၄e)၊ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း EPP တိတ်ဆိတ်သွားပြီးနောက် ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သော ပုံမှန်ဥဥနှုန်းသည် မိတ်လိုက်ခြင်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော အမအချက်များမှ ထုတ်လုပ်သော ကျန်ရှိနေသော 3D20E လှုပ်ရှားမှုရှိနေခြင်းကြောင့်ဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
(က၊ ခ) 3D20E ကို 20E မှ ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည် (က) အလွန်မြင့်မားသော ပြောင်းလဲခြင်း/ထိရောက်မှုဖြင့် (ဒေတာကို လွတ်လပ်သော ပေါင်းစပ်မှု ဓာတ်ပြုမှု သုံးခုမှ ပျမ်းမျှ ± sem အဖြစ် တင်ပြထားသည်) (ခ)။ Mass spectrum (အောက်ပိုင်းတစ်ဝက်) သည် မိတ်လိုက် အမ LRT (အပေါ်ပိုင်းတစ်ဝက်) တွင်တွေ့ရှိရသော ecdysone နှင့် တစ်ထပ်တည်း ကိုက်ညီသည် (အပေါ်ပိုင်း)။ d။ 20E (0.63 µg၊ P = 0.02; 0.21 µg၊ P < 0.0001; Fisher's exact test, two-sided) နှင့် 10% ethanol (0.63 µg၊ P < 0.0001; 0.21 µg၊ P < 0.0001; Fisher's exact test, 2-sided) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 20E သည် ပိုမိုမြင့်မားသော ဆေးပမာဏ (0.63 µg၊ P = 0.0002; 0.21 µg၊ P = 0.54; Fisher's exact test) တွင်သာ ထိန်းချုပ်မှုထက် သိသိသာသာ မြင့်မားသည်။ ၂-ဘက်)။e၊ 3D20E ထိုးဆေးသည် 10% အီသနောထိန်းချုပ်မှုများ (0.21 µg၊ P < 0.0001; 0.13 µg၊ P = 0.0003; Fisher's exact test, two-sided) ထက် အပျိုစင်အမများတွင် ဥဥနှုန်းသိသိသာသာမြင့်မားစွာဖြစ်ပေါ်စေပြီး ထိန်းချုပ်မှုများနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက 20E ကို ပိုမိုမြင့်မားသောဆေးပမာဏတွင်သာ (0.21 µg၊ P = 0.022; 0.13 µg၊ P = 0.0823; Fisher's exact test, two-sided)။3D20E သည် ပိုမိုမြင့်မားသောဆေးပမာဏတွင် 20E ထက် (0.21 µg၊ P = 0.0019; 0.13 µg၊ P = 0.075; Fisher's exact test, two-sided) သိသိသာသာမြင့်မားသောဥဥနှုန်းကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။ panel အားလုံးတွင် n သည် ဇီဝဗေဒအရလွတ်လပ်သောခြင်နမူနာအရေအတွက်ကိုကိုယ်စားပြုသည်။NS၊ အရေးမကြီးပါ။*P < 0.05၊ **P < 0.01၊ ***P < 0.001၊ ****P < 0.001။ ဒေတာများသည် ထပ်တူပြုမှုသုံးခုမှ ဖြစ်သည်။
ယခင်လေ့လာမှုများတွင်၊ စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းများ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာလွှဲပြောင်းမှုသည် A. gambiae အမများကို P. falciparum ကူးစက်ခြင်းမှ ကာကွယ်ပေးသည့် အမမျိုးပွားဗီဇတစ်ခုဖြစ်သည့် MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ၏ ဖော်ပြမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ၎င်းသည် အသေအပျောက်အများဆုံး လူသားငှက်ဖျားကပ်ပါးကောင် 13 ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ကျန်းမာရေးကုန်ကျစရိတ်များဖြစ်သည်။ ငှက်ဖျားရောဂါဖြစ်ပွားမှုများသောဒေသများရှိ Anopheles များ၏ မျိုးပွားမှုကြံ့ခိုင်မှုအတွက် MISO ၏ အရေးပါမှုကို ထောက်ရှုခြင်းအားဖြင့်၊ မည်သည့်ဟော်မုန်း 3D20E သို့မဟုတ် 20E သည် ဤဂျင်း၏ ဖော်ပြမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ 20E ထိုးဆေးသည် HR3 နှင့် HR4 ကဲ့သို့သော နျူကလီးယားဟော်မုန်း receptors (HR) အချို့ကို အထူးသဖြင့် သို့မဟုတ် ပိုမိုအားကောင်းစွာ လှုံ့ဆော်ပေးသော်လည်း၊ yolkogenic မျိုးဗီဇ Vg14၊ 15၊ 16 ကဲ့သို့သော ပုံမှန် downstream steroid targets များကို လှုံ့ဆော်ပေးသော်လည်း၊ MISO ကို 3D20E (Extended Data Fig. 3) မှ ပိုမိုအားကောင်းစွာ လှုံ့ဆော်ပေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤအန်ဒရိုဂျင်စတီးရွိုက်ဟော်မုန်း၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာလွှဲပြောင်းမှုသည် အမများကို ကပ်ပါးကောင်ကူးစက်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ကုန်ကျစရိတ်များမှ ကာကွယ်ပေးသည့် ယန္တရားများကို လှုံ့ဆော်ပေးပုံရသည်။ ထို့အပြင်၊ 3D20E သည် နှစ်မျိုးလုံးကို ကွဲပြားစွာ သက်ရောက်မှုရှိသည် E receptor EcR ရဲ့ isoform တွေက EcR-A ကိုလှုံ့ဆော်ပေးပြီး EcR-B ကိုဖိနှိပ်ပေးကာ HPX15 အပါအဝင် အခြားမိတ်လိုက်စေတဲ့ မျိုးဗီဇတွေကို ပိုမိုပြင်းထန်စွာလှုံ့ဆော်ပေးပြီး အမျိုးသမီးတွေရဲ့ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို ထိခိုက်စေတယ်။ ဒါက EPP-silenced အထီးတွေနဲ့ မိတ်လိုက်ထားတဲ့ အမျိုးသမီးတွေမှာ တွေ့ရှိရတတ်တဲ့ သိသာထင်ရှားတဲ့ မျိုးမအောင်ခြင်းကို ရှင်းပြနိုင်ပါတယ် (Extended Data Fig. 3)။ ဒီဒေတာတွေက လိင်အလိုက်လုပ်ဆောင်ချက်ကို အခြေခံနိုင်တဲ့ ecdysone ဟော်မုန်းနှစ်ခုက ဦးစားပေးလှုံ့ဆော်ပေးတဲ့ downstream လမ်းကြောင်းတွေ ရှိနေတာကို အကြံပြုထားပါတယ်။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ ပိုက်လိုင်းတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော EcK မျိုးဗီဇနှစ်ခု၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ EcK1 သို့မဟုတ် EcK2 ကို တိတ်ဆိတ်စေခြင်းသည် အထီးများတွင် သိသာထင်ရှားသော သေဆုံးမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည် (Extended Data Fig. 4a)၊ ecdysone phosphorylation နှင့် ထို့ကြောင့် inactivation သည် ရှင်သန်မှုအတွက် အရေးကြီးကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ EcK2 သည် EcK1 ထက် ပိုမိုမြင့်မားသောအဆင့်တွင် ဖော်ပြခဲ့ပြီး proteomics မှ MAGs တွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 2b၊ c နှင့် Supplementary Table 2)၊ ၎င်း၏ ecdysteroid kinase လှုပ်ရှားမှုကို 20E ဖြင့် incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့ပြီး phosphorylation 20E22P ကို ​​ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည် (Extended Data Fig. 2)။4b)။ 3D20E ကို substrate အဖြစ်အသုံးပြုသောအခါ၊ phosphorylated product 3D20E22P ကို ​​ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိနိုင်ပါ (Extended Data Fig. 4c)၊ 3D20E အစား 20E သည် EcK2 ၏ ဦးစားပေးပစ်မှတ်ဖြစ်နိုင်သည်ဟု ညွှန်ပြသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ RNA-seq ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ၊ အပျိုစင်အမများ၏ LRT တွင်လည်း EcK2 မြင့်မားစွာဖော်ပြခဲ့ပြီး၊ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် ပိတ်သွားသည် (ပုံ ၂ခ)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤဒေတာကို အတည်ပြုပြီး EcK2 ဖော်ပြမှုသည် သွေးကျွေးခြင်းကြောင့် မထိခိုက်ကြောင်း ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (Extended Data Fig. 5a)။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ကနဦး MS စမ်းသပ်ချက်များကို တိုးချဲ့ခြင်းဖြင့် 20E22P ၏ အမြင့်ဆုံးသည် 20E (သွေးအစာစားပြီး ၂၂-၂၆ နာရီ၊ Extended Data Fig. 5b) ၏ အမြင့်ဆုံးနှင့် အနီးကပ်ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ အပျိုစင်အမများတွင် EcK2 ကို တိတ်ဆိတ်စေခြင်းသည် သွေးအစာစားပြီး ၂၆ နာရီတွင် 20E မှ 20E22P အချိုး ၃ ဆတိုးလာစေသည် (Extended Data Figures 2c နှင့် 5c)၊ အပျိုစင်များတွင် EcK2 သည် 20E ကိုလည်း phosphorylates ပေးကြောင်း အတည်ပြုသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ၊ EcK2 လျော့နည်းသွားသော အပျိုစင်များသည် လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ လက်ခံနိုင်စွမ်းအပြည့်အဝကို ထိန်းသိမ်းထားသည် (Extended Data Fig. 5d,e)၊ အပျိုစင် 20E ထုတ်လုပ်မှုသည် မိတ်လိုက်ခြင်းကို ဆန့်ကျင်သည့်ကာလများကို မဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ထပ်မံအကြံပြုထားသည်။ သို့သော်၊ ဤအပျိုစင်များတွင် ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဥဥနှုန်း သိသိသာသာ မြင့်တက်လာပြီး အပျိုစင် ၃၀% ကျော်သည် ဥများဥကြသည် (Extended Data Fig. 5f)။ သွေးကျွေးပြီးနောက် နှစ်ထပ်ကြိုး Eck2 RNA (dsEcK2) ထိုးဆေးများ ပြုလုပ်ပါက ဥဥခြင်း မဖြစ်ပေါ်ခဲ့ဘဲ သွေးစုပ်ယူမှုကြောင့် 20E အထွတ်အထိပ် ကျဆင်းသွားခဲ့သည်။ အလုံးစုံပြောရလျှင် ဤရလဒ်များသည် သွေးစုပ်ယူပြီးနောက် ထုတ်လုပ်သော 20E သည် ဥဥခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သော်လည်း ဥဥခြင်းပိတ်ဆို့ခြင်း (EcK2 နှင့် အခြားအချက်များ) ကို မိတ်လိုက်ခြင်းဖြင့် ပိတ်လိုက်သောအခါတွင်သာ ဖြစ်သည်ဟူသော မော်ဒယ်ကို ထောက်ခံပါသည်။ 20E သို့မဟုတ် 3D20E ထိုးဆေးများသည် အပျိုစင်များတွင် EcK2 ဖော်ပြမှုကို မတားဆီးခဲ့ပါ (Extended Data Fig. 5g)၊ အခြားအချက်များသည် ဤ kinase ကို တားဆီးခြင်းကို ကြားခံဖြစ်စေကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ သို့သော် သွေးကျွေးပြီးနောက် 20E အဆင့်များသည် မိတ်လိုက်ရာတွင် မသက်မသာဖြစ်စေရန် မလုံလောက်သော်လည်း လိင်မှတစ်ဆင့် လွှဲပြောင်းထားသော 3D20E ၏ မြင့်မားသော titers များကြောင့် ထိရောက်စွာ လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် A. gambiae ၏ မျိုးပွားမှုအောင်မြင်မှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများအကြောင်း အရေးကြီးသော ထိုးထွင်းသိမြင်မှုများကို ပေးစွမ်းသည်။ အထီးများသည် 3D20E ၏ မြင့်မားသော titers များကို ပေါင်းစပ်ရန် တိုးတက်ပြောင်းလဲလာသည့် မော်ဒယ်တစ်ခု ပေါ်ပေါက်လာခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် အမများကို နောက်ထပ်မိတ်လိုက်ရန် အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို လျော့ကျစေခြင်းဖြင့် မိဘဖြစ်မှုကို အာမခံသည့် အထီးသီးသန့်ပြုပြင်ထားသော ecdysone တစ်ခုဖြစ်သည်။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ဤငှက်ဖျားရောဂါပိုးသယ်ဆောင်သူများသည် အထီးသီးသန့် EPP ၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာလွှဲပြောင်းမှုကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် အမများတွင် 3D20E ကို အသက်ဝင်စေရန် ထိရောက်သောစနစ်တစ်ခုကိုလည်း တိုးတက်ပြောင်းလဲလာခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သိရှိသလောက်၊ ဤသည်မှာ အင်းဆက်ပိုးမွှားများတွင် ထူးခြားပြီး အရေးကြီးသောလုပ်ဆောင်ချက်ကို လုပ်ဆောင်သည့် အထီးနှင့် အမများလွှမ်းမိုးသော စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းစနစ်၏ ပထမဆုံးဥပမာဖြစ်သည်။ အထီးသီးသန့် ecdysone လုပ်ဆောင်ချက်ကို တင်ပြထားသော်လည်း အတိအကျ သရုပ်မပြထားပါ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ အများအားဖြင့် ငြင်းဆိုထားသော ယူဆချက် ၁၈ မှာ ဤလုပ်ဆောင်ချက်များကို 20E ရှေ့ပြေး E1 မှ လုပ်ဆောင်နိုင်သည်ဟူသော ယူဆချက်ဖြစ်သည်။ Drosophila တွင်၊ monandry သည် သတ်မှတ်ထားသော လိင် peptide receptors21,22 မှတစ်ဆင့် အမမျိုးပွားလမ်းကြောင်းကို လှုံ့ဆော်ပေးသော အာရုံကြောဆဲလ်များနှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိသော လိင် peptide ငယ်များ19,20 ၏ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာလွှဲပြောင်းမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာကြောင်း လူသိများသည်။ အောက်ပိုင်းကို ဆုံးဖြတ်ရန် နောက်ထပ်အလုပ် လိုအပ်ပါသည် A. gambiae အမများတွင် 3D20E မှ ထိန်းချုပ်ထားသော အချက်ပြရေတံခွန်များနှင့် ဤရေတံခွန်များကို ခြင်များနှင့် Drosophila များအကြားတွင် ထိန်းသိမ်းနိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်။
ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော အမျိုးသမီး မျိုးပွားနိုင်စွမ်းနှင့် အပြုအမူတွင် 3D20E ၏ အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင် 3D20E ပေါင်းစပ်မှုနှင့် အသက်ဝင်မှုသို့ ဦးတည်စေသော လမ်းကြောင်းများသည် အနာဂတ်ခြင်ထိန်းချုပ်ရေး မဟာဗျူဟာများအတွက် အခွင့်အလမ်းအသစ်များကို ပေးဆောင်ပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့် ပိုးမွှားနည်းပညာ မဟာဗျူဟာများတွင် ယှဉ်ပြိုင်နိုင်သော မျိုးမအောင်သော အထီးများကို မျိုးဆက်ပေးခြင်းကဲ့သို့သော ခြင်ထိန်းချုပ်ရေး မဟာဗျူဟာများ။ သဘာဝအတိုင်း လွှတ်ရန် သို့မဟုတ် အပျိုဖော်ဝင်ကစားခြင်းတွင် 3D20E ကို တုပရန် အသုံးပြုခြင်း။ A. gambiae နှင့် အခြား Cellia မျိုးစိတ်များသည် ၎င်းတို့၏ သုက်ရည်များကို မိတ်လိုက်အဖုများထဲသို့ ခဲစေနိုင်သည့် စွမ်းရည်ကို ရရှိသောအခါ 3D20E ၏ အထီးသီးသန့်လုပ်ဆောင်ချက်သည် ဟော်မုန်းအမြောက်အမြားနှင့် ဟော်မုန်းအသက်ဝင်စေသော အင်ဇိုင်းများကို ထိရောက်စွာ လွှဲပြောင်းနိုင်စေသောကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်။ အပြန်အလှန်အားဖြင့် monandry ကို အကောင်အထည်ဖော်သည့် 3D20E ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်သည် အမများအတွက် (MISO မြင့်မားစွာဖော်ပြခြင်းဖြင့်) ငှက်ဖျားရောဂါပျံ့နှံ့မှု မြင့်မားသောနေရာများတွင် ၎င်းတို့၏ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို မြှင့်တင်ရန် ယန္တရားတစ်ခုကို ပံ့ပိုးပေးပြီး Plasmodium ကူးစက်မှုကို သွယ်ဝိုက်သောနည်းဖြင့် ပံ့ပိုးပေးသည်။ အမ 20E သည် အမ Anopheles ခြင်များတွင် P. falciparum ၏ ရှင်သန်မှုနှင့် ကြီးထွားမှုကို နက်ရှိုင်းစွာ အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသထားသောကြောင့်၊ 24 အထီးနှင့် အမ စတီးရွိုက်ဟော်မုန်းလမ်းကြောင်းများသည် ခြင်နှင့် ကပ်ပါးကောင် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု၏ အဓိကရှုထောင့်များ ဖြစ်လာပါသည်။
A. gambiae G3 မျိုးကွဲများကို စံအင်းဆက်အခြေအနေများ (၂၆-၂၈ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်၊ ဆွေမျိုးစိုထိုင်းဆ ၆၅-၈၀%၊ အလင်း/မှောင်ချိန် ၁၂:၁၂ နာရီ) အောက်တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။ ပိုးလောင်းများကို ငါးမှုန့်အစာ (TetraMin Tropical Flakes၊ Koi Pellets နှင့် Tetra Pond Sticks ကို ၇:၇:၂ အချိုးဖြင့်) ကျွေးခဲ့သည်။ အရွယ်ရောက်ခြင်များကို ad libitum ၁၀% dextrose solution နှင့် အပတ်စဉ် လူ့သွေး (လေ့လာမှုသွေးအစိတ်အပိုင်းများ) ကျွေးခဲ့သည်။ အပျိုစင်ခြင်များကို အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် အဖျားများကို စစ်ဆေးပြီးနောက် ပိုးအိမ်အဆင့်တွင် အထီးအမများကို ခွဲခြားခြင်းဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ DsRed transgene သယ်ဆောင်သော အထီးများကို ယခင်က ဖော်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည်။
အတင်းအကျပ် မိတ်လိုက်ခြင်း စမ်းသပ်ချက်များကို ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့် လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအတိုင်း ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ သဘာဝအတိုင်း မိတ်လိုက်ရန်အတွက် ၄ ရက်သား အပျိုစင်အမများကို လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ ရင့်ကျက်သော အပျိုစင်အထီးများနှင့် ၁:၃ အချိုးဖြင့် နှစ်ညကြာ ထားခဲ့သည်။ အထီးများကို dsEPP ထိုးသွင်းသည့် စမ်းသပ်ချက်များအတွက်၊ ပူးတွဲလှောင်အိမ်ဖွဲ့ခြင်းသည် ထိုးသွင်းပြီး ၃-၄ ရက်အကြာတွင် ဖော့စဖာတေ့စ် လှုပ်ရှားမှုကို အမြင့်ဆုံး တိတ်ဆိတ်စေသည့်အချိန်နှင့် တိုက်ဆိုင်ခဲ့သည် (Extended Data Fig. 2b)။
ခြင်တစ်ရှူးများ၊ ကျန်ရှိနေသော အလောင်းများ (ခန္ဓာကိုယ်၏ ကျန်အပိုင်း) သို့မဟုတ် ခန္ဓာကိုယ်တစ်ခုလုံးကို 100% မီသနောအဖြစ် ခွဲစိတ်ပြီး beader (2 mm ဖန်အလုံးများ၊ 2,400 rpm၊ 90 sec) ဖြင့် homogenized လုပ်ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးပမာဏနှင့် မီသနော ပမာဏများမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်- ခန္ဓာကိုယ်၏ ကျန်အပိုင်း၊ 1,000 µl တွင် 50; MAG၊ 50–100 80 µl; အမ LRT၊ 25–50 80 µl။ အနည်အနှစ်ကို မီသနော ပမာဏတူဖြင့် ဒုတိယအကြိမ် ထုတ်ယူခဲ့သည်။ ဆဲလ်အပျက်အစီးများကို centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထုတ်ယူမှုနှစ်ခုလုံးမှ မီသနောကို ပေါင်းစပ်ပြီး နိုက်ထရိုဂျင်စီးဆင်းမှုအောက်တွင် အခြောက်ခံပြီးနောက် ရေတွင် 80% မီသနော ပမာဏများတွင် ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်- ခန္ဓာကိုယ်၏ ကျန်အပိုင်း၊ 50 µl; MAGs နှင့် အမ LRT၊ 30 µl။
နမူနာများကို LC ကိရိယာ (Vanquish၊ Thermo Fisher) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော mass spectrometer (ID-X၊ Thermo Fisher) တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ နမူနာ ၅ µl ကို ၂၅°C တွင်ထိန်းသိမ်းထားသော ၃ µm၊ ၁၀၀ × ၄.၆ mm ကော်လံ (Inspire C8၊ Dikma) ပေါ်သို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ LC အတွက် ရွေ့လျားအဆင့်များမှာ A (ရေ၊ ၀.၁% ဖော်မစ်အက်ဆစ်) နှင့် B (အက်စီတိုနိုက်ထရိုက်၊ ၀.၁% ဖော်မစ်အက်ဆစ်) တို့ဖြစ်သည်။ LC gradient မှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်- ၁ မိနစ်အတွက် ၅% B၊ ထို့နောက် ၁၁ မိနစ်အတွင်း ၁၀၀% B အထိ တိုးမြှင့်ခဲ့သည်။ ၁၀၀% တွင် ၈ မိနစ်ကြာပြီးနောက်၊ ကော်လံကို ၅% B တွင် ၄ မိနစ်ပြန်လည်ချိန်ညှိပါ။ စီးဆင်းမှုနှုန်းမှာ 0.3 ml min-1 ဖြစ်သည်။ MS ရင်းမြစ်တွင် ionization ကို positive နှင့် negative mode များတွင် အပူပေးထားသော electrospray ionization ဖြင့် ပြီးမြောက်သည်။
mass spectrometer သည် full MS mode တွင် 60,000 resolution ဖြင့် 350 မှ 680 အထိ m/z အတိုင်းအတာရှိ data များကို တိုင်းတာသည်။ MS/MS data ကို [M + H]+ (all targets)၊ [M - H2O + H]+ (all targets) နှင့် [M - H]- (phosphorylated targets) တို့တွင် ရယူခဲ့သည်။ စံမမီသော targets များ၏ ecdysone ဂုဏ်သတ္တိများကို အတည်ပြုရန် MS/MS data ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ target မဟုတ်သော ecdysteroids များကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက်၊ >15% relative abundance ရှိသော HPLC peaks အားလုံးအတွက် MS/MS data ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ သန့်စင်သော standard curves (20E, 3D20E) မှ ဖန်တီးထားသော standard curves များကို အသုံးပြု၍ ပမာဏသတ်မှတ်ပြီး သီးခြားနမူနာတစ်ခု (အခြား targets အားလုံး) ၏ absolute amounts သို့မဟုတ် dilution များကို တွက်ချက်ကာ အထီးတစ်ဦးတွင်တွေ့ရှိရသော amounts နှင့် ညီမျှမှုကို တွက်ချက်သည်။ 3D20E အတွက်၊ အောက်ပါ adducts များ၏ ပေါင်းလဒ်ကို အသုံးပြု၍ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်- [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Tracefinder (ဗားရှင်း 4.1) ကို အသုံးပြု၍ အချက်အလက်များကို ထုတ်ယူပြီး ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ MS/MS အချက်အလက်များကို Xcalibur (ဗားရှင်း 4.4) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ E၊ 20E နှင့် 3D20E တို့၏ MS ရောင်စဉ်များကို သက်ဆိုင်ရာစံနှုန်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်။ 3D20E22P ကို ​​Girard's reagent ဖြင့် derivatization ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ 20E22P ကို ​​m/z အချိုးဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
3D20E22P ကို ​​MAG မှ သန့်စင်ခဲ့သည်။ HPLC-MS/MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကဲ့သို့ LC အခြေအနေများအောက်တွင် quadrupole mass-based detector (QDa, Acquity, Waters) ပါသော ultra-performance liquid chromatograph (Acquity, Waters) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတိုင်းအတာဖြင့် သန့်စင်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ 3D20E22P နှင့် ကိုက်ညီသော m/z ကို ယခင်က ဆုံးဖြတ်ထားသည့် ထိန်းသိမ်းမှုအချိန်တွင် တွေ့ရှိသောအခါ Fraction collection ကို စတင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ထုတ်ယူထားသော ဒြပ်ပေါင်းများ၏ သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှုကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း HPLC-MS/MS ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။
ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များကို လိုက်နာ၍ TRI reagent (Thermo Fisher) ကို အသုံးပြု၍ မျိုးပွားတစ်ရှူး ၁၀-၁၂ ခု သို့မဟုတ် ခန္ဓာကိုယ်၏ အခြားအစိတ်အပိုင်းများ (ခေါင်းမပါ) မှ စုစုပေါင်း RNA ကို ထုတ်ယူခဲ့သည်။ RNA ကို TURBO DNase (Thermo Fisher) ဖြင့် ကုသခဲ့သည်။ cDNA ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များကို လိုက်နာ၍ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) အတွက် primers များကို ယခင်က ထုတ်ဝေခဲ့သည် ၂၄ သို့မဟုတ် Primer-BLAST၂၆ ကို အသုံးပြု၍ ဒီဇိုင်းထုတ်ခဲ့ပြီး အရွယ်အစား 70-150 bp နှင့် spanning exon-exon junctions သို့မဟုတ် Primer pair primers များကို ဦးစားပေးခဲ့သည်။ exons များကို သီးခြားစီခွဲထားသည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်တူပြုမှု သုံးခုမှ လေးခုမှ cDNA နမူနာများကို RT-qPCR အတွက် ရေတွင် လေးဆရောစပ်ခဲ့သည်။ 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher)၊ primers များနှင့် ရောစပ်ထားသော cDNA ၅ µl ပါဝင်သော 15 µl ထပ်တူပြုတုံ့ပြန်မှုများတွင် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဓာတ်ပြုမှုများကို a ပေါ်တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ QuantStudio 6 Pro real-time PCR စနစ် (Thermo Fisher) နှင့် အချက်အလက်များကို Design and Analysis (ဗားရှင်း 2.4.3) ကို အသုံးပြု၍ စုဆောင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင် ပြသထားသည့်အတိုင်း၊ ဆွေမျိုးပမာဏများကို ရိုင်ဘိုဆိုမ် မျိုးဗီဇ RpL19 (AGAP004422) သို့ ပုံမှန်ဖြစ်စေခဲ့ပြီး၊ ၎င်း၏ ဖော်ပြမှုသည် သွေးကျွေးခြင်း 27 သို့မဟုတ် မိတ်လိုက်ခြင်း 3 နှင့်အတူ သိသိသာသာ မပြောင်းလဲပါ။
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ကို အသုံးပြု၍ RNA အရည်အသွေးကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။ Illumina paired-end libraries များကို MIT နှင့် Harvard ရှိ Broad Institute တွင် ပြင်ဆင်ပြီး လည်ပတ်ခဲ့သည်။ Sequencing read များကို default parameters များပါရှိသော HISAT2 (version 2.0.5) ကို အသုံးပြု၍ A. gambiae genome (PEST strain, version 4.12) နှင့် ချိန်ညှိခဲ့သည်။ mapping quality (MAPQ) scores <30 ရှိသော read များကို Samtools (version 1.3.1) ကို အသုံးပြု၍ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ genes များသို့ map လုပ်ထားသော read အရေအတွက်ကို default parameters များပါရှိသော htseq-count (version 0.9.1) ကို အသုံးပြု၍ ရေတွက်ခဲ့သည်။ Normalized read count များကို တွက်ချက်ခဲ့ပြီး differential gene expression ကို R (version 4.0.3) ရှိ DESeq2 package (version 1.28.1) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
Ecdysone ပြုပြင်ထားသော မျိုးဗီဇကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကို PSI-BLAST algorithm (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ကို အသုံးပြု၍ A. gambiae genome ကို ဦးစွာရှာဖွေခြင်းဖြင့်၊ အောက်ပါ query protein sequences များပါရှိသော default values ​​Parameters များကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်- Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1)၊ Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1၊ XP_005175332.1 နှင့် XP_011294434.1) နှင့် Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 နှင့် XP_008552645.1) မှ EcK။ B. mori (Accession No. NP_001036900)၊ Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202)၊ Apis mellifera မှ EcK။ (Action No. XP_394838) နှင့် Acyrthosiphon pisum (Action No. XP_001947166)။ နှင့် B. mori (Action No. XP_001947166) NP_001177919.1 နှင့် NP_001243996.1) မှ EPP နှင့် D. melanogaster (Action No. NP_572986.1) ၏ EO (အဆင့် 1)။ ထို့နောက်၊ ဂမ်ဘီယာနိုင်ငံရှိ မျိုးပွားတစ်ရှူး (female LRT သို့မဟုတ် MAG) ရှိ မြင့်မားသော mRNA expression (>100 fragments/kilobase exons per million mapped reads (FPKM) သို့မဟုတ် >85%) ကို အခြေခံ၍ hits များကို filter လုပ်ပါ (အဆင့် 2)။ တိကျမှုကို မြှင့်တင်ရန်အတွက်၊ မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း ecdysone ကို မပေါင်းစပ် သို့မဟုတ် လွှဲပြောင်းပေးသော anopheles မျိုးစိတ်ဖြစ်သည့် A. albimanus ၏ မျိုးပွားတစ်ရှူးတွင်လည်း ဖော်ပြထားသော ကိုယ်စားလှယ်လောင်း အင်ဇိုင်းများကို ကျွန်ုပ်တို့ ရွေးချယ်ခဲ့ပါသည်။ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း မျိုးဗီဇများကို A. albimanus မျိုးပွားတစ်ရှူးတွင် ဖော်ပြမှုနည်းခြင်း (<100 FPKM သို့မဟုတ် <85th percentile) အပေါ် အခြေခံ၍ စစ်ထုတ်ခဲ့သည် (အဆင့် 3)။ နောက်ဆုံး စစ်ထုတ်မှု (အဆင့် 4)၊ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း မျိုးဗီဇများသည် အောက်ပါတို့မှ အနည်းဆုံးတစ်ခုကို ဖြည့်ဆည်းရန် လိုအပ်သည်- (1) ကွဲပြားစွာ ဖော်ပြထားသော မျိုးဗီဇများ၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ မိတ်လိုက်ပြီးနောက် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာခြင်း (P < 0.05) နှင့် (2) မျိုးပွားခြင်းမရှိသော တစ်ရှူးများတွင် (< 85 % သို့မဟုတ် <100 FPKM)။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သော နည်းလမ်း ၂၈၊ ၂၉၊ ၃၀ ကို ပြုပြင်မွမ်းမံခဲ့ပြီး သက်ရှိတစ်ခုလုံးအတွက် အိုင်ဆိုတိုပစ် အညွှန်းကပ်ခြင်းကို ရရှိစေခဲ့ပါသည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် wild-type Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) ကို yeast nitrogen base (BD Difco, DF0335) တွင် (wt/vol) ၂% glucose (G7528, Sigma)၊ ၁.၇% amino acid ကင်းစင်ပြီး ammonium sulfate (culture medium) နှင့် ၅% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ပါဝင်သော စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ yeast ကို centrifugation ဖြင့် ပြန်လည်ရယူခဲ့ပြီး ခြင်လောင်းများကို သားပေါက်သည်အထိ ad libitum ကျွေးခဲ့သည်။ စတုတ္ထအဆင့်သေဆုံးမှုကို ကာကွယ်ရန် ငါးမှုန့် (သားလောင်း ၃၀၀ လျှင် ၀.၅ မီလီဂရမ်) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် မိတ်လိုက်စဉ်အတွင်း လွှဲပြောင်းပေးထားသော အထီး proteome ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် အမများကိုသာ အသုံးပြုခဲ့သည်။
၄-၆ ရက်သားအရွယ် 15N အညွှန်းတပ်ထားသော အပျိုစင်ငါးမများကို အသက်အရွယ်တူ အညွှန်းမတပ်ထားသော အပျိုစင်ငါးဖိုများနှင့် မိတ်လိုက်ရန် အတင်းအကျပ်ခိုင်းစေခဲ့သည်။ epifluorescence မိုက်ခရိုစကုပ်အောက်တွင် မိတ်လိုက်ပလပ်များကို ရှာဖွေခြင်းဖြင့် အောင်မြင်စွာ မိတ်လိုက်နိုင်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ ၃၊ ၁၂ နှင့် ၂၄ hpm တွင် မိတ်လိုက်ထားသော ငါးမ ၄၅-၅၅ ကောင်၏ atria ကို အမိုးနီယမ်ဘိုင်ကာဗွန်နိတ်ဘာဖာ (pH 7.8) ၅၀ µl ထဲသို့ ခွဲစိတ်ပြီး ပစ္စတယ်ဖြင့် ရောနှောစေခဲ့သည်။ homogenate ကို centrifuge လုပ်ကာ supernatant ကို 50 mM အမိုးနီယမ်ဘိုင်ကာဗွန်နိတ်တွင် 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ၅၀ µl နှင့် ရောနှောခဲ့သည်။ နမူနာတစ်ခုစီမှ supernatant နှင့် pellet ကို ခြောက်သွေ့သောရေခဲပေါ်တွင် snap frozen လုပ်ပြီး ဝါရှင်တန်တက္ကသိုလ်ရှိ MacCoss ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ တစ်ညလုံးပို့ဆောင်ခဲ့ပြီး LC-MS/MS အတွက် နမူနာပြင်ဆင်မှုပြီးစီးခဲ့သည်။ pellet ကို 50 mM အမိုးနီယမ်တွင် 0.1% RapiGest ၅၀ µl တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပါ။ ရေချိုးကန်ထဲတွင် bicarbonate နှင့် sonicate ထည့်ပါ။ pellet နှင့် supernatant ၏ပရိုတင်းပါဝင်မှုကို BCA assay ဖြင့်တိုင်းတာခဲ့ပြီး၊ နမူနာများကို 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma) ဖြင့်လျှော့ချကာ၊ 15 mM iodoacetamide (Sigma) ဖြင့် alkylated လုပ်ကာ 37 °C (1:0 50) တွင် trypsinization: trypsin:substrate ratio ဖြင့် 1 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ RapiGest ကို 200 mM HCl ထည့်ခြင်းဖြင့် lysed လုပ်ပြီးနောက် 37 °C တွင် 45 မိနစ်ကြာ incubation နှင့် 4 °C တွင် 10 မိနစ်ကြာ 14,000 rpm ဖြင့် centrifugation လုပ်ခြင်းဖြင့် အညစ်အကြေးများကိုဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နမူနာများကို dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) ဖြင့်ဆေးကြောပြီး 0.1% formic acid တွင် 0.33 µg µl-1 ၏နောက်ဆုံးပရိုတင်းပါဝင်မှုအတွက်ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်။ အညွှန်းမတပ်ထားသော MAG proteomes များကို virgin male များမှ အလားတူခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမိတ္တူနှစ်ခု နမူနာတစ်ခုစီအတွက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထို့နောက် Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) နှင့် 180-minute liquid chromatography တို့ဖြင့်ထုပ်ပိုးထားသော 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) frit trap ပါသည့် 25-cm fused silica 75-μm column ကို အသုံးပြု၍ တစ်ခုချင်းစီ၏ 1 µg ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ နမူနာ digests – MS/MS ကို nanoACQUITY UPLC System (Waters) ပါသော Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ လုပ်ဆောင်မှုတစ်ခုစီအတွက် ထုတ်လုပ်ထားသော data-related acquisition data များကို Proteowizard (version 3.0.20287) ကို အသုံးပြု၍ Comet31 (version 3.2) ကို အသုံးပြု၍ Anopheles gambiae (VectorBase version 54)၊ Anopheles coluzzi မှ protein sequences များပါ၀င်သည့် FASTA database နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ mzML format သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ Mali-NIH (VectorBase version 54)၊ Saccharomyces cerevisiae (Uniprot၊ မတ်လ ၂၀၂၁)၊ A. gambiae RNA-seq နှင့် သိရှိထားသော human contaminations များ၏ three-frame translations တို့တွင် ရှာဖွေမှုတစ်ခု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Peptide map-matched FDR များကို Percolator32 (version 3.05) ကို အသုံးပြု၍ 0.01 threshold ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး peptides များကို Limelight33 (version) တွင် protein parsimony ကို အသုံးပြု၍ protein identifications များအဖြစ် စုစည်းခဲ့သည်။ ၂.၂.၀)။ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီတွင် ပရိုတင်းတစ်ခုစီအတွက် တွက်ချက်ထားသော ပုံမှန်ရောင်စဉ်ကြွယ်ဝမှုအချက် (NSAF) ကို အသုံးပြု၍ ဆွေမျိုးပရိုတင်းပေါများမှုကို ခန့်မှန်းခဲ့သည်။ ပရိုတင်းတစ်ခုစီနှင့် ဆက်စပ်သော NSAF ကို မတူညီသော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူနှစ်ခုမှ နမူနာများတွင် ပျမ်းမျှထားခဲ့သည်။ 15N အညွှန်းကပ်ခြင်းသည် အမပရိုတိန်းကို အောင်မြင်စွာဖုံးကွယ်ထားနိုင်သော်လည်း၊ အညွှန်းကပ်ထားသော အပျိုစင်များမှ အညွှန်းမကပ်ထားသော ပရိုတိန်းအနည်းငယ်ကို တွေ့ရှိနိုင်သည်။ HPLC “သယ်ဆောင်သွားခြင်း” ၏ရလဒ်အနေဖြင့် အထီး/မိတ်လိုက်နမူနာများပြီးနောက် အပျိုစင်နမူနာများကို လုပ်ဆောင်သည့် နည်းပညာဆိုင်ရာစမ်းသပ်မှုများတွင်သာ အပျိုစင်နမူနာများတွင် အထီးပရိုတိန်းလျော့ကျမှု (1-5 spectra) ကို ကျွန်ုပ်တို့ မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ အညွှန်းကပ်ထားသော အပျိုစင်များမှ 'ညစ်ညမ်းမှုများ' အဖြစ် ရံဖန်ရံခါတွေ့ရှိရသော ပရိုတိန်းများကို နောက်ဆက်တွဲဇယား ၁ တွင် ဖော်ပြထားသည်။
Genscript တွင် QTTDRVAPAPDQQQ (isotype PA အတွင်း) နှင့် MESDGTTPSGDSEQ (isotype PA နှင့် PB အတွင်း) ဟူသော antigenic peptide နှစ်ခုကို ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် carrier protein KLH နှင့် ပေါင်းစပ်ကာ နယူးဇီလန်ယုန်များထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ စတုတ္ထအကြိမ်ထိုးပြီးနောက် ယုန်များကို သတ်ခဲ့ပြီး total IgG ကို affinity purification ဖြင့် ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ EPP-specific ယုန်မှ IgG ကို နောက်ထပ် western blotting အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။
western blots အတွက်၊ n သည် ဇီဝဗေဒအရ လွတ်လပ်သော ခြင်နမူနာအရေအတွက်ကို ကိုယ်စားပြုသည်) နှင့် ၄ ရက်သားအရွယ် အပျိုစင်ခြင်ထီးများနှင့် အပျိုစင် သို့မဟုတ် အတင်းအကြပ်မိတ်လိုက်သော ခြင်မများ (<10 post-mating) မှ အမ LRT (n = 30)၊ Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) ကို သီးခြားစီထည့်သွင်းခဲ့သည်။ beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sec) ဖြင့် ခွဲစိတ်ပြီးနောက် နမူနာများကို ချက်ချင်း homogenized လုပ်ခဲ့သည်။ မပျော်ဝင်နိုင်သော အပျက်အစီးများကို ၄°C တွင် 20,000 g တွင် centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ Bradford assay (Bio-Rad) ဖြင့် ပရိုတင်းများကို ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် MAG ပရိုတင်း 20 µg၊ LRT ပရိုတင်း 40 µg နှင့် ကျန်ရှိသော bulk protein 20 µg တို့ကို MOPS buffer ကို အသုံးပြု၍ 10% Bis-Tris NuPAGE ဖြင့် denatured ဖြစ်ပြီး ခွဲထုတ်ထားသည်။ iBlot2 transfer system (Thermo Fisher) ကို အသုံးပြု၍ polyvinylidene fluoride အမြှေးပါးများထဲသို့ ပရိုတင်းများကို လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။ အမြှေးပါးများကို 1× PBS-T (PBS တွင် 0.1% Tween-20) တွင် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက် Odyssey blocking buffer (Li-Cor) တွင် 22°C တွင် 1 နာရီကြာ ပိတ်ဆို့ခဲ့သည်။ အမြှေးပါးများကို custom rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (blocking buffer တွင် 1:700) နှင့် rat anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000) ဖြင့် 4°C တွင် တစ်ညလုံး လှုပ်ခါခဲ့သည်။ အမြှေးပါးများကို PBS-T ဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက် 0.01% SDS နှင့် 0.2% Tween-20 ပါဝင်သော blocking buffer တွင် ဒုတိယ antibodies (donkey anti-rabbit 800CW နှင့် goat anti-rat 680LT (Li-Cor)၊ နှစ်ခုစလုံး 1:20,000) ဖြင့် incubation လုပ်ခဲ့သည်။ ၂၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁ နာရီကြာအောင်ထားပါ။ အမြှေးပါးများကို PBS-T ဖြင့်ဆေးကြောပြီး Odyssey CLx စကင်နာဖြင့် ရုပ်ပုံဖော်ခဲ့သည်။ ပုံများကို Image Studio (ဗားရှင်း 5.2) တွင် စုဆောင်းပြီး ပြုပြင်ခဲ့သည်။ EPP-RA isoform (82 kDa) နှင့် ကိုက်ညီသော သီးခြား band ကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ။
EPP ၏ coding regions များ (histidine phosphatase domain ပါဝင်သော isoform AGAP002463-RB အနေဖြင့်၊ NCBI conserved domain search 34) နှင့် EcK2 (AGAP002181) ကို pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma) ထဲသို့ clone ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပရိုင်းမာများကို Extended Data Table 2 တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။ pET-21a(+)-EcK2 တည်ဆောက်မှု၏ C-terminal 6xHis tag မတိုင်မီ GS4 linker ရှစ်ခု (tandem) ကို ထည့်သွင်းထားပါသည်။ Recombinant ပရိုတင်းများကို NEBExpress cell-free E. coli ပရိုတင်းပေါင်းစပ်မှုတုံ့ပြန်မှု (New England BioLabs) ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့ပါသည်။ Recombinant ပရိုတင်းများကို NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs) ကို အသုံးပြု၍ သန့်စင်ခဲ့ပါသည်။ Dihydrofolate reductase (DHFR) control ပရိုတင်းကို NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit မှ DNA template ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့ပါသည်။ ပရိုတင်းများကို PBS ရှိ 50% glycerol တွင် -20 °C တွင် 3 လအထိ သိမ်းဆည်းထားပါသည်။
EPP နှင့် တစ်ရှူးထုတ်ယူမှုများ၏ Phosphatase လှုပ်ရှားမှုကို 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich) ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ ဓာတ်ပြုမှုဘာဖာတွင် 25 mM Tris၊ 50 mM acetic acid၊ 25 mM Bis-Tris၊ 150 mM NaCl၊ 0.1 mM EDTA နှင့် 1 mM DTT တို့ ပါဝင်သည်။ တစ်ရှူးကို ဓာတ်ပြုမှုဘာဖာတွင် homogenized လုပ်ခဲ့ပြီး ဆဲလ်အပျက်အစီးများကို centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ 2.5 mg ml-1 pNPP ပါဝင်သော ဓာတ်ပြုမှုဘာဖာသို့ အင်ဇိုင်း သို့မဟုတ် တစ်ရှူးထုတ်ယူမှုကို ထည့်ခြင်းဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို စတင်ပါ။ ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှောကို အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ထားခဲ့ပြီး pNPP မှ ပြောင်းလဲလာသော pNP ပမာဏကို အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် 405 nm တွင် absorbance ကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။
in vitro EcK လုပ်ဆောင်ချက်အတွက်၊ ပရိုတင်းကို 0.2 mg 20E သို့မဟုတ် 3D20E ဖြင့် 10 mM HEPES–NaOH၊ 0.1% BSA၊ 2 mM ATP နှင့် 10 mM MgCl2 ပါဝင်သော 200 µl buffer (pH 7.5) တွင် 27°C တွင် 2 နာရီကြာ ထားခဲ့သည်။ မီသနော 800 µl ထည့်ခြင်းဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို ရပ်တန့်ပြီးနောက် -20°C တွင် 1 နာရီကြာ အအေးခံပြီးနောက် 4°C တွင် 20,000 g တွင် 10 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် supernatant ကို HPLC-MS/MS ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့တွင် အသုံးပြုသော ပရိုတင်းများကို အပူပေးပြီး အသက်မဝင်စေရန်၊ ပရိုတင်းများကို PBS ရှိ 50% glycerol တွင် 95°C တွင် 20 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။
in vitro EPP လုပ်ဆောင်ချက်အတွက်၊ ပရိုတင်းကို 3D20E22P (HPLC-MS/MS ဖြင့် သန့်စင်ထားသော MAG အတွဲ ၁၈ တွဲတွင် တွေ့ရှိရသော ပမာဏနှင့် ညီမျှသည်) ဖြင့် 25 mM Tris၊ 50 mM acetic acid၊ 25 mM Bis-Tris၊ 150 mM NaCl၊ 0.1 mM EDTA နှင့် 1 mM DTT တို့ပါဝင်သော 100 µl buffer (pH 7.5) တွင် 27°C တွင် 3 နာရီကြာ ထားခဲ့သည်။ 400 µl methanol ကိုထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို ရပ်တန့်ခဲ့ပြီး -20°C တွင် 1 နာရီကြာ အအေးခံပြီးနောက် 4°C တွင် 20,000 g တွင် 10 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ supernatant ကို HPLC-MS/MS ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
EPP (362 bp)၊ EcK1 (AGAP004574၊ 365 bp) နှင့် EcK2 (556 bp) အတွက် PCR အပိုင်းအစများကို ရောနှောလိင်ခေါင်းမဲ့ခြင်အလောင်းများမှပြင်ဆင်ထားသော cDNA မှ ချဲ့ထွင်ခဲ့သည်။ eGFP ထိန်းချုပ်မှု၏ PCR အပိုင်းအစ (495 bp) ကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သော pCR2.1-eGFP မှ ချဲ့ထွင်ခဲ့သည်။ PCR primers များကို Extended Data Table 2 တွင် ဖော်ပြထားသည်။ PCR fragment ကို pL4440 plasmid ရှိ inverted T7 promoters များကြားတွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ Plasmid constructs များကို NEB 5-α တွင်ပါဝင်သော E. coli (New England Biolabs) မှ ပြန်လည်ရယူခဲ့ပြီး အသုံးမပြုမီ DNA sequencing ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည် (insert sequence အတွက် Supplementary Data 1 ကိုကြည့်ပါ)။ T7 promoter နှင့် ကိုက်ညီသော primers များကို pL4440-based plasmid မှ insert ကို ချဲ့ထွင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ PCR ထုတ်ကုန်အရွယ်အစားကို agarose gel electrophoresis ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။ dsRNA ကို Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ကိုအသုံးပြု၍ PCR templates မှ ကူးယူခဲ့ပြီး ယခင်ကဖော်ပြထားသော ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း သန့်စင်ခဲ့သည်။
dsRNA ထိုးသွင်းရန်အတွက်၊ ပျံ့နှံ့ပြီး ၁ ရက်အတွင်း အရွယ်ရောက်ပြီးသော အထီး သို့မဟုတ် အမ (Nanoject III, Drummond) ၏ ရင်ခေါင်းထဲသို့ dsRNA (dsGFP၊ dsEcK1၊ dsEcK2၊ dsEPP) ၁,၃၈၀ ng ကို 10 ng nl-1 ပြင်းအားဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ အနည်းဆုံး ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်တူပြုမှုသုံးခုတွင် မျိုးဗီဇ knockdown အဆင့်များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ecdysone ထိုးသွင်းရန်အတွက်၊ ၄ ရက်သား အပျိုစင် သို့မဟုတ် ၆ ရက်သား အပျိုစင်သွေးစုပ် အမများကို စမ်းသပ်မှုဒီဇိုင်း သို့မဟုတ် 6.3 ng nl-1 ပြင်းအားပေါ်မူတည်၍ 20E သို့မဟုတ် 3D20E (Nanoject III, Drummond) 0.13၊ 0.21 သို့မဟုတ် 0.63 µg ကို 1.3၊ 2.1 ပြင်းအားဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ရေတွင် 10% (vol/vol) အီသနော 100 nl ထိုးသွင်းပါ။ ၁၀% အီသနောတွင် 3D20E22P ၁၀၀ nl (MAG တစ်စုံတွင်တွေ့ရှိရသောပမာဏ၏ ၇၅% နှင့်ညီမျှသည်) ဖြန်းထားသည်။ ခြင်များကို ထိုးဆေးအုပ်စုသို့ ကျပန်းခွဲဝေပေးခဲ့သည်။
ဥဥခြင်းစမ်းသပ်မှုအတွက် ၃ ရက်သားအရွယ် အမများကို လူ့သွေးဖြင့် အလိုအလျောက်တိုက်ကျွေးခဲ့သည်။ တစ်ဝက်တစ်ပျက်ကျွေးထားသော သို့မဟုတ် ကျွေးမထားရသေးသော ခြင်များကို ဖယ်ရှားပစ်ခဲ့သည်။ ကုသမှုပေါ် မူတည်၍ အမများကို သွေးအစာစားပြီး အနည်းဆုံး ၄၈ နာရီကြာ လေးညကြာ သီးခြားဥဥခွက်များတွင် ထားခဲ့သည်။ ဥများကို စတီရီယိုစကုပ် (Stemi 508, Zeiss) အောက်တွင် ရေတွက်ခဲ့သည်။ မိတ်လိုက်သော အမများအတွက် လောင်းများအဖြစ် ပေါက်လာသော ဥများကို မျိုးအောင်နိုင်သည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။
မိတ်လိုက်စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ အမများကို ကုသမှုပေါ်မူတည်၍ မိတ်လိုက်ခြင်းကို ခံနိုင်ရည်ရှိလာစေရန် အနည်းဆုံး ၂ ရက်ထားခဲ့ပြီး အသက်အရွယ်တူ အထီးများကို နောက်ပိုင်းတွင် တူညီသောလှောင်အိမ်ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ နှစ်ညအကြာတွင်၊ မျိုးအောင်ပြီးသော အမ အရည်အိတ်များကို ခွဲစိတ်ပြီး genomic DNA ကို 10 mM Tris-HCl၊ 1 mM EDTA နှင့် 25 mM NaCl (pH 8.2) ပါ၀င်သော buffer တွင် freeze-thaw နှင့် sonication ဖြင့် ထုတ်လွှတ်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို Proteinase K (0.86 µg µl-1) ဖြင့် 55°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့ပြီး 95°C တွင် 10 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။ Crude genomic DNA ပြင်ဆင်မှုများကို 10 ဆ ရောစပ်ပြီး Y ခရိုမိုဆုန်းအစီအစဥ်များကို qPCR ဖြင့် ထောက်လှမ်းခဲ့သည်။ primer များကို Extended Data Table 2 တွင် ဖော်ပြထားသည်။ Y ခရိုမိုဆုန်းအစီအစဥ်မရှိခြင်းသည် မိတ်လိုက်ခြင်းမရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
ပြန်လည်မိတ်လိုက်ခြင်းစမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ အတင်းမိတ်လိုက်ထားသော အမများကို မိတ်လိုက်ခြင်းအခြေအနေကို အတည်ပြုရန် မိတ်လိုက်ပလပ်များ ရှိမရှိ စစ်ဆေးခဲ့ပြီး ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း အထီးမရှိချိန်တွင် မိတ်လိုက်ခြင်းကို ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်ပေါ်ရန် ၂ ရက် ခွင့်ပြုခဲ့သည် ၃၆။ DsRed မျိုးဗီဇပြောင်းလဲထားသော သုက်ပိုးသယ်ဆောင်ထားသော အထီးများကို အမလှောင်အိမ်များထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ နှစ်ညအကြာတွင် မျိုးအောင်သော အိတ်ငယ်များကို အမများမှ ခွဲစိတ်ခဲ့ပြီး ဂျီနိုမစ် DNA ကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပြင်ဆင်ခဲ့ပြီး DsRed မျိုးဗီဇ၏ qPCR ရှာဖွေမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပရိုင်းမာများကို တိုးချဲ့ထားသော အချက်အလက်ဇယား ၂ တွင် ဖော်ပြထားသည်။ DsRed မျိုးဗီဇပြောင်းလဲခြင်းမရှိခြင်းက ပြန်လည်မိတ်လိုက်ခြင်းမရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
3D20E ကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း 37 ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် 20E (Sigma-Aldrich) 10 mg ကို ရေ 10 ml တွင်ပျော်ဝင်စေပြီး platinum black 30 mg (အမှုန့်ပုံစံ Sigma-Aldrich) ထည့်သည်။ O2 ကို ညင်သာစွာစီးကျစေပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် မွှေပေးသည်။ 6 နာရီအကြာတွင် ဓာတ်ပြုမှုကိုရပ်တန့်ရန် methanol 30 mL ထည့်သည်။ ဓာတ်ပြုမှုအမှုန်များကိုဖယ်ရှားရန် ရောစပ်ထားသောအရောအနှောကို centrifuge လုပ်သည်။ supernatant ကို အခန်းအပူချိန်တွင် vacuo တွင်ခြောက်သွေ့အောင်အငွေ့ပျံစေသည်။ ခြောက်သွေ့သောဓာတ်ပြုမှုထုတ်ကုန်ကို HPLC-MS/MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်ထိုးသွင်းရန်အတွက် 10% ethanol နှင့် methanol တွင်ပျော်ဝင်စေသည်။ ပြောင်းလဲမှုနှုန်း (20E မှ 3D20E အထိ) သည် 97% ခန့်ရှိသည် (ပုံ 4b)၊ ပေါင်းစပ်ထားသော 3D20E ၏ MS spectrum သည် မိတ်လိုက်အမများတွင်တွေ့ရှိရသောနှုန်းနှင့်ကိုက်ညီသည် (ပုံ 4c)။
အညွှန်းတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သော စာရင်းအင်းစစ်ဆေးမှုများ၏ သီးခြားအသေးစိတ်အချက်အလက်များ ပါဝင်သည်။ GraphPad (ဗားရှင်း 9.0) ကို Fisher's exact test၊ Mantel-Cox test နှင့် Student's t-test တို့ကို လုပ်ဆောင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Cochran-Mantel-Haenszel စစ်ဆေးမှုများကို custom R script (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test တွင် ရရှိနိုင်ပါသည်) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ Shapiro-Wilk စစ်ဆေးမှုကို significance threshold 0.05 ဖြင့် data distribution ကို normality အတွက် စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ data သည် normality test တွင် မအောင်မြင်သောအခါ Mann-Whitney စစ်ဆေးမှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ Survival data ကို Mantel-Cox စစ်ဆေးမှုကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ DESeq2 package (ဗားရှင်း 1.28.1) ကို RNA-seq gene-level differential expression analysis ကို လုပ်ဆောင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဂရပ်ပေါ်ရှိ အလျားလိုက်ဘားသည် median ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ P = 0.05 ၏ significance value ကို စမ်းသပ်မှုအားလုံးအတွက် threshold အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။
လေ့လာမှုဒီဇိုင်းနှင့်ပတ်သက်သည့် နောက်ထပ်အချက်အလက်များအတွက် ဤဆောင်းပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Nature Research Report အနှစ်ချုပ်ကို ကြည့်ပါ။
MS ပရိုတီယိုမစ်ဒေတာကို PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) မှတစ်ဆင့် ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) တွင် dataset identifier PXD032157 ဖြင့် သိမ်းဆည်းခဲ့သည်။
RNA-seq dataset ကို Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) တွင် serial record GSE198665 အောက်တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
လက်ရှိလေ့လာမှုအတွင်း ထုတ်လုပ်ထားသော နှင့်/သို့မဟုတ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသော နောက်ထပ်ဒေတာစုများကို သက်ဆိုင်ရာစာရေးသူများထံမှ ကျိုးကြောင်းဆီလျော်သော တောင်းဆိုမှုအရ ရယူနိုင်ပါသည်။ ဤဆောင်းပါးသည် ရင်းမြစ်ဒေတာကို ပေးပါသည်။
De Loof၊ A. Ecdysteroids: လျစ်လျူရှုထားသော အင်းဆက်လိင်စတီးရွိုက်များ? အထီး: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006)။
Redfern၊ CPF 20-hydroxyecdysone နှင့် Anopheles stephens ရှိ မျိုးဥအိမ်ဖွံ့ဖြိုးမှု။J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982)။