ဆဲလ်အကန့်ခွဲခြင်းနှင့် homeostasis ကိုထိန်းသိမ်းရန်အတွက် secretory pathway တွင် protein sorting လုပ်ခြင်းသည် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သည်။ shell-mediated sorting အပြင်၊ secretory transport လုပ်ငန်းစဉ်တွင် kinesin sorting တွင် lipids ၏အခန်းကဏ္ဍသည် အဖြေမရရှိသေးသော ရှည်လျားသောအခြေခံမေးခွန်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤနေရာတွင်၊ အလွန်ရှည်လျားသော ceramide lipid moieties ပါရှိသော glycosylphosphatidylinositol-immobilized ပရိုတိန်းများကို clustered လုပ်ပြီး specialized endoplasms Net exit site အဖြစ်ခွဲခြားထားကြောင်း in vivo သက်သေပြရန် ကျွန်ုပ်တို့သည် 3D simultaneous multicolor high-resolution real-time imaging ကို လုပ်ဆောင်ပြီး transmembrane ပရိုတိန်းများအသုံးပြုသည့်နေရာနှင့်မတူပါ။ ထို့အပြင်၊ endoplasmic reticulum membrane ရှိ ceramide ၏ chain length သည် ဤ sorting selectivity အတွက် အရေးကြီးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုသည် secretory pathway ရှိ selective export sites များအဖြစ် lipid chain length အပေါ်အခြေခံ၍ protein cargo များကို အမျိုးအစားခွဲခြားရန် ပထမဆုံး direct in vivo အထောက်အထားကို ပေးပါသည်။
eukaryotic ဆဲလ်များတွင်၊ endoplasmic reticulum (ER) တွင် ပေါင်းစပ်ထားသော ပရိုတိန်းများကို ၎င်းတို့၏ သင့်လျော်သော ဆဲလ်ဦးတည်ရာသို့ ပို့ဆောင်ရန်အတွက် secretory pathway မှတစ်ဆင့် သယ်ယူပို့ဆောင်စဉ်အတွင်း စီထားသည် (1)။ အလွှာကြားခံ sorting အပြင်၊ အချို့သော lipids များသည် သီးခြားပရိုတိန်းများ (2-5) ၏ အမြှေးပါးဒိုမိန်းများအဖြစ် ၎င်းတို့ကို အစုအဝေးဖွဲ့ခြင်းဖြင့် ရွေးချယ်ထားသော ထွက်ပေါက်များအဖြစ်လည်း ဆောင်ရွက်နိုင်သည်ဟု ကြာမြင့်စွာကတည်းက ယူဆခဲ့ကြသည်။ သို့သော်၊ ဤဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော lipid-based ယန္တရားကို သက်သေပြရန် တိုက်ရိုက် in vivo အထောက်အထားများ ချို့တဲ့နေဆဲဖြစ်သည်။ ဤအခြေခံပြဿနာကို ဖြေရှင်းရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် yeast တွင် glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) များကို ER မှ မည်သို့ကွဲပြားစွာ ထုတ်ယူသည်ကို လေ့လာခဲ့သည်။ GPI-APs များသည် lipid-connected cell surface proteins အမျိုးမျိုးဖြစ်သည် (6, 7)။ GPI-AP သည် glycolipid moiety (GPI anchor) မှတစ်ဆင့် plasma membrane ၏ အပြင်ဘက် leaflets များနှင့် တွဲထားသော secreted protein တစ်ခုဖြစ်သည်။ ၎င်းတို့သည် ER lumen (8) ရှိ conservative post-translational modifications များအဖြစ် GPI anchors များကို လက်ခံသည်။ တွယ်ဆက်ပြီးနောက်၊ GPI-AP သည် ER မှ plasma membrane သို့ Golgi apparatus (5, 9) မှတစ်ဆင့် ဖြတ်သန်းသွားသည်။ GPI anchors ရှိနေခြင်းကြောင့် GPI-AP ကို ​​transmembrane secretory pathway တစ်လျှောက် (အခြား plasma membrane protein များအပါအဝင်) ထုတ်လွှတ်သော protein များမှ သီးခြားစီ သယ်ယူပို့ဆောင်သည် (5, 9, 10)။ yeast ဆဲလ်များတွင်၊ GPI-AP များကို endoplasmic reticulum ရှိ အခြားထုတ်လွှတ်သော protein များနှင့် ခွဲထုတ်ပြီးနောက် coat protein complex II (COPII) (6, 7) ဖြင့် ထုပ်ပိုးထားသော ထူးခြားသည့် vesicle များထဲသို့ ထုပ်ပိုးထားသည် (6, 7)။ ER export လုပ်ငန်းစဉ်တွင် ဤခွဲခြားမှုလုပ်ငန်းစဉ်၏ ဆုံးဖြတ်ချက်များသည် မရှင်းလင်းသော်လည်း၊ ဤယန္တရားသည် lipid များ၊ အထူးသဖြင့် GPI anchor ၏ lipid အပိုင်း၏ structural remodeling လိုအပ်နိုင်သည်ဟု ခန့်မှန်းရသည် (5, 8)။ yeast တွင်၊ GPI lipid remodeling သည် GPI တွယ်ဆက်ပြီးသည်နှင့် ချက်ချင်းစတင်ပြီး များစွာသောကိစ္စများတွင်၊ ၎င်းသည် ceramide ကို 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12) နှင့် ချိတ်ဆက်စေသည်။ C26 ceramide သည် yeast ဆဲလ်များမှ ယခုအချိန်အထိ ထုတ်လုပ်သော အဓိက ceramide ဖြစ်သည်။ ၎င်းကို ER တွင် ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ပြီး အများစုကို COPII vesicles (13) မှတစ်ဆင့် Golgi apparatus သို့ တင်ပို့သည်။ GPI-AP ၏ ER တင်ပို့မှုသည် ဆက်လက်လုပ်ဆောင်နေသော ceramide ပေါင်းစပ်မှု (14, 15) အထူးလိုအပ်ပြီး Golgi apparatus တွင် ceramide ကို inositol phosphate ceramide (IPC) သို့ ပြောင်းလဲခြင်းသည် GPI anchor ပေါင်းစပ်မှု (16) ပေါ်တွင် မူတည်သည်။ အတုအမြှေးပါးများဖြင့် ဇီဝရူပဗေဒဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများအရ အလွန်ရှည်လျားသော acyl chain ceramide များသည် ထူးခြားသော ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများရှိသော အစီအစဉ်တကျ domain များကို ဖွဲ့စည်းရန် ပေါင်းစည်းနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည် (17, 18)။ ဤဒေတာသည် C26 ceramide နှင့် C26 ceramide ပါသော GPI-AP တို့သည် ၎င်းတို့၏ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို အသုံးပြု၍ ရှုပ်ထွေးသော ER membrane lipid ပတ်ဝန်းကျင်တွင် အစီအစဉ်တကျ ဒေသများ သို့မဟုတ် ဒေသများအဖြစ် ပေါင်းစည်းသည်ဟူသော ယူဆချက်ကို ဦးတည်စေသည်။ ၎င်းသည် အဓိကအားဖြင့် တိုတောင်းပြီး မပြည့်ဝသော glycerolipids (C16:1 နှင့် C18:1) များဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည် (19, 20)။ ဤဒေသများကို ceramide နှင့် ceramide-based GPI-AP တို့ကို တူညီသော COPII vesicle (5) တွင် Golgi သို့ ပူးတွဲသယ်ယူပို့ဆောင်နိုင်သည့် သီးခြား ER ထွက်ပေါက်နေရာများ (ERES) ပေါ်တွင် ရွေးချယ်၍ အာရုံစိုက်သွားမည်ဖြစ်သည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤ lipid-based ယန္တရားကို fluorescent labeled ပရိုတင်းများကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း လေ့လာနိုင်သည့် cutting-edge microscopy နည်းပညာတစ်ခုဖြစ်သည့် super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM) ကို အသုံးပြု၍ တိုက်ရိုက်စမ်းသပ်ခဲ့ပါသည်။ သုံးရောင်နှင့် သုံးဖက်မြင် (3D) ပုံရိပ်များသည် သက်ရှိဆဲလ်များတွင် အလွန်မြင့်မားသော resolution နှင့် မြန်နှုန်းရှိသည် (21၊ 22)။
S. cerevisiae တွင် ER မှထွက်ခွာပြီးနောက် transmembrane secreted protein များမှ C26 ceramide အုပ်စုပါ ပုံမှန် GPI-AP ကို ​​မည်သို့စစ်ဆေးခဲ့သည်ကို ပိုမိုသတ်မှတ်ရန် SCLIM နည်းပညာကို ဦးစွာအသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ ER ၏ အမျိုးအစားခွဲခြားမှုကို စစ်ဆေးရန်အတွက်၊ in vivo (7, 23) တွင် ERES ထဲသို့ ဝင်ရောက်လာသော မကြာသေးမီက ပေါင်းစပ်ထားသော cargo ကို တိုက်ရိုက်မြင်ယောင်နိုင်သည့် မျိုးရိုးဗီဇစနစ်ကို ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ cargo အဖြစ်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အစိမ်းရောင် fluorescent protein (GFP) ဖြင့် label လုပ်ထားသော C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 နှင့် near-infrared fluorescent protein (iRFP) ဖြင့် label လုပ်ထားသော transmembrane secreted protein Mid2 တို့ကို ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး နှစ်ခုစလုံးသည် plasma membrane (24–26) ကို ပစ်မှတ်ထားပါသည်။ sec31-1 အပူချိန်-sensitive mutant တွင်၊ ဤ cargo နှစ်ခုကို galactose-inducible promoter နှင့် constitutive ERES marker အောက်တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။ အပူချိန်အလွန်အမင်း (37°C) တွင်၊ sec31-1 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုသည် COPII အပင်ပေါက်ခြင်းနှင့် ER တင်ပို့မှုကို ဟန့်တားရန် COPII အလွှာအစိတ်အပိုင်း Sec31 ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိခိုက်စေသောကြောင့်၊ အသစ်ပေါင်းစပ်ထားသော ကုန်ပစ္စည်းများသည် ER (23) တွင် စုပုံလာသည်။ အပူချိန်နိမ့် (24°C) အထိ အအေးခံပြီးနောက်၊ လျှို့ဝှက်ဧရိယာမှ ပြန်လည်ရရှိသော sec31-1 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုဆဲလ်များနှင့် စုဆောင်းထားသော အသစ်ပေါင်းစပ်ထားသော ကုန်ပစ္စည်းများကို ER မှ တင်ပို့ခဲ့သည်။ CLIM visualization အရ အသစ်ပေါင်းစပ်ထားသော Gas1-GFP နှင့် Mid2-iRFP အများစုသည် sec31-1 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုဆဲလ်များ၏ ER တွင် 37°C တွင် incubation ပြီးနောက် 24°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ ပြန်ထုတ်လွှတ်ပြီးနောက် စုပုံနေဆဲဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 1)။ Mid2-iRFP ကို ​​ER အမြှေးပါးတစ်ခုလုံးတွင် ဖြန့်ဝေထားပြီး Gas1-GFP ကို ​​စုစည်းပြီး မဆက်မပြတ် ER အမြှေးပါးဧရိယာတွင် စုစည်းထားသောကြောင့်၊ ၎င်းတို့၏ ဖြန့်ဖြူးမှုသည် လုံးဝကွဲပြားသည် (ပုံ 1၊ A မှ C နှင့် Movie S1)။ ထို့အပြင်၊ ပုံ 1D တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ Gas1-GFP cluster တွင် Mid2-iRFP မရှိပါ။ ဤရလဒ်များက GPI-AP နှင့် transmembrane ပရိုတိန်းများကို အစောပိုင်းတွင် မတူညီသော ER အမြှေးပါးဒေသများအဖြစ် ခွဲထုတ်ခဲ့ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ Gas1-GFP cluster သည် mCherry's COPII coat protein Sec13 (ပုံ 1၊ E နှင့် F နှင့် movie S1) (23) ဖြင့် label တပ်ထားသော သီးခြား ERES နှင့် ကပ်လျက်ရှိသည်။
sec31-1 ဆဲလ်များသည် galactose မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော အရည်များကို ဖော်ပြပြီး၊ ရှည်လျားသော acyl chain (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP၊ အစိမ်းရောင်) နှင့် transmembrane protein Mid2-iRFP (TMP၊ အပြာရောင်) တို့ကို ဖော်ပြပြီး ဤ Constructive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES၊ magenta) ကို 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ထားကာ 24°C သို့ ရွှေ့ကာ မိနစ် 5 အကြာတွင် SCLIM ဖြင့် ပုံရိပ်ဖော်ခဲ့သည်။ (A မှ C) သည် မျက်နှာပြင်၏ ကိုယ်စားပြု ပေါင်းစပ်ထားသော သို့မဟုတ် တစ်ခုတည်းသော 2D ပုံ (A)၊ z-section 10 ခု၏ 2D projection ပုံ (B) သို့မဟုတ် cargo နှင့် ERES markers များ၏ 3D ဆဲလ် hemisphere ပုံ (C) ကို ပြသထားသည်။ Scale bar 1μm (A နှင့် B)။ scale unit သည် 0.551μm (C) ဖြစ်သည်။ Gas1-GFP ကို ​​discrete ER ဒေသများ သို့မဟုတ် cluster များတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ Mid2-iRFP ကို ​​ရှာဖွေတွေ့ရှိပြီး ER membrane တစ်လျှောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသည် (C)။ (D) ဂရပ်သည် အဖြူရောင်မြှားမျဉ်း (ဘယ်ဘက်) တလျှောက်ရှိ Gas1-GFP cluster ရှိ Gas1-GFP နှင့် Mid2-iRFP တို့၏ နှိုင်းရ fluorescence intensity ကို ပြသထားသည်။ AU၊ arbitrary unit။ (E နှင့် F) သည် ကုန်ပစ္စည်းများနှင့် ERES အမှတ်အသားကို ပေါင်းစပ်ထားသော 3D ပုံရိပ်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ Gas1-GFP cluster များကို သတ်မှတ်ထားသော ERES အနီးတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ စကေးယူနစ်မှာ 0.551μm ဖြစ်သည်။ (F) အဖြူရောင် အစိုင်အခဲမြှားသည် ERES နှင့် ဆက်စပ်နေသော Gas1-GFP cluster ကို အမှတ်အသားပြုသည်။ အလယ်နှင့် ညာဘက် panel များသည် ပေါင်းစည်းထားသော ချဲ့ထားသော 3D ပုံရိပ်နှင့် ရွေးချယ်ထားသော Gas1-GFP cluster ၏ လှည့်ပတ်မြင်ကွင်းကို ပြသထားသည်။
Gas1-GFP cluster နှင့် သတ်မှတ်ထားသော ERES အကြား နီးကပ်သော နေရာဒေသဆိုင်ရာ ဆက်နွယ်မှုက Gas1-GFP သည် ER မှ ထွက်ခွာရန် Mid2-iRFP အသုံးပြုသော ရွေးချယ်မှုနှင့် ကွဲပြားသော ရွေးချယ်ထားသော ERES ထဲသို့ ဝင်ရောက်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဤဖြစ်နိုင်ခြေကို ဖြေရှင်းရန်အတွက်၊ ကုန်ပစ္စည်း တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခုအတွက်သာ ERES အချိုးကို ကျွန်ုပ်တို့ တွက်ချက်ခဲ့သည် (ပုံ ၂၊ A မှ C)။ ERES အများစု (၇၀%) တွင် ကုန်ပစ္စည်း အမျိုးအစား တစ်မျိုးတည်းသာ ပါဝင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ပုံ ၂C ၏ အောက်ဆုံးပုံတွင် Gas1-GFP (ပုံ ၁) သို့မဟုတ် Mid2-iRFP (ပုံ ၂) သာပါဝင်သော ERES ၏ ပုံမှန် ဥပမာ နှစ်ခုကို ပြသထားသည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ERES ၏ ၂၀% ခန့်တွင် တူညီသောနေရာတွင် ထပ်နေသော ကုန်ပစ္စည်း နှစ်ခု ပါဝင်သည်။ ERES အချို့ (၁၀%) တွင် ကုန်ပစ္စည်း အမျိုးအစား နှစ်မျိုး ပါဝင်သော်လည်း ၎င်းတို့ကို သိသာထင်ရှားစွာ ကွဲပြားသော နေရာများတွင် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤစာရင်းအင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ER ကို တင်ပို့ပြီးနောက် GPI-AP Gas1-GFP နှင့် transmembrane cargo Mid2-iRFP တို့ကို မတူညီသော ERES များအဖြစ် ပိုင်းခြားထားသည် (ပုံ ၂D)။ ဤခွဲခြားခြင်းစွမ်းဆောင်ရည်သည် ယခင်ဇီဝဓာတုဗေဒခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (6) နှင့် morphological ဆုံးဖြတ်ချက် (7) နှင့် အလွန်ကိုက်ညီပါသည်။ ERES (ပုံ 2E နှင့် Movie S2) ထဲသို့ ဝင်ရောက်လာသော သီးခြားခွဲထားသော ကုန်ပစ္စည်း၏ အပြုအမူကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ လေ့လာနိုင်ပါသည်။ ပုံ 2E တွင် Gas1-GFP (panel 3) သို့မဟုတ် Mid2-iRFP (panel 4) ၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်သာ ERES ထဲသို့ တစ်ဖက်မှ ဝင်ရောက်ပြီး သီးခြားနေရာတွင် ကန့်သတ်ထားကြောင်း ပြသထားသည်။ ပုံ 2E ၏ Panel 5 တွင် Gas1-GFP နှင့် Mid2-iRFP တို့ကို တစ်ခါတစ်ရံတွင် တူညီသော ERES တွင် တွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း ၎င်းတို့သည် မတူညီသော ဘက်များမှ ဝင်ရောက်ပြီး မတူညီသော COPII vesicles များကို ကိုယ်စားပြုနိုင်သည့် သီးခြားဒေသများတွင် စုစည်းနေကြောင်း ပြသထားသည်။ ရွေးချယ်ထားသော ERES အဖြစ် C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ၏ ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် အမျိုးအစားခွဲခြားခြင်းသည် အခြား transmembrane secretion cargo တစ်ခုဖြစ်သည့် GFP-tagged plasma membrane protein Axl2 (27) သည် Mid2-iRFP နှင့် ဆင်တူသော အပြုအမူကို ပြသသောကြောင့် သီးခြားဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ အတည်ပြုခဲ့ပါသည်။ (ပုံ S1 နှင့် Movie S3)။ အသစ်ပေါင်းစပ်ထားသော Axl2-GFP ကို ​​Mid2-iRFP (ပုံ S1၊ A နှင့် B) ကဲ့သို့သော ER အမြှေးပါးမှတစ်ဆင့် ဖြန့်ဝေပြီး ERES အများစုတွင် Mid2-iRFP နှင့် ပူးတွဲတည်ရှိသည် (ပုံ S1၊ B မှ D)။ ပုံ ၁ ၏ Panels 1 နှင့် 2။ S1C သည် အမြှေးပါးမှ ကုန်စည်နှစ်ခု ထပ်နေသည့် ERES ၏ ပုံမှန်ဥပမာနှစ်ခုကို ပြသထားသည်။ ဤကိစ္စများတွင် ကုန်ပစ္စည်းနှစ်မျိုးလုံးသည် ERES ထဲသို့ အတူတကွ ဝင်ရောက်သည် (ပုံ S1E၊ Panel 3 နှင့် Movie S3)။
galactose လှုံ့ဆော်မှုဖြစ်စေသော အရည်များကို ဖော်ပြသည့် sec31-1 ဆဲလ်များ၊ Gas1-GFP (GPI-AP၊ အစိမ်းရောင်) နှင့် Mid2-iRFP (TMP၊ အပြာရောင်) နှင့် Sec13-mCherry (ERES၊ magenta) တို့ကို 37 တွင် ထားရှိသည်။ °C တွင် မိနစ် 30 ကြာ မွေးမြူပြီးနောက်၊ အရည်ပိတ်ဆို့ခြင်းကို ထုတ်လွှတ်ရန် 24 °C သို့ ရွှေ့ပြီး မိနစ် 20 ကြာပြီးနောက် SCLIM ဖြင့် ပုံရိပ်ဖော်ပါ။ (A မှ C) ကုန်ပစ္စည်းနှင့် ERES ဖြင့် အမှတ်အသားပြုထားသော z-အပိုင်း 10 ခု၏ ကိုယ်စားပြု 2D ပရိုဂျက်ရှင်းပုံရိပ်များ (A; scale bar, 1μm) သို့မဟုတ် 3D ဆဲလ် hemisphere ပုံရိပ်များ (B နှင့် C; scale unit, 0.456μm)။ (B) ရှိ အောက်ဘက် panel နှင့် (C) ရှိ panel သည် ERES (magenta) တွင်ရှိသော ကုန်ပစ္စည်းများကိုသာ ပြသရန် လုပ်ဆောင်ပြီးသော ရုပ်ပုံများကို ပြသသည် [Gas1-GFP (မီးခိုးရောင်) နှင့် Mid2-iRFP (အပြာရောင်ဖျော့ဖျော့)]။ (C) ပွင့်လင်းမြား- ERES သည် ကုန်ပစ္စည်းတစ်ခုသာ သယ်ဆောင်သည် (1 မှ 4)။ မီးခိုးရောင်မြှား- ERES တွင် ခွဲထားသော ကုန်ပစ္စည်း (5) ပါဝင်သည်။ အဖြူရောင် အစိုင်အခဲမြှား- ပူးတွဲတည်ရှိသော ကုန်ပစ္စည်းများပါရှိသော ERES။ အောက်တွင်- ရွေးချယ်ထားသော တစ်ခုတည်းသော ERES တွင် Gas1-GFP (1) သို့မဟုတ် Mid2-iRFP (2) သာ ပါဝင်သည်။ စကေးဘား၊ 100 nm။ (D) (C) တွင်ဖော်ပြထားသော ဓာတ်ပုံအဏုကြည့်မှန်ပြောင်း၏ ပမာဏ။ ကုန်ပစ္စည်းတစ်ခု (Gas1-GFP သို့မဟုတ် Mid2-iRFP)၊ ခွဲထားသော ကုန်ပစ္စည်းနှင့် ထပ်နေသော ကုန်ပစ္စည်းများသာပါဝင်သော ERES ၏ ပျမ်းမျှရာခိုင်နှုန်း။ သီးခြားစမ်းသပ်မှုသုံးခုတွင် ဆဲလ် ၅၄ ခုတွင် n=432။ အမှားဘား = SD။ Two-tailed unpaired t စမ်းသပ်မှု။ *** P = 0.0002။ (E) (C) ဖြင့်မှတ်သားထားသော သီးခြားခွဲထားသော ကုန်ပစ္စည်းများ၏ ရွေးချယ်ထားသော ERES ၏ 3D ပုံ။ Gas1-GFP (အစိမ်းရောင်) (3) သို့မဟုတ် Mid2-iRFP (အပြာရောင်) (4) သည် ERES (ပန်းခရမ်းရောင်) တစ်ဖက်မှ ဝင်ရောက်ပြီး ERES အတွင်း ဧရိယာငယ်တစ်ခုအတွင်း ကန့်သတ်ထားသည်။ တစ်ခါတစ်ရံတွင် ကုန်ပစ္စည်းအမျိုးအစားနှစ်မျိုးလုံးသည် တူညီသော ERES (5) ထဲသို့ တူညီသောဘက်မှ ဝင်ရောက်ပြီး ERES အတွင်းရှိ သီးခြားနေရာတစ်ခုတွင် ကန့်သတ်ထားသည်။ စကေးဘား၊ 100 nm။
ထို့နောက် ER membrane တွင်ရှိသော ရှည်လျားသော acyl chain ceramide (C26) သည် Gas1 ကို ရွေးချယ်ထားသော ERES များအဖြစ်သို့ သီးခြား clustering နှင့် sorting ကို မောင်းနှင်သည်ဟူသော ယူဆချက်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ဤရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပြုပြင်ထားသော yeast strain GhLag1 ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတွင် endogenous ceramide synthases Lag1 နှင့် Lac1 နှစ်ခုကို GhLag1 (ဝါဂွမ်း၏ Lag1 homolog) ဖြင့် အစားထိုးခဲ့ပြီး၊ ရလဒ်အနေဖြင့် wild type ထက်တိုသော cell membrane Ceramide strain ရှိသော yeast strain ကို ရရှိစေသည် (ပုံ 3A) (28)။ Mass spectrometry (MS) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ wild-type strains များတွင် စုစုပေါင်း ceramide ၏ 95% သည် အလွန်ရှည်လျားသော (C26) chain ceramide ဖြစ်ပြီး GhLag1 တွင် ceramide ၏ 85% သည် အလွန်ရှည်လျားသည် (C18 နှင့် C16) ဖြစ်သည်။ ceramide ၏ 2% သာ အလွန်ရှည်လျားသော (C26) chain ceramide ဖြစ်သည်။ C18 နှင့် C16 ceramides များသည် GhLag1 အမြှေးပါးတွင် ယခုအချိန်အထိ တွေ့ရှိရသော အဓိက ceramides များဖြစ်သော်လည်း၊ MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကလည်း GhLag1 မျိုးကွဲတွင် ဖော်ပြထားသော Gas1-GFP ၏ GPI anchor တွင် wild-type lipids များနှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော C26 ceramide ပါဝင်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ အရည်အသွေးမှာ အတူတူပင်ဖြစ်သည် (ပုံ 3A) (26)။ ထို့ကြောင့်၊ ၎င်းသည် ceramide ပြန်လည်ပြုပြင်သည့် အင်ဇိုင်း Cwh43 သည် C26 ceramide အတွက် အလွန်ရွေးချယ်ကြောင်း ဆိုလိုသည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ ပုံ 26 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ ၎င်းသည် GhLag1 မျိုးကွဲရှိ C26 ceramide အနည်းငယ်မှ GPI anchor ကို ဦးစားပေးထည့်သွင်းထားသည်။ S2 (29)။ သို့သော်လည်း၊ GhLag1 ၏ ဆဲလ်အမြှေးပါးတွင် အခြေခံအားဖြင့် C18-C16 ceramide သာပါဝင်ပြီး Gas1-GFP တွင် C26 ceramide ရှိနေဆဲဖြစ်သည်။ ဤအချက်သည် ဤမျိုးကွဲတွင် ER ရှိ အမြှေးပါး ceramide ၏ acyl chain အရှည်ပြဿနာကို အထူးဖြေရှင်းရန် စံပြကိရိယာတစ်ခုဖြစ်စေသည်။ အတန်းအစားခွဲခြားခြင်းနှင့် စီခြင်း၏ ယူဆချက်ဆိုင်ရာအခန်းကဏ္ဍ။ ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် C26 Gas1-GFP သည် sec31-1 ၏ အပူချိန်-အာရုံခံနိုင်သော mutant allele ဖြင့် GhLag1 တွင် cluster များတွင် စုပုံလာနိုင်စွမ်းကို ရှေးဦးစွာ လေ့လာခဲ့ပြီး၊ ER membrane Ceramide တွင် ရှည်လျားသော (C18-C16) chain သာရှိသည့် ရိုးရာ fluorescence microscopy မှတစ်ဆင့် လေ့လာခဲ့သည် (ပုံ ၃)။ sec31-1 တွင် Gas1-GFP အများစုသည် cluster များတွင် စုစည်းနေပြီး၊ ရှည်လျားသော (C18-C16) ရှည်လျားသော ceramide ER membrane ရှိသော sec31-1 GhLag1 ရှိ Gas1-GFP သည် ER membrane တစ်ခုလုံးတွင် clustered မရှိဘဲ ဖြန့်ဝေထားခြင်း မရှိပါ။ တိကျစွာပြောရလျှင် C26 ceramide-based clustering သည် သီးခြား ERES (ပုံ ၁) နှင့် နီးကပ်စွာ ဆက်စပ်နေသောကြောင့်၊ ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် ER export protein mechanism ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကိုလည်း ပါဝင်ပတ်သက်နိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆက်လက်လေ့လာခဲ့ပါသည်။ GPI-AP သည် ER export အတွက် အထူး COPII စနစ်ကို အသုံးပြုပြီး GPI anchor ၏ glycan အပိုင်း၏ Ted1 ၏ structural remodeling (30, 31) မှ တက်ကြွစွာ ထိန်းညှိပေးပါသည်။ recombinant GPI-glycan ကို transmembrane cargo receptor p24 complex မှ သိရှိနိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် အဓိက COPII cargo binding subunit Sec24 ၏ သီးခြား isoform ဖြစ်သော Lst1 ကို ရွေးချယ်စုဆောင်းကာ GPI-AP-rich COPII Vesicles များ လိုအပ်ပါသည် (31-33)။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤ single protein များ (p24 complex component Emp24၊ GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 နှင့် သီးခြား COPII subunit Lst1) ကို sec31-1 mutant strain နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော double mutant တစ်ခုကို တည်ဆောက်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့ကို လေ့လာခဲ့သည်။ Gas1-cluster GFP (ပုံ ၃) ဖွဲ့စည်းနိုင်ပါသလား။ sec31-1emp24Δ နှင့် sec31-1ted1Δ တွင် Gas1-GFP သည် အဓိကအားဖြင့် unclustered ဖြစ်ပြီး ER membrane တစ်လျှောက်တွင် ဖြန့်ဝေသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး sec31-1 GhLag1 တွင် ယခင်က မြင်တွေ့ခဲ့ရသည့်အတိုင်း၊ sec31-1lst1Δ တွင် Gas1-GFP သည် sec31-1 ကဲ့သို့ပင် unclustered ဖြစ်ပြီး ER membrane တစ်လျှောက်တွင် ဖြန့်ဝေသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤရလဒ်များက ER အမြှေးပါးတွင် C26 ceramide ရှိနေခြင်းအပြင် Gas1-GFP ၏ clustering သည် p24 complex နှင့် ချိတ်ဆက်ရန် လိုအပ်ပြီး Lst1 စုဆောင်းမှု သီးခြား မလိုအပ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့နောက် ER အမြှေးပါးရှိ ceramide ၏ chain length သည် Gas1-GFP ၏ p24 နှင့် ချိတ်ဆက်မှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်သည့် ဖြစ်နိုင်ခြေကို ကျွန်ုပ်တို့ စူးစမ်းလေ့လာခဲ့သည်။ သို့သော် membrane ရှိ C18-C16 ceramide ရှိနေခြင်းသည် p24 complex မှ ပြန်လည်တည်ဆောက်ထားသော GPI-glycans (ပုံ S3 နှင့် S4၊ A နှင့် B) သို့မဟုတ် GPI-AP နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းနှင့် GPI-AP တင်ပို့ခြင်းစွမ်းရည်ကို မထိခိုက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ COPII subtype Lst1 ကို စုဆောင်းပါ (ပုံ S4C)။ ထို့ကြောင့် C26 ceramide-dependent clustering သည် မတူညီသော ER တင်ပို့မှု protein ယန္တရားများနှင့် ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများ မလိုအပ်သော်လည်း lipid အရှည်ဖြင့် မောင်းနှင်သော အခြားရွေးချယ်စရာ sorting ယန္တရားကို ပံ့ပိုးပေးသည်။ ထို့နောက် ER အမြှေးပါးရှိ ceramide acyl chain length သည် Gas1-GFP ကို ​​ရွေးချယ်ထားသော ERES အဖြစ် ထိရောက်စွာ ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အတွက် အရေးကြီးခြင်း ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ GhLag1 မျိုးကွဲရှိ Gas1 သည် short-chain ceramide ပါရှိပြီး ER မှ ထွက်ခွာကာ plasma membrane အတွင်းသို့ ဝင်ရောက်သောကြောင့် (ပုံ S5)၊ sorting ကို ceramide acyl chain ၏ အရှည်ဖြင့် မောင်းနှင်ပါက GhLag1 မျိုးကွဲရှိ Gas1 ကို redirect လုပ်၍ ဖြတ်ကျော်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယုံကြည်ပါသည်။ တူညီသော membrane ရှိသည့် ERES ကုန်ပစ္စည်းများ။
(က) GhLag1 ၏ ဆဲလ်အမြှေးပါးတွင် အဓိကအားဖြင့် ပိုတိုသော C18-C16 ceramides များ ပါဝင်ပြီး Gas1-GFP ၏ GPI anchor တွင် wild-type ဆဲလ်များကဲ့သို့ C26 IPC တူညီနေဆဲဖြစ်သည်။ အထက်ဖော်ပြပါ- mass spectrometry (MS) ဖြင့် wild-type (Wt) နှင့် GhLag1p မျိုးကွဲများ၏ ဆဲလ်အမြှေးပါးတွင် ceramide ၏ acyl chain အရှည် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ဒေတာသည် စုစုပေါင်း ceramide ၏ ရာခိုင်နှုန်းကို ကိုယ်စားပြုသည်။ လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် သုံးခု၏ ပျမ်းမျှ။ Error bar = SD။ Two-tailed unpaired t စမ်းသပ်မှု။ **** P <0.0001။ အောက်ခြေ panel- wild-type နှင့် GhLag1p မျိုးကွဲများတွင် ဖော်ပြထားသော Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor တွင်ရှိသော IPC ၏ acyl chain အရှည်၏ MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ဒေတာသည် စုစုပေါင်း IPC signal ၏ ရာခိုင်နှုန်းကို ကိုယ်စားပြုသည်။ လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ငါးခု၏ ပျမ်းမျှ။ Error bar = SD။ Two-tailed unpaired t စမ်းသပ်မှု။ ns၊ အရေးမကြီးပါ။ P = 0.9134။ (ခ) galactose မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော Gas1-GFP ကို ​​ဖော်ပြသော sec31-1၊ sec31-1 GhLag1၊ sec31-1emp24Δ၊ sec31-1ted1Δ နှင့် sec31-1lst1Δ ဆဲလ်များ၏ fluorescence micrographs များကို 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ထားကာ 24°C ပြီးနောက် ပုံမှန် fluorescence microscopy ကို လုပ်ဆောင်ရန် လက်ဆင့်ကမ်းခဲ့သည်။ အဖြူရောင်မြား- ER Gas1-GFP cluster။ Open arrow- Unclustered Gas1-GFP ကို ​​ER membrane တစ်ခုလုံးတွင် ဖြန့်ဝေထားပြီး ER ၏ လက္ခဏာရပ် nuclear ring staining ကို ပြသထားသည်။ Scale bar၊ 5μm။ (ဂ) (ခ) တွင်ဖော်ပြထားသော photomicrograph ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း။ punctate Gas1-GFP ဖွဲ့စည်းပုံရှိသော ဆဲလ်များ၏ ပျမ်းမျှရာခိုင်နှုန်း။ လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် သုံးခုတွင် ဆဲလ် n≥300။ Error bar = SD။ Two-tailed unpaired t test။ **** P <0.0001။
ဤပြဿနာကို တိုက်ရိုက်ဖြေရှင်းရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် GhLag1 ရှိ sec31-1 အပူချိန်အာရုံခံနိုင်သော mutant allele ဖြင့် Gas1-GFP နှင့် Mid2-iRFP ၏ SCLIM visualization ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (ပုံ ၄ နှင့် Movie S4)။ ER ကို 37°C တွင်ထိန်းသိမ်းထားပြီးနောက် 24°C တွင်ထုတ်လွှတ်ပြီးနောက်၊ ရိုးရာမိုက်ခရိုစကုပ်များဖြင့်တွေ့ရှိရသည့်အတိုင်း ER membrane တစ်လျှောက်တွင် အစုအဝေးဖွဲ့၍ ဖြန့်ဝေခြင်းမပြုခဲ့ပါ (ပုံ ၄၊ A နှင့် B)။ ထို့အပြင်၊ ERES ၏ ရာခိုင်နှုန်းအများစု (၆၇%) တွင် ၎င်းတွင် တွဲဖက်တည်ရှိသော ကုန်တင်အမျိုးအစားနှစ်မျိုးပါဝင်သည် (ပုံ ၄D)။ ပုံ ၄C ၏ Panels ၁ နှင့် ၂ တွင် Gas1-GFP နှင့် Mid2-GFP ထပ်နေသော ERES ၏ ပုံမှန်ဥပမာနှစ်ခုကို ပြသထားသည်။ ထို့အပြင်၊ ကုန်ပစ္စည်းနှစ်မျိုးလုံးကို တူညီသော ERES ထဲသို့ စုဆောင်းခဲ့သည် (ပုံ ၄E၊ panel ၃ နှင့် movie S4)။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက ER membrane ရှိ ceramide acyl chain ၏အရှည်သည် ER ပရိုတင်းစုစည်းမှုနှင့် အမျိုးအစားခွဲခြားမှု၏ အရေးကြီးသောအဆုံးအဖြတ်ပေးသည့်အရာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
ဂယ်လက်တို့စ်ကြောင့် ထွက်လာတဲ့ အရည်တွေကို ဖော်ပြတဲ့ Sec31-1 GhLag1 ဆဲလ်တွေ၊ Gas1-GFP (GPI-AP၊ အစိမ်းရောင်) နဲ့ Mid2-iRFP (TMP၊ အပြာရောင်) နဲ့ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ထားတဲ့ ERES တံဆိပ်ကပ်ထားတဲ့ Sec13-mCherry (ERES၊ magenta) တို့ကို ၃၇°C မှာ ပေါက်ဖွားစေပါ။ မိနစ် ၃၀ ဆက်ထားပြီး အရည်တွေ ထုတ်လွှတ်ဖို့ ၂၄°C ကို လျှော့ချပြီး မိနစ် ၂၀ ကြာရင် SCLIM နဲ့ ပုံဆွဲပါ။ (A မှ C) ကုန်တင်နဲ့ ERES တွေနဲ့ အမှတ်အသားပြုထားတဲ့ z-အပိုင်း ၁၀ ခုရဲ့ ကိုယ်စားပြု 2D ပရိုဂျက်ရှင်းပုံတွေ (A; စကေးဘား၊ 1μm) ဒါမှမဟုတ် 3D ဆဲလ်ခြမ်းပုံတွေ (B နဲ့ C; စကေးယူနစ်၊ 0.45μm)။ (B) ရှိ အောက်ဘက်အကန့်နှင့် (C) ရှိ အကန့်သည် ERES (magenta) တွင်ရှိသော ကုန်ပစ္စည်းများကိုသာ ပြသရန် လုပ်ဆောင်ပြီးသော ပုံများကို ပြသသည် [Gas1-GFP (မီးခိုးရောင်) နှင့် Mid2-iRFP (အပြာဖျော့)]။ (C) အဖြူရောင်ဖြည့်ထားသော မြား- ERES၊ ကုန်ပစ္စည်းများ ထပ်နေသည်။ မြားဖွင့်ပါ- ERES တွင် အရာတစ်ခုသာ ပါဝင်သည်။ အောက်ဘက်အကန့်- ရွေးချယ်ထားသော ERES တွင် (C) တွင် အမှတ်အသားပြုထားသော ထပ်နေသော ကုန်ပစ္စည်းများ (1 နှင့် 2) ရှိသည်။ စကေးဘား၊ 100 nm။ (D) (C) တွင်ဖော်ပြထားသော ဓာတ်ပုံအဏုကြည့်မှန်ပြောင်း၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း။ sec31-1 နှင့် sec31-1 GhLag1 ယူနစ်များတွင်၊ ကုန်ပစ္စည်းတစ်ခု (Gas1-GFP သို့မဟုတ် Mid2-iRFP) ကိုသာ ထည့်သွင်းထားပြီး သီးခြားကုန်ပစ္စည်းနှင့် ထပ်နေသော ကုန်ပစ္စည်းအတွက် ERES ၏ ပျမ်းမျှရာခိုင်နှုန်း။ သီးခြားစမ်းသပ်မှုသုံးခုတွင်၊ ဆဲလ် ၅၄ ခုတွင် n = 432 (sec31-1) နှင့် ဆဲလ် ၄၇ ခုတွင် n = 430 (sec31-1 GhLag1)။ အမှားဘား = SD။ Two-tailed unpaired t စမ်းသပ်မှု။ *** P = 0.0002 (sec31-1) နှင့် ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)။ (E) (C) တွင် အမှတ်အသားပြုထားသော ထပ်နေသော ကုန်ပစ္စည်း (3) ပါရှိသော ရွေးချယ်ထားသော ERES ၏ 3D ပုံ။ Gas1-GFP (အစိမ်းရောင်) နှင့် Mid2-iRFP (အပြာရောင်) တို့သည် ERES (ပန်းခရမ်းရောင်) ကို တစ်ဖက်တည်းမှ ချဉ်းကပ်ပြီး တူညီသော ERES ကန့်သတ်ဧရိယာတွင် ရှိနေပါသည်။ စကေးဘား၊ 100 nm။
ဤလေ့လာမှုသည် lipid-based protein cargos များကို secretory pathway တွင် selective export sites များအဖြစ် ခွဲခြားထားကြောင်း တိုက်ရိုက် in vivo အထောက်အထားများကို ပေးစွမ်းပြီး classification selectivity အတွက် acyl chain length ၏ အရေးပါမှုကို ဖော်ပြသည်။ SCLIM ဟုခေါ်သော အစွမ်းထက်ပြီး ခေတ်မီ microscopy နည်းပညာကို အသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် yeast တွင် မကြာသေးမီက ပေါင်းစပ်ထားသော Gas1-GFP (အလွန်ရှည်လျားသော acyl chain (C26) ceramide lipid အပိုင်းပါရှိသော အဓိက plasma membrane GPI-AP) ကို သရုပ်ပြခဲ့သည် (discrete ERs များတွင် အစုအဝေးဖွဲ့ထားသော ဒေသများသည် သီးခြား ERES နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး transmembrane secreted proteins များကို ER membrane တစ်လျှောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသည် (ပုံ ၁)။ ထို့အပြင် ဤကုန်ပစ္စည်းအမျိုးအစားနှစ်မျိုးသည် မတူညီသော ERES များကို ရွေးချယ်ဝင်ရောက်သည် (ပုံ ၂)။ membrane ရှိ cellular ceramide ၏ acyl chain length ကို C26 မှ C18-C16 သို့ လျှော့ချပြီး Gas1-GFP cluster ကို discrete ER region ထဲသို့ ဖျက်ဆီးပြီး Gas1-GFP ကို ​​transmembrane protein နှင့်အတူ ER ကို တူညီသော ERES မှတစ်ဆင့် ထားခဲ့ရန် ပြန်လည်လမ်းကြောင်းပြောင်းသည် (ပုံ ၃ နှင့် ပုံ ၃)။ ၄)။
GPI-AP သည် ER မှထွက်ခွာရန် အထူးပရိုတိန်းယန္တရားကို အသုံးပြုသော်လည်း၊ C26 ceramide-dependent ခွဲထုတ်မှုသည် ERES အထူးပြုလုပ်ချက်သို့ ဦးတည်စေနိုင်သည့် ကွဲပြားသောပရိုတိန်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများအပေါ် မှီခိုခြင်းမရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S4 နှင့် S5)။ ယင်းအစား၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များသည် lipid-based protein clustering နှင့် နောက်ဆက်တွဲ အခြားကုန်စည်များကို ဖယ်ထုတ်ခြင်းဖြင့် မောင်းနှင်သော အခြားခွဲခြားမှုယန္တရားကို ထောက်ခံပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များအရ သတ်မှတ်ထားသော ERES နှင့် ဆက်စပ်နေသော Gas1-GFP ဒေသ သို့မဟုတ် cluster တွင် transmembrane secreted protein Mid2-iRFP မရှိကြောင်း ညွှန်ပြနေပြီး၊ C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster သည် သက်ဆိုင်ရာ ERES ထဲသို့ ဝင်ရောက်မှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေပြီး တစ်ချိန်တည်းမှာပင် transmembrane ကို ဖယ်ထုတ်မည်ဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ အရည်များသည် ဤ ERES ထဲသို့ ဝင်ရောက်သည် (ပုံ 1 နှင့် 2)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ER membrane တွင် C18-C16 ceramides ရှိနေခြင်းသည် GPI-AP ကို ​​ဒေသများ သို့မဟုတ် cluster များ ဖွဲ့စည်းစေခြင်းမရှိသောကြောင့် ၎င်းတို့သည် transmembrane secreted protein များကို တူညီသော ERES ထဲသို့ ဖယ်ထုတ်ခြင်း သို့မဟုတ် အစားထိုးခြင်း မပြုပါ (ပုံ 3 နှင့် 4)။ ထို့ကြောင့် C26 ceramide သည် သီးခြား ERES နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ပရိုတင်းများ အစုအဝေးဖွဲ့ခြင်းကို လွယ်ကူချောမွေ့စေခြင်းဖြင့် ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် အမျိုးအစားခွဲခြားခြင်းကို မောင်းနှင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ အဆိုပြုပါသည်။
ဤ C26 ceramide-dependent clustering ကို သတ်မှတ်ထားသော ER ဧရိယာထဲသို့ မည်သို့ရောက်ရှိနိုင်မည်နည်း။ membrane ceramide သည် ဘေးတိုက်ခွဲထွက်လေ့ရှိသော သဘောထားကြောင့် GPI-AP နှင့် C26 ceramide တို့သည် ပိုတိုပြီး မပြည့်ဝသော glycerolipids များပါ၀င်သည့် ER membrane ၏ ပိုမိုမမှန်သော lipid ပတ်ဝန်းကျင်တွင် သေးငယ်ပြီး ချက်ချင်းစီစဉ်ထားသော lipids များကို ဖွဲ့စည်းစေနိုင်သည်။ အရည်အသွေးမြင့် clusters (17, 18)။ ဤသေးငယ်သော ယာယီ clusters များကို p24 complex (34) နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် ပိုကြီးပြီး ပိုမိုတည်ငြိမ်သော clusters များအဖြစ်သို့ ထပ်မံပေါင်းစပ်နိုင်သည်။ ၎င်းနှင့်အညီ၊ C26 Gas1-GFP သည် p24 complex နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိရန် လိုအပ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3)။ p24 complex သည် yeast (35) ရှိ p24 transmembrane ပရိုတိန်းလေးမျိုးဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော heterozygous oligomer တစ်ခုဖြစ်ပြီး multivalent binding ကို ပေးစွမ်းသည်။ ၎င်းသည် သေးငယ်သော GPI-AP clusters များ၏ cross-linking ကို ဦးတည်စေပြီး ပိုမိုကြီးမားသော Stable cluster (34) ကို ဖန်တီးပေးသည်။ GPI-APs ၏ ပရိုတိန်း ectodomains များအကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုသည် နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ polarized epithelial ဆဲလ်များတွင် ၎င်းတို့၏ Golgi သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးအတွင်း ပြသထားသည့်အတိုင်း ၎င်းတို့၏ စုစည်းမှုတွင်လည်း ပါဝင်နိုင်သည်။ သို့သော်၊ C18-C16 ceramide သည် ER အမြှေးပါးတွင် ရှိနေသောအခါ၊ p24 complex သည် Gas1-GFP နှင့် ချိတ်ဆက်သောအခါ၊ ကြီးမားသော သီးခြား cluster များ မဖွဲ့စည်းပါ။ အခြေခံယန္တရားသည် ရှည်လျားသော acyl chain ceramide ၏ သီးခြား ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် ဓာတုဗေဒ ဂုဏ်သတ္တိများပေါ်တွင် မူတည်နိုင်သည်။ အတုအမြှေးပါးများ၏ ဇီဝရူပဗေဒ လေ့လာမှုများအရ ရှည်လျားသော (C24) နှင့် တိုတောင်းသော (C18-C16) acyl chain ceramides နှစ်မျိုးလုံးသည် phase separation ကို ဖြစ်စေနိုင်သော်လည်း၊ ရှည်လျားသော acyl chain ceramides (C24) သာလျှင် ဖလင်ကို ပြန်လည်ပုံသွင်းရန် မြင့်မားသော Curvature နှင့် film bending ကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ အပြန်အလှန် ရည်ညွှန်းချက်မှတစ်ဆင့် (17, 37, 38)။ Emp24 ၏ လူသား homologue ဖြစ်သော TMED2 ၏ transmembrane helix သည် cytoplasmic lobules (39) ရှိ C18 ceramide-based sphingomyelin နှင့် ရွေးချယ်၍ ဓါတ်ပြုကြောင်း ပြသထားပါသည်။ molecular dynamics (MD) simulations များကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် C18 နှင့် C26 ceramides နှစ်မျိုးလုံးသည် Emp24 transmembrane helix ၏ cytoplasmic lobules များတဝိုက်တွင် စုပုံနေပြီး ၎င်းတို့တွင် အလားတူ ဦးစားပေးမှုများရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S6)။ Emp24 ၏ transmembrane helix သည် membrane တွင် lipids များ၏ asymmetric distribution ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်ကို သတိပြုသင့်သည်။ ၎င်းသည် နို့တိုက်သတ္တဝါဆဲလ်များအပေါ် အခြေခံသည့် မကြာသေးမီက ရလဒ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ အလားတူ MD simulations များသည် ether lipids ရှိနေခြင်းကိုလည်း ပြသထားသည် (40)။ ထို့ကြောင့် ER26 ၏ lobules နှစ်ခုရှိ C26 ceramide သည် ဒေသတွင်းတွင် ကြွယ်ဝနေသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ luminal lobules ရှိ GPI-AP သည် multivalent p24 နှင့် cytoplasmic lobules ရှိ p24 ပတ်လည်တွင် C26 ceramide စုပုံခြင်းနှင့် တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်သောအခါ၊ ၎င်းသည် လက်ချောင်းများမှတစ်ဆင့် ပရိုတင်းစုစည်းမှုနှင့် membrane curvature ကို ထုတ်ပေးသည် (41)၊ GPI-AP ကို ​​ERES နှင့်ကပ်လျက် သီးခြားဒေသများအဖြစ် ခွဲထွက်စေပြီး၊ ၎င်းသည် ER membrane ၏ အလွန်ကွေးညွှတ်သောဒေသများကိုလည်း အကျိုးပြုသည် (42)။ ယခင်အစီရင်ခံစာများက အဆိုပြုထားသော ယန္တရားကို ထောက်ခံခဲ့သည် (43၊ 44)။ plasma membrane ပေါ်ရှိ ceramide-based glycosphingolipids (GSL) သို့ oligolectins၊ ရောဂါပိုးများ သို့မဟုတ် antibodies များ၏ multivalent ချည်နှောင်မှုသည် GSL စုစည်းမှုကို ကြီးမားစွာ လှုံ့ဆော်ပေးပြီး၊ phase separation ကို မြှင့်တင်ပေးပြီး membrane deformation နှင့် internalization ကို ဖြစ်စေသည် (44)။ Iwabuchi စသည်တို့ (43) acyl chains တိုတောင်းသော်လည်း ရှည်လျားသော (C24) ရှိနေချိန်တွင် GSL lactosylceramide နှင့် ချည်နှောင်ထားသော multivalent ligand သည် ကြီးမားသော cluster များနှင့် membrane invagination များကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး leaflets များပေါ်ရှိ cytoplasm Lyn-mediated signal transduction ကို coupled neutrophils များတွင် acyl chains များဖြင့် အပြန်အလှန် digitize လုပ်သည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။
နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ polarized epithelial ဆဲလ်များတွင်၊ anti-Golgi network (TGN) ၏ apical plasma membrane အဆင့်တွင် အာရုံစူးစိုက်မှုသည် GPI-AP (10, 45) ၏ ခွဲထုတ်ခြင်းနှင့် စီစစ်ခြင်းကို ထိန်းချုပ်သည်။ ဤစုစည်းမှုကို GPI-AP oligomerization (36) မှ မောင်းနှင်သော်လည်း၊ ၎င်းသည် yeast တွင်တွေ့ရှိရသော ceramide chain အရှည်ပေါ်တွင်လည်း မူတည်နိုင်သည်။ နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ GPI-AP တွင် ether lipid-based anchor ရှိပြီး ၎င်း၏ဓာတုဖွဲ့စည်းပုံသည် အလွန်ရှည်လျားသော acyl chain ceramide နှင့် အလွန်ကွာခြားသော်လည်း၊ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုအရ lipid နှစ်မျိုးလုံးတွင် ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အရ အလားတူ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် ဓာတုဂုဏ်သတ္တိများနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ရှိကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (40)။ ထို့ကြောင့်၊ နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ ဆဲလ်များရှိ ether lipid အစိတ်အပိုင်းသည် yeast ရှိ C26 ceramide နှင့် ဆင်တူနိုင်ပြီး ၎င်း၏အခန်းကဏ္ဍမှာ membrane ရှိ long-chain ceramide နှင့် ဆက်စပ်ရန်ဖြစ်ပြီး GPI-AP စုစည်းမှုနှင့် စီစစ်ခြင်းကို မြှင့်တင်ရန်ဖြစ်သည်။ ဒီဖြစ်နိုင်ခြေကို တိုက်ရိုက်စမ်းသပ်ဖို့ လိုအပ်နေသေးပေမယ့်၊ ယခင်တွေ့ရှိချက်တွေက ရှည်လျားတဲ့ acyl chain ceramide ကို Golgi body သို့ သယ်ယူပို့ဆောင်ခြင်းကို cytoplasmic transfer protein တွေက မလုပ်ဆောင်ဘဲ yeast လိုမျိုး GPI anchors တွေရဲ့ ပေါင်းစပ်မှုပေါ်မှာ မူတည်တယ်လို့ ထောက်ခံပါတယ်။ ဒါကြောင့်၊ evolutionary conservative ယန္တရားဟာ အလွန်ရှည်လျားတဲ့ acyl chain ceramide နဲ့ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ကို transport vesicle တစ်ခုတည်းမှာ ရွေးချယ်ပြီး ပူးတွဲသယ်ယူပို့ဆောင်နိုင်ပုံရပါတယ်။
တဆေးနှင့် နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ polarized epithelial ဆဲလ်စနစ်များတွင်၊ အခြား plasma membrane protein များမှ GPI-AP စုစည်းမှုနှင့် ခွဲထွက်မှုအားလုံးသည် ဆဲလ်မျက်နှာပြင်သို့ မရောက်မီ ဖြစ်ပေါ်သည်။ Paladino et al. (48) သည် နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ polarized epithelial ဆဲလ်များ၏ TGN တွင်၊ GPI-AP clustering သည် apical plasma membrane သို့ GPI-APs များကို ရွေးချယ်ခွဲခြားရန်အတွက်သာမက GPI-APs များ၏ clustering အဖွဲ့အစည်းနှင့် ၎င်း၏ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကိုလည်း ထိန်းညှိပေးကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဆဲလ်မျက်နှာပြင်။ တဆေးတွင်၊ ဤလေ့လာမှုက ER ရှိ C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster သည် plasma membrane ရှိ GPI-AP ၏ cluster အဖွဲ့အစည်းနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိပေးနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (24, 49)။ ဤမော်ဒယ်နှင့်အညီ၊ GhLag1 ဆဲလ်များသည် GPI inhibitors သို့မဟုတ် ဆဲလ်နံရံ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုကို ထိခိုက်စေသော ဆေးဝါးများ (28) နှင့် ဓာတ်မတည့်ဖြစ်ပြီး၊ တဆေးဆဲလ်များ၏ မိတ်လိုက်ခြင်းတွင် projected လုပ်ထားသော tip ceramide ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ရှိသော Gas1-GFP clusters (49) အတွက် လိုအပ်ချက်သည် G ကို ညွှန်ပြသည်။ hLag1 ဆဲလ်များ၏ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်များ။ GPI-AP အမှား။ သို့သော်၊ ဆဲလ်မျက်နှာပြင်၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ စီစဉ်ဖွဲ့စည်းပုံကို lipid အရှည်အပေါ်အခြေခံ၍ စီစစ်ခြင်းနည်းလမ်းဖြင့် ER မှ ပရိုဂရမ်ရေးဆွဲထားခြင်း ရှိ၊ မရှိကို နောက်ထပ်စမ်းသပ်ခြင်းသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ အနာဂတ်သုတေသန၏ အကြောင်းအရာဖြစ်လိမ့်မည်။
ဤလုပ်ငန်းတွင်အသုံးပြုသော Saccharomyces cerevisiae မျိုးကွဲများကို ဇယား S1 တွင်ဖော်ပြထားပါသည်။ အသက်ရှင်သောဆဲလ်ပုံရိပ်ဖော်ရန်အတွက် SCLIM ၏ MMY1583 နှင့် MMY1635 မျိုးကွဲများကို W303 ၏နောက်ခံတွင်တည်ဆောက်ခဲ့သည်။ fluorescent protein tag ပါရှိသော Sec13-mCherry ကိုဖော်ပြသော ဤမျိုးကွဲများကို pFA6a plasmid ကို template အဖြစ် (23) ဖြင့် polymerase chain reaction (PCR)-based နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ တည်ဆောက်ခဲ့သည်။ GAL1 promoter ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် fluorescent protein ဖြင့် label လုပ်ထားသော Mid2-iRFP ကိုဖော်ပြသော မျိုးကွဲကို အောက်ပါအတိုင်းတည်ဆောက်ခဲ့သည်။ pKTiRFP-KAN vector (E. O'Shea ၏လက်ဆောင်၊ Addgene plasmid number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) မှ iRFP-KanMx sequence ၏ PCR amplification နှင့် endogenous Mid2 ၏ C-terminus ထဲသို့ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ Mid2-iRFP genome sequence ကို ချဲ့ထွင်ပြီး GAL1 promoter ထဲသို့ clone လုပ်ပြီးနောက်၊ ၎င်းကို integration plasmid pRS306 ၏ Not I-Sac I site ထဲသို့ integrate လုပ်ခဲ့သည်။ ရလဒ် plasmid pRGS7 ကို Pst I ဖြင့် linearized လုပ်ကာ URA3 locus ထဲသို့ integrate လုပ်ခဲ့သည်။
Gas1-GFP fusion gene ကို centromere (CEN) plasmid ရှိ GAL1 promoter ၏ ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် ဖော်ပြထားပြီး အောက်ပါအတိုင်း တည်ဆောက်ထားသည်။ Gas1-GFP sequence ကို pRS416-GAS1-GFP plasmid (24) (L. Popolo မှ လက်ဆောင်) မှ PCR ဖြင့် ချဲ့ထွင်ပြီး CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (C မှ လက်ဆောင်) ၏ Xma I–Xho I site ထဲသို့ clone လုပ်ခဲ့သည်။ Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)။ ရရှိလာသော plasmid ကို pRGS6 ဟု အမည်ပေးခဲ့သည်။ Axl2-GFP fusion gene ကို pBEVY-GL LEU2 vector ၏ GAL1 promoter ၏ ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင်လည်း ဖော်ပြထားပြီး ၎င်း၏ တည်ဆောက်ပုံမှာ အောက်ပါအတိုင်း ဖြစ်သည်။ Axl2-GFP အစီအစဥ်ကို pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) မှ PCR ဖြင့် ချဲ့ထွင်ခဲ့ပြီး pBEVY-GL LEU2 vector ၏ Bam HI-Pst I site ထဲသို့ ကလෝနင်းပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ရရှိလာသော plasmid ကို pRGS12 ဟု အမည်ပေးခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင် အသုံးပြုသော oligonucleotides များ၏ အစီအစဥ်ကို ဇယား S2 တွင် ဖော်ပြထားသည်။
ထိုမျိုးကွဲကို အာဟာရအတွက် လိုအပ်သော သင့်လျော်သော အမိုင်နိုအက်ဆစ်များနှင့် အခြေခံများကို ဖြည့်စွက်ရန်အတွက် 0.2% adenine နှင့် 2% glucose [YP-dextrose (YPD)]၊ 2% raffinose [YP-raffinose] ကြွယ်ဝသော တဆေးထုတ်ယူမှု ပရိုတင်း p (YP) အလတ်စား (1 % တဆေးထုတ်ယူမှုနှင့် 2% ပရိုတင်း ept)။ (YPR)] သို့မဟုတ် 2% galactose [YP-galactose (YPG)] ကို ကာဗွန်ရင်းမြစ်အဖြစ် သို့မဟုတ် ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြုလုပ်ထားသော အနည်းဆုံးအလတ်စား (0.15% တဆေးနိုက်ထရိုဂျင်အခြေခံနှင့် 0.5% ammonium sulfate) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ခဲ့ပြီး၊ ကာဗွန်ရင်းမြစ်အဖြစ် 2% glucose (ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြုလုပ်ထားသော glucose အနည်းဆုံးအလတ်စား) သို့မဟုတ် 2% galactose (ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပြုလုပ်ထားသော galactose အနည်းဆုံးအလတ်စား) ပါဝင်သည်။
အချိန်နှင့်တပြေးညီ ပုံရိပ်ဖော်ရန်အတွက်၊ GAL1 ပရိုမိုတာအောက်ရှိ တည်ဆောက်ပုံကို ဖော်ပြသည့် အပူချိန်အာရုံခံနိုင်သော sec31-1 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုဆဲလ်များကို YPR အလတ်စားတွင် ၂၄°C တွင် တစ်ညလုံး အလယ်အလတ်အဆင့်အထိ ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ ၂၄°C တွင် YPG တွင် ၁ နာရီကြာ induction ပြီးနောက်၊ ဆဲလ်များကို SG တွင် ၃၇°C တွင် ၃၀ မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက် secretion block မှ ထုတ်လွှတ်ရန် ၂၄°C သို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ Concanavalin A ကို ဆဲလ်များကို ဖန်ဆလိုက်ပေါ်တွင် တပ်ဆင်ရန်နှင့် SCLIM မှ ပုံရိပ်ဖော်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ SCLIM သည် Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope နှင့် UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus)၊ မြန်နှုန်းမြင့်နှင့် မြင့်မားသော signal-to-noise ratio rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric)၊ custom spectrometer နှင့် custom cooling တို့ကို ပေါင်းစပ်ထားခြင်း ဖြစ်သည်။ စနစ်၏ image intensifier (Hamamatsu Photonics) သည် ×266.7 ၏ နောက်ဆုံး magnification ရှိသော magnifying lens system နှင့် electrons များကို များပြားစေသော charge-coupled device camera (Hamamatsu Photonics) (21) ကို ပေးစွမ်းနိုင်သည်။ Image acquisition ကို custom software (Yokogawa Electric) မှ လုပ်ဆောင်သည်။ 3D images အတွက်၊ objective lens ကို vertical vibrate လုပ်ရန် custom-made piezoelectric actuator ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး optical parts များကို stack တွင် 100 nm ခြား၍ စုဆောင်းခဲ့သည်။ Z-stack image ကို 3D voxel data အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲပြီး rotating disc confocal microscope အတွက် အသုံးပြုသော theoretical point spread function ကို Volocity software (PerkinElmer) မှ deconvolution processing အတွက် အသုံးပြုသည်။ Volocity ဆော့ဖ်ဝဲလ်ကို အသုံးပြု၍ ပူးတွဲတည်နေရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အလိုအလျောက် သတ်မှတ်ချက်စံနှုန်းများ သတ်မှတ်ပေးခြင်းဖြင့် ကုန်စည်အပါအဝင် ERES ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ လိုင်းစကင်န် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို MetaMorph ဆော့ဖ်ဝဲလ် (Molecular Devices) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
စာရင်းအင်းဆိုင်ရာ အရေးပါမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် GraphPad Prism ဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြုပါ။ two-tailed Student's t-test နှင့် ordinary one-way analysis of variance (ANOVA) စမ်းသပ်မှုအတွက်၊ အုပ်စုများအကြား ကွာခြားချက်များသည် P <0.05 (*) တွင် သိသာထင်ရှားသော သက်ရောက်မှုရှိသည်ဟု ယူဆရသည်။
Gas1-GFP ၏ fluorescence microscopy အတွက်၊ log phase ဆဲလ်များကို YPD တွင် တစ်ညလုံးကြီးထွားစေပြီး centrifugation ဖြင့်စုဆောင်းကာ phosphate buffered saline ဖြင့် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောကာ ရေခဲပေါ်တွင် အနည်းဆုံး 15 မိနစ်ခန့် ထားပြီးနောက် ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း မိုက်ခရိုစကုပ်အောက်တွင် ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (24)။ objective lens၊ L5 (GFP) filter၊ Hamamatsu ကင်မရာနှင့် Application Suite X (LAS X) software တပ်ဆင်ထားသော Leica DMi8 မိုက်ခရိုစကုပ် (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ကို ရယူရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။
နမူနာများကို SDS နမူနာဘာဖာဖြင့် ၆၅°C တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့် denatured လုပ်ပြီးနောက် SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) ဖြင့် ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ immunoblotting ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ လမ်းကြောင်းတစ်ခုလျှင် နမူနာ ၁၀ μl ထည့်ခဲ့သည်။ Primary antibody: 1:3000 ရောစပ်ထားသော အရည်တွင် rabbit polyclonal anti-Gas1 ကို၊ 1:500 ရောစပ်ထားသော အရည်တွင် rabbit polyclonal anti-Emp24 ကို နှင့် 1:3000 ရောစပ်ထားသော အရည်တွင် rabbit polyclonal anti-GFP (H. Riezman မှ လက်ဆောင်) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody ကို 1:5000 ရောစပ်ထားသော အရည်တွင် အသုံးပြုခဲ့သည် (J. de la Cruz မှ လက်ဆောင်)။ secondary antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) ကို 1:3000 ရောစပ်ထားသော အရည်တွင် အသုံးပြုခဲ့သည် (Pierce)။ HRP-conjugated goat anti-mouse IgG ကို 1:3000 (Pierce) ရောစပ်၍ အသုံးပြုခဲ့သည်။ SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific) ၏ chemiluminescence နည်းလမ်းဖြင့် ကိုယ်ခံအားတုံ့ပြန်မှုဇုန်ကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့ရသည်။
(31) တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ ကြွယ်ဝသော ER အပိုင်းပေါ်တွင် သဘာဝ immunoprecipitation စမ်းသပ်မှုတစ်ခုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် yeast ဆဲလ်များကို TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride နှင့် protease inhibitor mixture) ဖြင့် 600 nm (OD600) တွင် 100 optical density တွင် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောပါ။ ၎င်းကို ဖန်ပုတီးများဖြင့် ခွဲပြီးနောက် ဆဲလ်အပျက်အစီးများနှင့် ဖန်ပုတီးများကို centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထို့နောက် supernatant ကို 4°C တွင် 17,000 g တွင် 15 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ pellet ကို TNE တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး digitalis saponin ကို 1% နောက်ဆုံးပါဝင်မှုအထိ ထည့်ပါ။ suspension ကို 4°C တွင် လည်ပတ်ခြင်းဖြင့် 1 နာရီကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက် မပျော်ဝင်နိုင်သော အစိတ်အပိုင်းများကို 4°C တွင် 13,000 g တွင် 60 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ Gas1-GFP immunoprecipitation အတွက်၊ ဦးစွာ agarose beads အချည်းနှီး (ChromoTek) ဖြင့် နမူနာကို ၄°C တွင် ၁ နာရီကြာ ကြိုတင် incubate လုပ်ပြီးနောက် GFP-Trap_A (ChromoTek) ဖြင့် ၄°C တွင် ၃ နာရီကြာ incubation လုပ်ပါ။ Immunoprecipitation လုပ်ထားသော beads များကို digoxigenin ၀.၂% ပါဝင်သော TNE ဖြင့် ငါးကြိမ်ဆေးကြောပြီး၊ SDS sample buffer ဖြင့် elastized လုပ်ကာ SDS-PAGE တွင် ခွဲထုတ်ကာ immunoblotting ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
(31) တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ ကြွယ်ဝသော ER အပိုင်းပေါ်တွင် cross-linking ဆုံးဖြတ်ချက်ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် ကြွယ်ဝသော ER အပိုင်းကို 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 မိနစ်) ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ glycine (50 mM နောက်ဆုံးပါဝင်မှု၊ 5 မိနစ်၊ 20°C) ကိုထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် crosslinking ဓာတ်ပြုမှုကို ငြိမ်းသတ်ခဲ့သည်။
ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း (50)၊ wild-type နှင့် GhLag1 မျိုးကွဲများတွင် ceramide ၏ MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ဆဲလ်များကို 30°C တွင် YPD တွင် exponential phase (3 မှ 4 OD600 units/ml) အထိ ကြီးထွားစေပြီး ဆဲလ် 25×107 ကို စုဆောင်းခဲ့သည်။ ၎င်းတို့၏ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို trichloroacetic acid ဖြင့် ငြိမ်းသတ်သည်။ ထုတ်ယူခြင်းပျော်ရည် [အီသနော၊ ရေ၊ အီသာ၊ pyridine နှင့် 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] နှင့် internal standard C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) quality 1.2 nmol ကို အသုံးပြုပါ။ ထုတ်ယူမှုကို အပျော့စား alkaline hydrolysis လုပ်ဆောင်ရန် monomethylamine reagent [methanol၊ ရေ၊ n-butanol နှင့် methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] ကို အသုံးပြုပြီးနောက် ရေတွင်ပျော်ဝင်နေသော n-butanol ကို အသုံးပြု၍ ဆားကို ချေဖျက်သည်။ နောက်ဆုံးအနေနဲ့၊ ထုတ်ယူထားတဲ့အရာကို positive mode solvent [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] မှာ ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး mass spectrometer ထဲကို ထိုးသွင်းခဲ့ပါတယ်။ sphingolipid မော်လီကျူးတွေကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပြီး ပမာဏသတ်မှတ်ဖို့အတွက် Multi-reaction monitoring (MRM) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါတယ်။ TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) မှာ lipid analysis အတွက် robotic nanoflow ion source Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) တပ်ဆင်ထားပါတယ်။ collision energy ကို ceramide category တစ်ခုစီအတွက် အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားပါတယ်။ MS data ကို positive mode မှာ ရရှိခဲ့ပါတယ်။ biological replicate တစ်ခုစီအတွက် lipid signal ဟာ လွတ်လပ်တဲ့ တိုင်းတာမှုသုံးခုရဲ့ median ဖြစ်ပါတယ်။
(31) တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ Gas1-GFP ကိုဖော်ပြသောဆဲလ်များ (800×107) ကိုသဘာဝ immunoprecipitation ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ သန့်စင်ထားသော Gas1-GFP ကို ​​SDS-PAGE ဖြင့်ခွဲထုတ်ပြီး polyvinylidene fluoride (PVDF) အမြှေးပါးသို့လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ PVDF ကို amide black ဖြင့်ဆိုးခြင်းဖြင့် ပရိုတင်းကိုမြင်နိုင်သည်။ Gas1-GFP band ကို PVDF မှဖြတ်ပြီး methanol ဖြင့် ၅ ကြိမ်နှင့် liquid chromatography-MS (LC-MS) grade water ဖြင့်တစ်ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်။ membrane strip ကို 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)၊ buffer နှင့် 500μl အသစ်ပျော်ဝင်နေသော 1 M sodium nitrite mixture တို့ဖြင့် 37°C တွင် ၃ နာရီကြာ incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် lipid fraction ကို Gas1-GFP မှထုတ်လွှတ်ပြီး lysis လုပ်သည်။ glucosamine နှင့် inositol (51) အကြားတွင် inosine phosphate ceramide ထုတ်လွှတ်သည်။ ထို့နောက် အမြှေးပါးအစင်းကို LC-MS အဆင့်ရေဖြင့် လေးကြိမ်ဆေးကြောပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် အခြောက်ခံကာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီ -80°C ရှိ နိုက်ထရိုဂျင်လေထုတွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ ထိန်းချုပ်မှုအနေဖြင့် PVDF အမြှေးပါး၏ ဗလာနမူနာတစ်ခုကို စမ်းသပ်မှုတစ်ခုစီအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Gas1-GFP မှထုတ်ယူထားသော lipid ကို ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း MS ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (50)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် GPI-lipid ပါ၀င်သော PVDF အစင်းများကို 75μl negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး electrospray ionization (ESI)-MRM/MS sphingolipid မျိုးစိတ်များ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (TSQ Vantage) ကို အောင်မြင်စွာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဤကိစ္စတွင် MS အချက်အလက်များကို negative ion mode ဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။
အစောပိုင်းက ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ GPI anchor ၏ lipid အပိုင်းကို [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16) မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ lipid များကို solvent system (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ကို အသုံးပြု၍ thin-layer chromatography ဖြင့် ခွဲထုတ်ခဲ့ပြီး FLA-7000 (Fujifilm) ကို အသုံးပြု၍ မြင်သာအောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
Gas1-GFP (600×107) ကို ဖော်ပြသောဆဲလ်များကို TNE buffer ဖြင့် TNE buffer ဖြင့် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောပြီး ဖန်အမှုန်များဖြင့် ခွဲကာ ဆဲလ်အပျက်အစီးများနှင့် ဖန်အမှုန်များကို ဖယ်ရှားရန် centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် supernatant ကို 4°C တွင် 17,000 g တွင် 1 နာရီကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ pellet ကို TNE တွင်ဆေးကြောပြီး 0.2% digitalis saponin ပါဝင်သော TNE တွင် 1 U PI-PLC (Invitrogen) ဖြင့် 37°C တွင် 1 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ enzyme treatment ပြီးနောက် membrane ကို 4°C တွင် 17,000 g တွင် 1 နာရီကြာ centrifuge လုပ်ခြင်းဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ Gas1-GFP ကို ​​immunoprecipitate လုပ်ရန်အတွက် supernatant ကို 4°C တွင် GFP-Trap_A (ChromoTek) ဖြင့် တစ်ညလုံး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ SDS-PAGE မှ ခွဲထုတ်ထားသော သန့်စင်ထားသော Gas1-GFP ကို ​​Coomassie brilliant blue ဖြင့် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ Gas1-GFP ဆိုးဆေးအစင်းကို ရေပြွန်ပတ်လည်ရှိ မီးခိုးရောင်မှ ဖြတ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ iodoacetamide ဖြင့် alkylation ပြုလုပ်ပြီး dithiothreitol ဖြင့် reduction ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ trypsin ဖြင့် in-gel digestion ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထုတ်ယူပြီး tryptic peptides များနှင့် peptides များကို GPI-glycans ဖြင့် အခြောက်ခံပါ။ အခြောက်ခံထားသော peptide ကို ရေ 20 μl တွင် ပျော်ဝင်စေပါ။ LC ထဲသို့ အပိုင်းတစ်ပိုင်း (8μl) ထိုးသွင်းပါ။ octadecylsilane (ODS) column (Develosil 300ODS-HG-5; inner diameter 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ကို သတ်မှတ်ထားသော gradient အခြေအနေများအောက်တွင် peptides များကို ခွဲထုတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ mobile phase မှာ solvent A (0.08% formic acid) နှင့် solvent B (0.15% formic acid in 80% acetonitrile) ဖြစ်သည်။ Accela HPLC စနစ် (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ကို အသုံးပြု၍ ကော်လံကို 50 μl min-1 စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် 5 မိနစ်ကြာ elute လုပ်ပြီးနောက် solvent B ၏ ပါဝင်မှုကို 40% အထိ တိုးမြှင့်ခဲ့သည်။ (အမေရိကန်ပြည်ထောင်စု)။ eluate ကို ESI အိုင်းယွန်းရင်းမြစ်ထဲသို့ အဆက်မပြတ်ထည့်သွင်းခဲ့ပြီး tryptic peptides နှင့် GPI-glycans ပါသော peptides များကို LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ MS setup တွင် capillary source ၏ voltage ကို 4.5 kV ဟုသတ်မှတ်ထားပြီး transfer capillary ၏ အပူချိန်ကို 300°C တွင်ထားရှိခဲ့သည်။ capillary voltage နှင့် tube lens voltage ကို အသီးသီး 15 V နှင့် 50 V ဟုသတ်မှတ်ထားသည်။ MS အချက်အလက်များကို positive ion mode (resolution 60,000; mass accuracy 10 parts per million) ဖြင့် 300/m/z mass/charge ratio (m/z) 3000 ၏ mass range တွင် ရရှိခဲ့ပါသည်။ MS/MS အချက်အလက်များကို LTQ Orbitrap XL ရှိ ion trap [data ပေါ်မူတည်သည့် ပထမ 3 လုံး၊ collision induced dissociation (CID)] မှတစ်ဆင့် ရရှိခဲ့ပါသည်။
GROMACS (52) ဆော့ဖ်ဝဲနှင့် MARTINI 2 force field (53-55) ကို အသုံးပြု၍ MD simulation များကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ကို dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) နှင့် Cer C18 သို့မဟုတ် DOPC နှင့် Cer C26 ပါ၀င်သော bilayer တစ်ခုတည်ဆောက်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Cer C26 ၏ topology နှင့် coordinates များကို sphingosine tail မှ အပို bead များကို ဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် DXCE မှ ရယူသည်။ double layer ကို ဟန်ချက်ညီအောင်ထိန်းပြီး ၎င်းကို run ရန် အောက်တွင်ဖော်ပြထားသော လုပ်ငန်းစဉ်ကို အသုံးပြုပြီးနောက် Emp24 ပါ၀င်သော system တစ်ခုတည်ဆောက်ရန် system ၏ နောက်ဆုံး coordinates များကို အသုံးပြုပါ။ yeast Emp24 (residues 173 မှ 193) ၏ transmembrane domain ကို visual MD (VMD) tool molecular structure (58) ကို အသုံးပြု၍ α-helix အဖြစ် တည်ဆောက်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ထပ်နေသော lipids များကို ဖယ်ရှားပြီးနောက် protein ကို ကြမ်းတမ်းစွာ granulated လုပ်ကာ CHARMM GUI ကို အသုံးပြု၍ bilayer ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးစနစ်တွင် DOPC 1202 နှင့် Cer C26 302 သို့မဟုတ် DOPC 1197 နှင့် Cer C18 နှင့် Emp24 295 တို့ ပါဝင်သည်။ စနစ်ကို 0.150M အာရုံစူးစိုက်မှုအထိ အိုင်းယွန်းဓာတ်တိုးစေပါ။ နှစ်ထပ်ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းပုံနှစ်ခုအတွက် လွတ်လပ်သောထပ်တူပြုမှုလေးခုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
lipid bilayer ကို CHARMM GUI လုပ်ငန်းစဉ်ကို အသုံးပြု၍ ဟန်ချက်ညီအောင်ပြုလုပ်ထားပြီး ၎င်းတွင် အဆင့် ၄၀၅,၀၀၀ ကို လျှော့ချပြီးနောက် ဟန်ချက်ညီအောင်ပြုလုပ်ခြင်းပါဝင်ပြီး အနေအထားကန့်သတ်ချက်များကို တဖြည်းဖြည်းလျှော့ချပြီး ဖယ်ရှားကာ အချိန်အဆင့်ကို 0.005 ps မှ 0.02 ps အထိ တိုးမြှင့်ထားသည်။ ဟန်ချက်ညီပြီးနောက်၊ အချိန်အဆင့် 0.02 ps ဖြင့် 6 µs ကို ထုတ်လုပ်ပေးသည်။ Emp24 ကိုထည့်သွင်းပြီးနောက်၊ စနစ်ကို လျှော့ချပြီး ဟန်ချက်ညီအောင်ပြုလုပ်ရန် CHARMM GUI လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုတည်းကို အသုံးပြုပြီးနောက် ထုတ်လုပ်မှုတွင် 8 စက္ကန့်ကြာ လုပ်ဆောင်ပါ။
စနစ်အားလုံးအတွက်၊ ဟန်ချက်ညီစေသောလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ ဖိအားကို Berendsen barostat (59) မှ ထိန်းချုပ်ပြီး ထုတ်လုပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ ဖိအားကို Parrinello-Rahman barostat (60) မှ ထိန်းချုပ်သည်။ အခြေအနေအားလုံးတွင်၊ ပျမ်းမျှဖိအားသည် 1 bar ဖြစ်ပြီး semi-isotropic pressure coupling ပုံစံကို အသုံးပြုသည်။ ဟန်ချက်ညီစေသောနှင့် ထုတ်လုပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်တွင်၊ speed recalibration ပါရှိသော thermostat (61) ကို ပရိုတင်း၊ lipid နှင့် solvent အမှုန်များ၏ အပူချိန်ကို အသီးသီးချိတ်ဆက်ရန် အသုံးပြုသည်။ လည်ပတ်မှုတစ်လျှောက်လုံးတွင်၊ target temperature သည် 310K ဖြစ်သည်။ non-bonding interaction ကို 0.005 buffer tolerance ရှိသော Verlet ပုံစံကို အသုံးပြု၍ pairing list တစ်ခုကို ထုတ်လုပ်ခြင်းဖြင့် တွက်ချက်သည်။ Coulomb term ကို reaction field နှင့် 1.1 nm cut-off distance ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်သည်။ Vander Waals ပုံစံသည် 1.1 nm cut-off distance ရှိသော cut-off ပုံစံကို အသုံးပြုပြီး Verlet cut-off ပုံစံကို potential drift အတွက် အသုံးပြုသည် (62)။
VMD ကို အသုံးပြု၍ DOPC phosphate beads သို့မဟုတ် ceramide AM1 beads များနှင့် ပရိုတင်းအကြား cutoff wavelength သည် 0.7 nm ဖြစ်ပြီး ပရိုတင်းနှင့် ဓါတ်ပြုသော lipids အရေအတွက်ကို တွက်ချက်သည်။ အောက်ပါဖော်မြူလာအရ၊ (63) တွင်ကဲ့သို့ depletion-enrichment (DE) factor ကို တွက်ချက်ပါ- DE factor = (ပရိုတင်း 0.7 ရှိ စုစုပေါင်း lipids ပမာဏ) ပရိုတင်း 0.7 ရှိ (စုစုပေါင်း lipids ရှိ Cer ပမာဏ)
အစီရင်ခံတင်ပြထားသော တန်ဖိုးကို ပျမ်းမျှအဖြစ် ရရှိပြီး အမှားဘားများသည် SE ၏ သီးခြားမိတ္တူလေးခုဖြစ်သည်။ DE factor ၏ စာရင်းအင်းဆိုင်ရာ အရေးပါမှုကို t စမ်းသပ်မှု [(averageDE-factor-1)/SE] ဖြင့် တွက်ချက်သည်။ one-tailed distribution မှ P တန်ဖိုးကို တွက်ချက်ပါ။
GROMACS ကိရိယာကို trace ၏ နောက်ဆုံး 250 ns အတွင်း Emp24 ပါဝင်သော စနစ်၏ 2D lateral density map ကို တွက်ချက်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ceramide ၏ enrichment/depletion map ကိုရရှိရန်အတွက် Cer ၏ density map ကို Cer နှင့် DOPC map ပေါင်းလဒ်ဖြင့် စားပြီးနောက် ခန္ဓာကိုယ်အတွင်းရှိ Cer ၏ ပါဝင်မှုဖြင့် စားသည်။ တူညီသော color map scale ကို အသုံးပြုသည်။
ဤဆောင်းပါးအတွက် ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများအတွက် http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ကိုကြည့်ပါ။
ဤသည်မှာ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ၏ စည်းကမ်းချက်များအောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသော အခမဲ့ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုနိုင်သော ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ဖြစ်ပြီး မူရင်းလက်ရာသည် မှန်ကန်ကြောင်း အခြေခံအားဖြင့် နောက်ဆုံးအသုံးပြုမှုသည် စီးပွားဖြစ်အကျိုးအမြတ်အတွက် မဟုတ်သရွေ့ မည်သည့်မီဒီယာဖြင့်မဆို အသုံးပြုခြင်း၊ ဖြန့်ဖြူးခြင်းနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခြင်းကို ခွင့်ပြုထားသည်။ ကိုးကားချက်။
မှတ်ချက်- စာမျက်နှာသို့ သင်အကြံပြုထားသော ပုဂ္ဂိုလ်သည် သင်သည် အီးမေးလ်ကို မြင်စေလိုကြောင်းနှင့် ၎င်းသည် spam မဟုတ်ကြောင်း သိရှိစေရန်အတွက် သင့်အီးမေးလ်လိပ်စာကို ပေးရန်သာ ကျွန်ုပ်တို့ တောင်းဆိုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မည်သည့်အီးမေးလ်လိပ်စာကိုမျှ မရယူပါ။
ဒီမေးခွန်းကို သင်ဟာ လာရောက်လည်ပတ်သူ ဟုတ်မဟုတ် စမ်းသပ်ဖို့နဲ့ အလိုအလျောက် spam တင်သွင်းမှုကို ကာကွယ်ဖို့ အသုံးပြုပါတယ်။
Sofia Rodriguez-Gallardo၊ Kazuo Kurokawa၊ Susana Sabido-Bozo၊ Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero၊ Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D မြင့်မားသော ရုပ်ထွက်အရည်အသွေးရှိသော အချိန်နှင့်တပြေးညီ ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းသည် ရွေးချယ်ထားသော အထွက်နေရာများတွင် ပရိုတင်းစီစစ်ခြင်းအတွက် ceramide ကွင်းဆက်အရှည်၏ အရေးပါမှုကို ဖော်ပြသည်။
Sofia Rodriguez-Gallardo၊ Kazuo Kurokawa၊ Susana Sabido-Bozo၊ Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero၊ Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D မြင့်မားသော ရုပ်ထွက်အရည်အသွေးရှိသော အချိန်နှင့်တပြေးညီ ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းသည် ရွေးချယ်ထားသော အထွက်နေရာများတွင် ပရိုတင်းစီစစ်ခြင်းအတွက် ceramide ကွင်းဆက်အရှည်၏ အရေးပါမှုကို ဖော်ပြသည်။
© 2020 သိပ္ပံတိုးတက်မှုအတွက် အမေရိကန်အသင်း။ မူပိုင်ခွင့်ကိုလက်ဝယ်ထားသည်။ AAAS သည် HINARI၊ AGORA၊ OARE၊ CHORUS၊ CLOCKSS၊ CrossRef နှင့် COUNTER ၏ ပါတနာဖြစ်သည်။ ScienceAdvances ISSN 2375-2548။