အသည်းမာကျောခြင်းရှိသော လူနာများတွင် အူမှဆင်းသက်လာသော tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA) ၏ သွေးရည်ကြည်အဆင့်များသည် နည်းပါးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ယခင်က တင်ပြခဲ့ပါသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ အဝလွန်သောအသည်းများရှိ transcriptome နှင့် DNA methylome တို့ကို သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်နှင့် ဆက်စပ်၍ စစ်ဆေးခဲ့ရုံသာမက in vitro တွင် hepatic stellate cells (HSCs) ၏ phenotypic inactivation ကို လှုံ့ဆော်ရာတွင် IPA ၏ အခန်းကဏ္ဍကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ လေ့လာခဲ့ပါသည်။
လေ့လာမှုတွင် Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS) တွင် bariatric ခွဲစိတ်မှုခံယူခဲ့သော အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါ (T2DM) မရှိသော အဝလွန်လူနာ ၁၁၆ ဦး (အသက် ၄၆.၈ ± ၉.၃ နှစ်၊ BMI: ၄၂.၇ ± ၅.၀ kg/m²) ပါဝင်သည်။ သွေးလည်ပတ်မှု IPA အဆင့်များကို liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့ပြီး အသည်း transcriptome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို total RNA sequencing ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး DNA methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို Infinium HumanMethylation450 BeadChip ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ in vitro စမ်းသပ်ချက်များအတွက် Human hepatic stellate ဆဲလ်များ (LX-2) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။
သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များသည် အသည်းရှိ apoptosis၊ mitophagic နှင့် longevity လမ်းကြောင်းများတွင် ပါဝင်သော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) မျိုးဗီဇသည် အသည်း transcript နှင့် DNA methylation profiles များတွင် အပေါများဆုံးနှင့် လွှမ်းမိုးနိုင်သော အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်သည့် မျိုးဗီဇဖြစ်သည်။ IPA ကုသမှုသည် apoptosis၊ mitochondrial respiration လျော့နည်းခြင်းနှင့် LX-2 ဆဲလ်များ၏ fibrosis၊ apoptosis နှင့် ရှင်သန်မှုကို ထိန်းညှိပေးသည်ဟု လူသိများသော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် mitochondrial dynamics ကို ပြောင်းလဲစေခဲ့သည်။
ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ဤအချက်အလက်များက IPA သည် ကုထုံးဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိပြီး apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေပြီး HSC phenotype ကို မလှုပ်မရှားအခြေအနေသို့ပြောင်းလဲစေနိုင်ကြောင်း၊ ထို့ကြောင့် HSC activation နှင့် mitochondrial metabolism ကို အနှောင့်အယှက်ပေးခြင်းဖြင့် အသည်း fibrosis ကို ဟန့်တားနိုင်ခြေကို ချဲ့ထွင်ပေးကြောင်း ထောက်ခံပါသည်။
အဝလွန်ခြင်းနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ရောဂါလက္ခဏာစု ပျံ့နှံ့မှုသည် ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့်ဆက်စပ်သော အဆီဖုံးအသည်းရောဂါ (MASLD) ဖြစ်ပွားမှု တိုးပွားလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေပါသည်။ ဤရောဂါသည် ယေဘုယျလူဦးရေ၏ 25% မှ 30% ကို ထိခိုက်စေပါသည် [1]။ MASLD ရောဂါဗေဒ၏ အဓိကအကျိုးဆက်မှာ အသည်းအမာရွတ်ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် အမျှင်ပြင်ပ မက်ထရစ် (ECM) စဉ်ဆက်မပြတ်စုပုံခြင်းဖြင့် လက္ခဏာရပ်ပြသော ပြောင်းလဲတတ်သော ဖြစ်စဉ်တစ်ခုဖြစ်သည် [2]။ အသည်းအမာရွတ်ဖြစ်ခြင်းတွင် ပါဝင်သော အဓိကဆဲလ်များမှာ hepatic stellate cells (HSCs) များဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းတို့တွင် လူသိများသော phenotype လေးခုရှိသည်- quiescent၊ activated၊ inactivated နှင့် senescent [3, 4]။ HSCs များကို အသက်ဝင်စေပြီး ငြိမ်သက်သောပုံစံမှ စွမ်းအင်လိုအပ်ချက်များသော proliferative fibroblast-like ဆဲလ်များအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲနိုင်ပြီး α-smooth muscle actin (α-SMA) နှင့် type I collagen (Col-I) ၏ ဖော်ပြမှု မြင့်တက်လာသည် [5, 6]။ အသည်းအမာရွတ် ပြောင်းပြန်ဖြစ်နေစဉ်အတွင်း အသက်ဝင်သော HSCs များကို apoptosis သို့မဟုတ် inactivation မှတစ်ဆင့် ဖယ်ရှားပစ်ပါသည်။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်များတွင် ဖိုင်ဘရိုဂျင်နစ် မျိုးရိုးဗီဇများကို လျှော့ချခြင်းနှင့် ရှင်သန်နိုင်သော မျိုးရိုးဗီဇများ (NF-κB နှင့် PI3K/Akt အချက်ပြလမ်းကြောင်းများကဲ့သို့) ကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်း [7၊ 8] အပြင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်တွင် ပြောင်းလဲမှုများ ပါဝင်သည် [9]။
အူလမ်းကြောင်းတွင်ထုတ်လုပ်သော tryptophan metabolite indole-3-propionic acid (IPA) ၏ သွေးရည်ကြည်အဆင့်များသည် MASLD အပါအဝင် လူသားဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာရောဂါများတွင် လျော့နည်းသွားကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် [10–13]။ IPA သည် အစားအသောက်အမျှင်ဓာတ်စားသုံးမှုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ၎င်း၏ antioxidant နှင့် ရောင်ရမ်းမှုကို ဆန့်ကျင်သည့် အာနိသင်များကြောင့် လူသိများပြီး အစားအသောက်ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်သော အရက်မဟုတ်သော steatohepatitis (NASH) phenotype ကို in vivo နှင့် in vitro [11–14] တွင် လျော့ပါးစေသည်။ Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS) တွင် အသည်းအမာရွတ်မရှိသော အဝလွန်လူနာများထက် အသည်းအမာရွတ်ရှိသောလူနာများတွင် သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များ နည်းပါးကြောင်း ပြသခဲ့သည့် ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လေ့လာမှုမှ အထောက်အထားအချို့ ထွက်ပေါ်လာသည်။ ထို့အပြင်၊ IPA ကုသမှုသည် လူ့ hepatic stellate cell (LX-2) မော်ဒယ်တွင် ဆဲလ်ကပ်ငြိမှု၊ ဆဲလ်ရွှေ့ပြောင်းမှုနှင့် hematopoietic stem cell activation တို့၏ ဂန္ထဝင်အမှတ်အသားများဖြစ်သော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုကို လျှော့ချနိုင်ပြီး အသည်းကို ကာကွယ်ပေးသော metabolite တစ်ခုဖြစ်နိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသခဲ့သည် [15]။ သို့သော် IPA သည် HSC apoptosis နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝစွမ်းအင်များကို အသက်ဝင်စေခြင်းဖြင့် အသည်းအမာရွတ်ပြန်လည်ကျုံ့ခြင်းကို မည်သို့ဖြစ်ပေါ်စေသည်ကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းမသိရသေးပါ။
ဤတွင်၊ serum IPA သည် အဝလွန်သော်လည်း အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါ (KOBS) မဟုတ်သူများ၏ အသည်းတွင် apoptosis၊ mitophagy နှင့် အသက်ရှည်လမ်းကြောင်းများတွင် ကြွယ်ဝသော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုနှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြပါသည်။ ထို့အပြင်၊ IPA သည် inactivation လမ်းကြောင်းမှတစ်ဆင့် activated hematopoietic stem cells (HSCs) များကို ရှင်းလင်းခြင်းနှင့် ယိုယွင်းပျက်စီးခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤရလဒ်များသည် IPA အတွက် ထူးခြားသော အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုကို ဖော်ထုတ်ပေးပြီး အသည်း fibrosis regression ကို မြှင့်တင်ရန် အလားအလာရှိသော ကုထုံးပစ်မှတ်တစ်ခု ဖြစ်စေသည်။
KOBS cohort တွင်ယခင်လေ့လာမှုတစ်ခုအရ အသည်းအမာရွတ်ရှိသောလူနာများတွင် အသည်းအမာရွတ်မရှိသောလူနာများနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက သွေးလည်ပတ်မှု IPA အဆင့်နိမ့်ကြောင်းပြသခဲ့သည် [15]။ အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါ၏ အလားအလာရှိသော ရှုပ်ထွေးသောအကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဖယ်ထုတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လက်ရှိ KOBS လေ့လာမှုမှ လေ့လာမှုလူဦးရေအဖြစ် လက်ရှိလုပ်ဆောင်နေသော လေ့လာမှုမှ အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါမရှိသော အဝလွန်လူနာ ၁၁၆ ဦး (ပျမ်းမျှအသက် ± SD: 46.8 ± 9.3 နှစ်၊ BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (ဇယား ၁) ကို စုဆောင်းခဲ့သည် [16]။ ပါဝင်သူအားလုံးသည် ရေးသားထားသော သတင်းအချက်အလက်အပြည့်အစုံပါသော သဘောတူညီချက်ပေးခဲ့ပြီး လေ့လာမှုပရိုတိုကောကို Helsinki ကြေငြာချက် (54/2005၊ 104/2008 နှင့် 27/2010) နှင့်အညီ North Savo County Hospital ၏ ကျင့်ဝတ်ကော်မတီမှ အတည်ပြုခဲ့သည်။
အသည်းတစ်သျှူးစစ်ဆေးခြင်းနမူနာများကို bariatric ခွဲစိတ်မှုအတွင်း ရရှိခဲ့ပြီး အတွေ့အကြုံရှိ ရောဂါဗေဒပညာရှင်များမှ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့် စံနှုန်းများအတိုင်း တစ်သျှူးဗေဒနည်းဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည် [17၊ 18]။ အကဲဖြတ်စံနှုန်းများကို Supplementary Table S1 တွင် အကျဉ်းချုပ်ဖော်ပြထားပြီး ယခင်ကလည်း ဖော်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည် [19]။
ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အစာရှောင်ခြင်း သွေးရည်ကြည်နမူနာများကို ပစ်မှတ်မထားသော အရည် chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (n = 116)။ နမူနာများကို UHPLC-qTOF-MS စနစ် (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်19။ isopropyl alcohol (IPA) ကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းသည် ထိန်းသိမ်းမှုအချိန်နှင့် MS/MS ရောင်စဉ်ကို သန့်စင်သောစံနှုန်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းအပေါ် အခြေခံသည်။ IPA အချက်ပြမှုပြင်းထန်မှု (အမြင့်ဆုံးဧရိယာ) ကို နောက်ထပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးတွင် ထည့်သွင်းစဉ်းစားခဲ့သည် [20]။
Illumina HiSeq 2500 ကို အသုံးပြု၍ အသည်းတစ်ခုလုံး၏ RNA sequencing ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း အချက်အလက်များကို ကြိုတင်စီမံဆောင်ရွက်ခဲ့သည် [19၊ 21၊ 22]။ MitoMiner 4.0 ဒေတာဘေ့စ်မှ ရွေးချယ်ထားသော မျိုးဗီဇ ၁၉၅၇ ခုကို အသုံးပြု၍ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်/ဇီဝမျိုးကွဲဖြစ်စဉ်ကို ထိခိုက်စေသော transcripts များ၏ targeted differential expression analysis ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် [23]။ အသည်း DNA methylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့် နည်းလမ်းအတိုင်း Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) ကို အသုံးပြု၍ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့် နည်းလမ်းအတိုင်း ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် [24၊ 25]။
လူ့ အသည်း stellate ဆဲလ်များ (LX-2) ကို ပါမောက္ခ Stefano Romeo မှ ကြင်နာစွာ ပံ့ပိုးပေးခဲ့ပြီး DMEM/F12 အလတ်စား (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) တွင် ပြုစုပျိုးထောင် ထိန်းသိမ်းခဲ့သည်။ IPA ၏ အလုပ်လုပ်သော ပမာဏကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် LX-2 ဆဲလ်များကို DMEM/F12 အလတ်စားတွင် IPA ၏ မတူညီသော ပါဝင်မှုများ (10 μM, 100 μM နှင့် 1 mM; Sigma, 220027) ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသပေးခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ IPA သည် HSC များကို အသက်မဝင်စေရန် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက် LX-2 ဆဲလ်များကို 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) နှင့် 1 mM IPA တို့နှင့် serum-free အလတ်စားတွင် ၂၄ နာရီကြာ တွဲဖက်ကုသပေးခဲ့သည်။ သက်ဆိုင်ရာ ယာဉ်ထိန်းချုပ်မှုများအတွက်၊ TGF-β1 ကုသမှုအတွက် 0.1% BSA ပါဝင်သော 4 nM HCL ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး IPA ကုသမှုအတွက် 0.05% DMSO ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး နှစ်မျိုးလုံးကို ပေါင်းစပ်ကုသမှုအတွက် အတူတကွ အသုံးပြုခဲ့သည်။
ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ပါသည့် FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ကို အသုံးပြု၍ Apoptosis ကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် LX-2 (1 × 105 ဆဲလ်/well) ကို 12-well plates များတွင် တစ်ညလုံးမွေးမြူပြီးနောက် IPA သို့မဟုတ် IPA နှင့် TGF-β1 တို့ကို အကြိမ်ကြိမ်ကုသခဲ့သည်။ နောက်တစ်နေ့တွင် floating နှင့် adherent ဆဲလ်များကို စုဆောင်း၊ trypsinized လုပ်၊ PBS ဖြင့်ဆေးကြော၊ Annexin V binding buffer တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး FITC-Annexin V နှင့် 7-AAD ဖြင့် ၁၅ မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။
Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ကို အသုံးပြု၍ သက်ရှိဆဲလ်များရှိ မိုက်တိုခွန်ဒရီယာများကို အောက်ဆီဒေးရှင်းလှုပ်ရှားမှုအတွက် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ MTR စမ်းသပ်မှုများအတွက် LX-2 ဆဲလ်များကို IPA နှင့် TGF-β1 တို့ဖြင့် ညီမျှသောသိပ်သည်းဆတွင် ထားခဲ့သည်။ ၂၄ နာရီအကြာတွင် သက်ရှိဆဲလ်များကို trypsinized လုပ်ကာ PBS ဖြင့်ဆေးကြောပြီးနောက် ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း 37 °C တွင် serum-free medium တွင် 100 μM MTR ဖြင့် 20 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည် [26]။ သက်ရှိဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ဆဲလ်အရွယ်အစားနှင့် ဆိုက်တိုပလာစမစ်ရှုပ်ထွေးမှုကို forward scatter (FSC) နှင့် side scatter (SSC) parameters များကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
ဒေတာအားလုံး (ဖြစ်ရပ် ၃၀,၀၀၀) ကို NovoCyte Quanteon (Agilent) ကို အသုံးပြု၍ ရယူခဲ့ပြီး NovoExpress® 1.4.1 သို့မဟုတ် FlowJo V.10 ဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအရ Seahorse XF Cell Mito Stress တပ်ဆင်ထားသော Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ကို အသုံးပြု၍ အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုနှုန်း (OCR) နှင့် ဆဲလ်ပြင်ပ အက်ဆစ်ဓာတ်ပြုမှုနှုန်း (ECAR) ကို အချိန်နှင့်တပြေးညီ တိုင်းတာခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် 2 × 104 LX-2 ဆဲလ်/တွင်းကို XF96 ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပြားများပေါ်တွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ တစ်ညလုံး incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက် ဆဲလ်များကို isopropanol (IPA) နှင့် TGF-β1 (Supplementary Methods 1) ဖြင့် ကုသခဲ့သည်။ Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator ပါဝင်သော Seahorse XF Wave software ကို အသုံးပြု၍ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ၎င်းမှ Bioenergetic Health Index (BHI) ကို တွက်ချက်ခဲ့သည် [27]။
စုစုပေါင်း RNA ကို cDNA ထဲသို့ ကူးယူဖော်ပြခဲ့သည်။ သီးခြားနည်းလမ်းများအတွက်၊ ကိုးကားချက် [15] ကိုကြည့်ပါ။ Human 60S ribosomal acidic protein P0 (RPLP0) နှင့် cyclophilin A1 (PPIA) mRNA အဆင့်များကို constitutive gene controls အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) ကို TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) သို့မဟုတ် Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) နှင့်အတူ အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ relative gene expression fold ကို comparative Ct value cycling parameters (ΔΔCt) နှင့် ∆∆Ct နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ primers များ၏ အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို Supplementary Tables S2 နှင့် S3 တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။
ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း DNeasy သွေးနှင့်တစ်ရှူးကိရိယာ (Qiagen) ကို အသုံးပြု၍ နျူကလီးယား DNA (ncDNA) နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် DNA (mtDNA) တို့ကို ထုတ်ယူခဲ့သည် [28]။ mtDNA ၏ ဆွေမျိုးပမာဏကို Supplementary Methods 2 တွင် အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပစ်မှတ် mtDNA ဒေသတစ်ခုစီနှင့် နျူကလီးယား DNA ဒေသသုံးခု (mtDNA/ncDNA) ၏ ဂျီဩမေတြီပျမ်းမျှအချိုးကို တွက်ချက်ခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။ mtDNA နှင့် ncDNA အတွက် primer များ၏ အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို Supplementary Table S4 တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။
ဆဲလ်အချင်းချင်းနှင့် ဆဲလ်အတွင်း မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်ကွန်ရက်များကို မြင်သာစေရန်အတွက် အသက်ရှင်သောဆဲလ်များကို Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ဖြင့် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ LX-2 ဆဲလ်များ (1 × 104 ဆဲလ်/တွင်း) ကို သက်ဆိုင်ရာဖန်အောက်ခြေယဉ်ကျေးမှုပြားများ (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) ရှိ ဖန်ဆလိုက်များပေါ်တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။ ၂၄ နာရီအကြာတွင် အသက်ရှင်သော LX-2 ဆဲလ်များကို 37°C တွင် 100 μM MTR ဖြင့် 20 မိနစ်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ခဲ့ပြီး ဆဲလ်နျူကလိယများကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ဖြင့် ဆေးဆိုးခဲ့သည် [29]။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်ကွန်ရက်များကို 63×NA 1.3 objective ကို အသုံးပြု၍ 5% CO2 ပါဝင်သော စိုထိုင်းဆများသောလေထုတွင် 37°C တွင် Zeiss LSM 800 confocal module တပ်ဆင်ထားသော Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ကို အသုံးပြု၍ မြင်သာအောင်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် နမူနာအမျိုးအစားတစ်ခုစီအတွက် Z-series ရုပ်ပုံဆယ်ခုကို ရယူခဲ့ပါသည်။ Z-series တစ်ခုစီတွင် အပိုင်း ၃၀ ပါဝင်ပြီး အပိုင်းတစ်ခုစီတွင် 9.86 μm အထူရှိသည်။ နမူနာတစ်ခုစီအတွက်၊ ZEN 2009 ဆော့ဖ်ဝဲ (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ကို အသုံးပြု၍ မြင်ကွင်းဆယ်ခု၏ ရုပ်ပုံများကို ရယူခဲ့ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ImageJ ဆော့ဖ်ဝဲ (v1.54d) [30, 31] ကို အသုံးပြု၍ Supplementary Methods 3 တွင် အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသော parameters များအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ဆဲလ်များကို 0.1 M phosphate buffer တွင် 2% glutaraldehyde ဖြင့် ပြုပြင်ပြီးနောက် 1% osmium tetroxide solution (Sigma Aldrich, MO, USA) ဖြင့် ပြုပြင်ခဲ့ပြီး acetone (Merck, Darmstadt, Germany) ဖြင့် တဖြည်းဖြည်း ရေဓာတ်ခန်းခြောက်စေကာ နောက်ဆုံးတွင် epoxy resin တွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အလွန်ပါးလွှာသော အပိုင်းများကို 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) နှင့် 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany) ဖြင့် ပြင်ဆင်ပြီး ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ JEM 2100F EXII transmission electron microscope (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 80 kV အရှိန်မြှင့်ဗို့အားဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။
IPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသထားသော LX-2 ဆဲလ်များ၏ morphology ကို Zeiss inverted light microscope (Zeiss Axio Vert.A1 နှင့် AxioCam MRm, Jena, Germany) ကိုအသုံးပြု၍ 50x magnification ဖြင့် phase-contrast microscopy ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
ဆေးခန်းဆိုင်ရာ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှု သို့မဟုတ် အလယ်အလတ် (interquartile range: IQR) အဖြစ် ဖော်ပြထားပါသည်။ လေ့လာမှုအဖွဲ့သုံးဖွဲ့အကြား ကွာခြားချက်များကို နှိုင်းယှဉ်ရန်အတွက် variance (continuous variables) သို့မဟုတ် χ² စစ်ဆေးမှု (categorical variables) ၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ စမ်းသပ်မှုများစွာအတွက် ပြင်ဆင်ရန်အတွက် false positive rate (FDR) ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး FDR < 0.05 ရှိသော မျိုးဗီဇများကို စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆခဲ့ပါသည်။ CpG DNA methylation နှင့် IPA signal intensity ကို ဆက်စပ်ရန် Spearman correlation analysis ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး nominal p တန်ဖိုးများ (p < 0.05) ကို အစီရင်ခံခဲ့ပါသည်။
သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော အသည်းမှတ်တမ်း ၃၀၉၃ ခုအနက် မှတ်တမ်း ၂၆၈ ခု (nominal p < 0.01)၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားနှင့် ဆက်စပ်နေသော မှတ်တမ်း ၁၁၉ ခု (nominal p < 0.05) နှင့် CpG ၄၃၅၀ အတွက် ဝဘ်အခြေပြု မျိုးဗီဇအစုံ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရေးကိရိယာ (WebGestalt) ကို အသုံးပြု၍ လမ်းကြောင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အခမဲ့ရရှိနိုင်သော Venny DB (ဗားရှင်း 2.1.0) ကိရိယာကို ထပ်နေသော မျိုးဗီဇများကို ရှာဖွေရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး StringDB (ဗားရှင်း 11.5) ကို ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို မြင်ယောင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။
LX-2 စမ်းသပ်မှုအတွက်၊ D'Agostino-Pearson စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ နမူနာများကို ပုံမှန်ဖြစ်မှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ဒေတာများကို အနည်းဆုံး ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်တူပြုမှု သုံးခုမှ ရယူခဲ့ပြီး Bonferroni post hoc စမ်းသပ်မှုဖြင့် one-way ANOVA ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ 0.05 အောက် p-value ကို စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားမှုရှိသည်ဟု ယူဆသည်။ ဒေတာများကို mean ± SD အဖြစ် တင်ပြထားပြီး စမ်းသပ်မှုအရေအတွက်ကို ပုံတစ်ခုစီတွင် ဖော်ပြထားသည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများနှင့် ဂရပ်များအားလုံးကို Windows အတွက် GraphPad Prism 8 စာရင်းအင်းဆော့ဖ်ဝဲ (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, USA) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ပထမဦးစွာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များသည် အသည်း၊ ခန္ဓာကိုယ်တစ်ခုလုံးနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မှတ်တမ်းများနှင့် ဆက်စပ်မှုကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ စုစုပေါင်း မှတ်တမ်းပရိုဖိုင်တွင်၊ သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော အားအကောင်းဆုံး မျိုးဗီဇမှာ MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3) ဖြစ်ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားနှင့် ဆက်စပ်နေသော မှတ်တမ်းပရိုဖိုင်တွင်၊ အားအကောင်းဆုံး ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇမှာ AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Additional file 1 နှင့် Additional file 2) ဖြစ်သည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ transcripts (n = 268; p < 0.01) နှင့် mitochondria-associated transcripts (n = 119; p < 0.05) တို့ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး၊ နောက်ဆုံးတွင် apoptosis သည် အရေးအကြီးဆုံး canonical pathway (p = 0.0089) အဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ serum IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော mitochondrial transcripts အတွက်၊ apoptosis (FDR = 0.00001)၊ mitophagy (FDR = 0.00029) နှင့် TNF signaling pathways (FDR = 0.000006) (ပုံ 1A၊ ဇယား 2 နှင့် Supplementary Figures 1A-B) တို့ကို အာရုံစိုက်ခဲ့သည်။
လူ့အသည်းရှိ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားနှင့်ဆက်စပ်သော မှတ်တမ်းများနှင့် သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော လူ့အသည်းရှိ DNA မီသိုင်းလေးရှင်းတို့၏ ထပ်တူကျသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ A သည် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ မှတ်တမ်း ၂၆၈ ခု၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားနှင့်ဆက်စပ်သော မှတ်တမ်း ၁၁၉ ခုနှင့် သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော CpG နေရာ ၃၀၉၂ ခုသို့ မြေပုံဆွဲထားသော DNA မီသိုင်းဓာတ်ပါဝင်သော မှတ်တမ်းများကို ကိုယ်စားပြုသည် (ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ မှတ်တမ်းများနှင့် DNA မီသိုင်းဓာတ်ပါဝင်သော p တန်ဖိုးများ < 0.01 နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မှတ်တမ်းများအတွက် p တန်ဖိုးများ < 0.05)။ အဓိက ထပ်တူကျနေသော မှတ်တမ်းများကို အလယ်တွင် ပြသထားသည် (AKT1 နှင့် YKT6)။ B အခြားမျိုးဗီဇများနှင့် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှု အမြင့်ဆုံး (0.900) ရှိသော မျိုးဗီဇ ၁၃ ခု၏ အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုမြေပုံကို အွန်လိုင်းကိရိယာ StringDB ကို အသုံးပြု၍ သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် သိသိသာသာဆက်စပ်နေသော ထပ်တူကျနေသော မျိုးဗီဇ ၅၆ ခု (အနက်ရောင်မျဉ်းဒေသ) မှ တည်ဆောက်ထားသည်။ အစိမ်းရောင်- Gene Ontology (GO) ဆဲလ်အစိတ်အပိုင်းသို့ မြေပုံဆွဲထားသော မျိုးဗီဇများ- မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား (GO:0005739)။ AKT1 သည် အချက်အလက် (စာသားတူးဖော်ခြင်း၊ စမ်းသပ်မှုများ၊ ဒေတာဘေ့စ်များနှင့် ပူးတွဲဖော်ပြချက်) အပေါ်အခြေခံ၍ အခြားပရိုတိန်းများနှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုအတွက် အမြင့်ဆုံးရမှတ် (0.900) ရရှိသော ပရိုတိန်းဖြစ်သည်။ ကွန်ရက်နုတ်များသည် ပရိုတိန်းများကို ကိုယ်စားပြုပြီး အနားများသည် ပရိုတိန်းများအကြား ဆက်သွယ်မှုများကို ကိုယ်စားပြုသည်။
အူလမ်းကြောင်း အဏুဇီဝဇီဝ ဇီဝဖြစ်စဉ် ဇီဝဖြစ်စဉ် ဖြစ်စဉ်များသည် DNA methylation [32] မှတစ်ဆင့် epigenetic ဖွဲ့စည်းမှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်သောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် serum IPA အဆင့်များသည် အသည်း DNA methylation နှင့် ဆက်စပ်မှု ရှိမရှိကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ serum IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေသော အဓိက methylation နေရာနှစ်ခုသည် proline-serine-rich region 3 (C19orf55) နှင့် heat shock protein family B (small) member 6 (HSPB6) (Additional file 3) အနီးတွင် ရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ရပါသည်။ 4350 CpG (p < 0.01) ၏ DNA methylation သည် serum IPA အဆင့်များနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး အသက်ရှည်မှု ထိန်းညှိပေးသော လမ်းကြောင်းများတွင် ကြွယ်ဝစွာ ပါဝင်ပါသည် (p = 0.006) (ပုံ 1A၊ ဇယား 2 နှင့် ဖြည့်စွက်ပုံ 1C)။
လူ့အသည်းရှိ serum IPA အဆင့်များ၊ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ transcripts၊ mitochondria-associated transcripts နှင့် DNA methylation အကြား ဆက်စပ်မှု၏ အခြေခံဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ယန္တရားများကို နားလည်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခင်လမ်းကြောင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော မျိုးဗီဇများ၏ overlap analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 1A)။ ထပ်နေသော မျိုးဗီဇ ၅၆ ခု၏ pathway enrichment analysis ရလဒ်များက apoptosis လမ်းကြောင်း (p = 0.00029) သည် Venn diagram (Supplementary Figure 2 နှင့် Figure 1A) တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း apoptosis လမ်းကြောင်း (p = 0.00029) သည် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသုံးခုနှင့် တူညီသော မျိုးဗီဇနှစ်ခုဖြစ်သည့် AKT1 နှင့် YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog) ကို မီးမောင်းထိုးပြခဲ့ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ AKT1 (cg19831386) နှင့် YKT6 (cg24161647) တို့သည် serum IPA အဆင့်များနှင့် အပြုသဘောဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (Additional file 3)။ မျိုးဗီဇထုတ်ကုန်များအကြား အလားအလာရှိသော ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် ထပ်နေသော မျိုးဗီဇ ၅၆ ခုတွင် အမြင့်ဆုံးဘုံဒေသရမှတ် (0.900) ရှိသော မျိုးဗီဇ ၁၃ ခုကို input အဖြစ်ရွေးချယ်ပြီး interaction map တစ်ခုကို တည်ဆောက်ခဲ့ပါသည်။ ယုံကြည်မှုအဆင့် (အနားသတ်ယုံကြည်မှု) အရ၊ အမြင့်ဆုံးရမှတ် (0.900) ရှိသော AKT1 မျိုးဗီဇသည် ထိပ်ဆုံးတွင်ရှိသည် (ပုံ 1B)။
လမ်းကြောင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအပေါ်အခြေခံ၍ apoptosis သည် အဓိကလမ်းကြောင်းဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သောကြောင့် IPA ကုသမှုသည် in vitro တွင် HSCs ၏ apoptosis ကို သက်ရောက်မှုရှိမရှိ ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ IPA ၏ မတူညီသောဆေးပမာဏများ (10 μM၊ 100 μM နှင့် 1 mM) သည် LX-2 ဆဲလ်များအတွက် အဆိပ်မရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ယခင်က သရုပ်ပြခဲ့သည် [15]။ ဤလေ့လာမှုတွင် 10 μM နှင့် 100 μM တွင် IPA ကုသမှုသည် အသက်ရှင်နိုင်သောနှင့် အသေဆဲလ်အရေအတွက်ကို တိုးစေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော် ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဆဲလ်အသက်ရှင်နိုင်မှုသည် 1 mM IPA ပါဝင်မှုတွင် လျော့နည်းသွားပြီး ဆဲလ်အသေနှုန်းမှာ မပြောင်းလဲဘဲရှိနေခဲ့သည် (ပုံ 2A၊ B)။ ထို့နောက် LX-2 ဆဲလ်များတွင် apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေရန် အကောင်းဆုံးပါဝင်မှုကိုရှာဖွေရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 10 μM၊ 100 μM နှင့် 1 mM IPA ကို 24 နာရီကြာ စမ်းသပ်ခဲ့သည် (ပုံ 2A-E နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 3A-B)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက IPA 10 μM နဲ့ 100 μM တို့ဟာ apoptosis rate (%) ကို လျော့ကျစေပေမယ့်၊ IPA 1 mM ကတော့ control နဲ့ ယှဉ်ရင် late apoptosis နဲ့ apoptosis rate (%) ကို တိုးစေခဲ့တာကြောင့် နောက်ထပ်စမ်းသပ်မှုတွေအတွက် ရွေးချယ်ခဲ့ပါတယ် (ပုံ 2A–D)။
IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များ၏ apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။ Annexin V နှင့် 7-AAD double staining နည်းလမ်းကို flow cytometry ဖြင့် apoptosis rate နှင့် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အသုံးပြုခဲ့သည်။ BA ဆဲလ်များကို 10 μM၊ 100 μM နှင့် 1 mM IPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ သို့မဟုတ် serum-free medium တွင် F–H TGF-β1 (5 ng/ml) နှင့် 1 mM IPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ A: အသက်ရှင်နေသောဆဲလ်များ (Annexin V -/ 7AAD-); B: ပြိုကွဲနေသောဆဲလ်များ (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: အစောပိုင်း (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: နောက်ကျ (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptosis rate တွင်ရှိသော အစောပိုင်းနှင့် နှောင်းပိုင်း apoptosis ဆဲလ်စုစုပေါင်း၏ ရာခိုင်နှုန်း (%)။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SD၊ n = လွတ်လပ်သောစမ်းသပ်မှု ၃ ခုအဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။ Bonferroni post hoc စမ်းသပ်မှုနှင့်အတူ one-way ANOVA ကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းနှိုင်းယှဉ်မှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05; ****p < 0.0001
ကျွန်ုပ်တို့ယခင်ကပြသခဲ့သည့်အတိုင်း၊ 5 ng/ml TGF-β1 သည် ဂန္ထဝင် marker မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုကို တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် HSC activation ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည် [15]။ LX-2 ဆဲလ်များကို 5 ng/ml TGF-β1 နှင့် 1 mM IPA တို့ကို ပေါင်းစပ်ကုသခဲ့သည် (ပုံ 2E–H)။ TGF-β1 ကုသမှုသည် apoptosis rate ကို မပြောင်းလဲစေခဲ့သော်လည်း၊ IPA တွဲဖက်ကုသမှုသည် TGF-β1 ကုသမှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နှောင်းပိုင်း apoptosis နှင့် apoptosis rate (%) ကို တိုးမြင့်စေခဲ့သည် (ပုံ 2E–H)။ ဤရလဒ်များသည် TGF-β1 လှုံ့ဆော်မှုနှင့် မသက်ဆိုင်ဘဲ 1 mM IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် apoptosis ကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
LX-2 ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယ အသက်ရှူခြင်းအပေါ် IPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆက်လက်စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ ရလဒ်များအရ 1 mM IPA သည် ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အောက်ဆီဂျင်သုံးစွဲမှုနှုန်း (OCR) ဘောင်များကို လျော့ကျစေသည်- မိုက်တိုခွန်ဒရီယမဟုတ်သော အသက်ရှူခြင်း၊ အခြေခံနှင့် အများဆုံး အသက်ရှူခြင်း၊ ပရိုတွန်ယိုစိမ့်မှုနှင့် ATP ထုတ်လုပ်မှု (ပုံ 3A၊ B)၊ သို့သော် ဇီဝစွမ်းအင်ကျန်းမာရေးညွှန်းကိန်း (BHI) မှာမူ မပြောင်းလဲပါ။
IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အသက်ရှူခြင်းကို လျော့နည်းစေသည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အသက်ရှူခြင်း မျဉ်းကွေး (OCR) ကို မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အသက်ရှူခြင်း ကန့်သတ်ချက်များ (မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် မဟုတ်သော အသက်ရှူခြင်း၊ အခြေခံ အသက်ရှူခြင်း၊ အမြင့်ဆုံး အသက်ရှူခြင်း၊ ပရိုတွန်ယိုစိမ့်ခြင်း၊ ATP ထုတ်လုပ်မှု၊ SRC နှင့် BHI) အဖြစ် တင်ပြထားသည်။ ဆဲလ် A နှင့် B ကို 10 μM၊ 100 μM နှင့် 1 mM IPA ဖြင့် အသီးသီး ၂၄ နာရီကြာ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ဆဲလ် C နှင့် D ကို သွေးရည်ကြည်ကင်းစင်သော အလတ်စားတွင် TGF-β1 (5 ng/ml) နှင့် 1 mM IPA ဖြင့် အသီးသီး ၂၄ နာရီကြာ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ CyQuant kit ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာမှုအားလုံးကို DNA ပါဝင်မှုအတိုင်း ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ BHI: ဇီဝစွမ်းအင် ကျန်းမာရေး အညွှန်းကိန်း၊ SRC: အသက်ရှူ သိုလှောင်မှု စွမ်းရည်၊ OCR: အောက်ဆီဂျင် သုံးစွဲမှုနှုန်း။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှု (SD)၊ n = 5 လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက်များအဖြစ် တင်ပြထားသည်။ စာရင်းအင်း နှိုင်းယှဉ်မှုများကို one-way ANOVA နှင့် Bonferroni post hoc စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05; **p < 0.01; နှင့် ***p < 0.001
TGF-β1-activated LX-2 ဆဲလ်များ၏ bioenergetic profile အပေါ် IPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပိုမိုပြည့်စုံစွာ နားလည်နိုင်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် OCR မှတစ်ဆင့် mitochondrial oxidative phosphorylation ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည် (ပုံ 3C,D)။ ရလဒ်များအရ TGF-β1 ကုသမှုသည် ထိန်းချုပ်အုပ်စု (ပုံ 3C,D) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အများဆုံး အသက်ရှူမှု၊ အသက်ရှူရန် အရန်စွမ်းရည် (SRC) နှင့် BHI တို့ကို လျော့ကျစေနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ ပေါင်းစပ်ကုသမှုသည် အခြေခံ အသက်ရှူမှု၊ ပရိုတွန်ယိုစိမ့်မှုနှင့် ATP ထုတ်လုပ်မှုတို့ကို လျော့နည်းစေသော်လည်း SRC နှင့် BHI တို့သည် TGF-β1 ဖြင့် ကုသထားသော ဆဲလ်များထက် သိသိသာသာ မြင့်မားပါသည် (ပုံ 3C,D)။
Seahorse software မှ ပံ့ပိုးပေးသော “Cellular Energy Phenotype Test” ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် (Supplementary Fig. 4A–D)။ Supplementary Fig. 3B တွင် ပြထားသည့်အတိုင်း TGF-β1 ကုသမှုပြီးနောက် OCR နှင့် ECAR ဇီဝဖြစ်စဉ် အလားအလာ နှစ်မျိုးလုံး လျော့နည်းသွားသော်လည်း ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပေါင်းစပ်ကုသမှုနှင့် IPA ကုသမှုအုပ်စုများတွင် ကွာခြားချက် မတွေ့ရှိရပါ။ ထို့အပြင် ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပေါင်းစပ်ကုသမှုနှင့် IPA ကုသမှုပြီးနောက် OCR ၏ basal နှင့် stress အဆင့် နှစ်မျိုးလုံး လျော့နည်းသွားပါသည် (Supplementary Fig. 4C)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ ပေါင်းစပ်ကုထုံးဖြင့် အလားတူပုံစံကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ TGF-β1 ကုသမှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ECAR ၏ basal နှင့် stress အဆင့်များတွင် ပြောင်းလဲမှုမရှိပါ (Supplementary Fig. 4C)။ HSCs များတွင် mitochondrial oxidative phosphorylation လျော့ကျခြင်းနှင့် TGF-β1 ကုသမှုကို ထိတွေ့ပြီးနောက် SCR နှင့် BHI ကို ပြန်လည်ထိန်းသိမ်းနိုင်စွမ်းသည် ဇီဝဖြစ်စဉ် အလားအလာ (OCR နှင့် ECAR) ကို မပြောင်းလဲစေပါ။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင်၊ ဤရလဒ်များသည် IPA သည် HSCs ရှိ ဇီဝစွမ်းအင်ကို လျော့ကျစေနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပြီး IPA သည် HSC phenotype ကို inactivation ဆီသို့ ပြောင်းလဲစေသည့် နိမ့်သော စွမ်းအင်ပရိုဖိုင်ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည် (Supplementary Figure 4D)။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ဒိုင်းနမစ်အပေါ် IPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ မော်ဖိုလော်ဂျီနှင့် ကွန်ရက်ချိတ်ဆက်မှုများကို သုံးဖက်မြင် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းအပြင် MTR ဆိုးဆေးဖြင့် စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည် (ပုံ ၄ နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ ၅)။ ပုံ ၄ တွင် ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TGF-β1 ကုသမှုသည် ပျမ်းမျှမျက်နှာပြင်ဧရိယာ၊ အကိုင်းအခက်အရေအတွက်၊ စုစုပေါင်း အကိုင်းအခက်အရှည်နှင့် အကိုင်းအခက်ဆုံနံပါတ် (ပုံ ၄A နှင့် B) ကို လျော့နည်းစေပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား၏ အချိုးအစားကို လုံးပုံသဏ္ဍာန်မှ အလယ်အလတ်ပုံသဏ္ဍာန်သို့ ပြောင်းလဲစေကြောင်း ပြသထားသည် (ပုံ ၄C)။ IPA ကုသမှုသာလျှင် ပျမ်းမျှ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပမာဏကို လျော့ကျစေပြီး ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လုံးပုံသဏ္ဍာန်မှ အလယ်အလတ်ပုံသဏ္ဍာန်သို့ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား၏ အချိုးအစားကို ပြောင်းလဲစေခဲ့သည် (ပုံ ၄A)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အမြှေးပါး အလားအလာပေါ်မူတည်သော MTR (ပုံ ၄A နှင့် E) မှ အကဲဖြတ်သော လုံးပုံသဏ္ဍာန်၊ ပျမ်းမျှ အကိုင်းအခက်အရှည်နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လှုပ်ရှားမှုတို့သည် မပြောင်းလဲဘဲ ဤကန့်သတ်ချက်များသည် အဖွဲ့များအကြား ကွာခြားမှုမရှိပါ။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ဤရလဒ်များသည် TGF-β1 နှင့် IPA ကုသမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် အရွယ်အစားအပြင် ကွန်ရက်ရှုပ်ထွေးမှုကိုလည်း ပြုပြင်ပြောင်းလဲပေးပုံရကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား DNA ပေါများမှုကို ပြောင်းလဲစေသည်။ A. Mitotracker™ Red CMXRos ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကွန်ရက်များနှင့် DAPI ဖြင့် အပြာရောင်ဆေးဆိုးထားသော နျူကလိယများကို ပြသသည့် TGF-β1 (5 ng/ml) နှင့် 1 mM IPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ သွေးရည်ကြည်ကင်းစင်သော အလတ်စားတွင် ထားရှိသော အသက်ရှင်နေသော LX-2 ဆဲလ်များ၏ ကိုယ်စားပြု confocal ပုံများ။ အချက်အလက်အားလုံးတွင် အုပ်စုတစ်ခုလျှင် အနည်းဆုံး ပုံ ၁၅ ပုံ ပါဝင်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် နမူနာအမျိုးအစားတစ်ခုစီအတွက် Z-stack ပုံ ၁၀ ပုံ ရယူခဲ့သည်။ Z-axis အစီအစဉ်တစ်ခုစီတွင် အထူ 9.86 μm ရှိသော အပိုင်း ၃၀ ပါဝင်သည်။ Scale bar: 10 μm။ B. ရုပ်ပုံကို adaptive threshold ကို အသုံးပြု၍ ကိုယ်စားပြုအရာဝတ္ထုများ (မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားသာ) ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ အုပ်စုတစ်ခုစီရှိ ဆဲလ်အားလုံးအတွက် အရေအတွက်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphological ကွန်ရက်ချိတ်ဆက်မှုများကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်းကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ C. မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပုံသဏ္ဍာန်အချိုးများ၏ ကြိမ်နှုန်း။ 0 နှင့်နီးစပ်သောတန်ဖိုးများသည် ဂလိုဘယ်ပုံသဏ္ဍာန်များကို ညွှန်ပြပြီး 1 နှင့်နီးစပ်သောတန်ဖိုးများသည် filamentous ပုံသဏ္ဍာန်များကို ညွှန်ပြသည်။ D မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် DNA (mtDNA) ပါဝင်မှုကို ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ E Mitotracker™ Red CMXRos ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း flow cytometry (ဖြစ်ရပ် ၃၀,၀၀၀) ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SD၊ n = လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ၃ ခုအဖြစ် တင်ပြထားသည်။ စာရင်းအင်းနှိုင်းယှဉ်မှုများကို one-way ANOVA နှင့် Bonferroni post hoc စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ထို့နောက် LX-2 ဆဲလ်များရှိ mtDNA ပါဝင်မှုကို မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရေအတွက်၏ အညွှန်းကိန်းအဖြစ် ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TGF-β1 ကုသထားသော အုပ်စုတွင် mtDNA ပါဝင်မှု မြင့်တက်လာပါသည် (ပုံ ၄D)။ TGF-β1 ကုသထားသော အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပေါင်းစပ်ကုသမှုအုပ်စုတွင် mtDNA ပါဝင်မှု လျော့နည်းသွားပါသည် (ပုံ ၄D)၊ ၎င်းသည် IPA သည် mtDNA ပါဝင်မှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရေအတွက်အပြင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အသက်ရှူခြင်းကို လျော့ကျစေနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ ၃C)။ ထို့အပြင်၊ IPA သည် ပေါင်းစပ်ကုသမှုတွင် mtDNA ပါဝင်မှုကို လျော့ကျစေပုံရသော်လည်း MTR-mediated မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ကို မထိခိုက်ပါ (ပုံ ၄A–C)။
LX-2 ဆဲလ်များတွင် အမာရွတ်ဖြစ်ခြင်း၊ apoptosis၊ ရှင်သန်မှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်တို့နှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ၏ mRNA အဆင့်များနှင့် IPA ဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည် (ပုံ 5A–D)။ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TGF-β1 ကုသထားသော အဖွဲ့တွင် collagen type I α2 chain (COL1A2)၊ α-smooth muscle actin (αSMA)၊ matrix metalloproteinase 2 (MMP2)၊ tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) နှင့် dynamin 1-like gene (DRP1) ကဲ့သို့သော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှု တိုးလာသည်ကို ပြသခဲ့ပြီး အမာရွတ်ဖြစ်ခြင်းနှင့် လှုပ်ရှားမှု တိုးလာခြင်းကို ညွှန်ပြနေပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TGF-β1 ကုသမှုသည် nuclear pregnane X receptor (PXR)၊ caspase 8 (CASP8)၊ MAPKAPK3၊ B-cell α ကို တားဆီးပေးသည့်အရာ၊ nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A) ကို မြှင့်တင်ပေးသည့်အရာနှင့် nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) ကို တားဆီးပေးသည့်အရာ (ပုံ ၅A–D) တို့၏ mRNA အဆင့်များကို လျော့ကျစေခဲ့သည်။ TGF-β1 ကုသမှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TGF-β1 နှင့် IPA ပေါင်းစပ်ကုသမှုသည် COL1A2 နှင့် MMP2 ၏ ဖော်ပြမှုကို လျော့ကျစေသော်လည်း PXR၊ TIMP1၊ B-cell lymphoma-2 (BCL-2)၊ CASP8၊ NFκB1A၊ NFκB1-β နှင့် IKBKB တို့၏ mRNA အဆင့်များကို မြင့်တက်စေခဲ့သည်။ IPA ကုသမှုသည် MMP2၊ Bcl-2-associated protein X (BAX)၊ AKT1၊ optic atrophy protein 1 (OPA1) နှင့် mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) တို့၏ ဖော်ပြမှုကို သိသိသာသာ လျော့နည်းစေသော်လည်း၊ CASP8၊ NFκB1A၊ NFκB1B နှင့် IKBKB တို့၏ ဖော်ပြမှုသည် ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မြင့်တက်လာခဲ့သည်။ သို့သော်၊ caspase-3 (CASP3)၊ apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1)၊ mitochondrial fusion protein 1 (MFN1) နှင့် fission protein 1 (FIS1) တို့၏ ဖော်ပြမှုတွင် ကွာခြားချက် မတွေ့ရှိရပါ။ စုပေါင်းအားဖြင့်၊ ဤရလဒ်များသည် IPA ကုသမှုသည် fibrosis၊ apoptosis၊ ရှင်သန်မှုနှင့် mitochondrial dynamics တို့နှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ အချက်အလက်များက IPA ကုသမှုသည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် fibrosis ကို လျော့နည်းစေသည်ဟု အကြံပြုထားပြီး၊ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ၎င်းသည် phenotype ကို inactivation ဆီသို့ ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် ရှင်သန်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။
IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များရှိ fibroblast၊ apoptotic၊ viability နှင့် mitochondrial dynamics မျိုးဗီဇများ၏ expression ကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲပေးသည်။ LX-2 ဆဲလ်များကို serum-free medium တွင် TGF-β1 နှင့် IPA တို့ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ induce လုပ်ပြီးနောက် endogenous control (RPLP0 သို့မဟုတ် PPIA) နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည့် mRNA expression ကို Histogram များက ပြသသည်။ A သည် fibroblasts များကို ညွှန်ပြပြီး B သည် apoptotic ဆဲလ်များကို ညွှန်ပြပြီး C သည် surviving cells များကို ညွှန်ပြပြီး D သည် mitochondrial dynamics မျိုးဗီဇ expression ကို ညွှန်ပြသည်။ အချက်အလက်များကို mean ± standard deviation (SD) အဖြစ် တင်ပြထားပြီး n = 3 independent experiments များ ပါဝင်သည်။ one-way ANOVA နှင့် Bonferroni post hoc test ကိုအသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းနှိုင်းယှဉ်မှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ထို့နောက် ဆဲလ်အရွယ်အစား (FSC-H) နှင့် ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရှုပ်ထွေးမှု (SSC-H) ပြောင်းလဲမှုများကို flow cytometry (ပုံ 6A၊ B) ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့ပြီး IPA ကုသမှုပြီးနောက် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများကို transmission electron microscopy (TEM) နှင့် phase contrast microscopy (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A-B) ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A-B)။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း TGF-β1 ကုသထားသောအုပ်စုရှိ ဆဲလ်များသည် ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အရွယ်အစားတိုးလာသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A၊ B)၊ rough endoplasmic reticulum (ER*) နှင့် phagolysosomes (P) ၏ ဂန္ထဝင်ချဲ့ထွင်မှုကို ပြသပြီး hematopoietic stem cell (HSC) activation ကို ညွှန်ပြသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A)။ သို့သော် TGF-β1 ကုသထားသောအုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဆဲလ်အရွယ်အစား၊ ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရှုပ်ထွေးမှု (ပုံ 6A၊ B) နှင့် ER* ပါဝင်မှုတို့သည် TGF-β1 နှင့် IPA ပေါင်းစပ်ကုသမှုအုပ်စုတွင် လျော့နည်းသွားသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A)။ ထို့အပြင်၊ IPA ကုသမှုသည် ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဆဲလ်အရွယ်အစား၊ ဆိုက်တိုပလာစမစ်ရှုပ်ထွေးမှု (ပုံ 6A၊ B)၊ P နှင့် ER* ပါဝင်မှု (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6A) ကို လျော့နည်းစေသည်။ ထို့အပြင်၊ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက IPA ကုသမှု ၂၄ နာရီအကြာတွင် apoptosis ဆဲလ်များ၏ ပါဝင်မှု တိုးလာသည် (အဖြူရောင်မြှားများ၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ 6B)။ ဤရလဒ်များက စုပေါင်းအားဖြင့် 1 mM IPA သည် HSC apoptosis ကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ပြီး TGF-β1 မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော ဆဲလ်ပုံသဏ္ဌာန်ဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များ ပြောင်းလဲမှုများကို ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်ပြီး HSC လှုပ်ရှားမှုမရှိခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နိုင်သည့် ဆဲလ်အရွယ်အစားနှင့် ရှုပ်ထွေးမှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
IPA သည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် ဆဲလ်အရွယ်အစားနှင့် ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရှုပ်ထွေးမှုကို ပြောင်းလဲစေသည်။ flow cytometry ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် LX-2 ဆဲလ်များအတွက် သီးသန့် gating ဗျူဟာကို အသုံးပြုခဲ့သည်- ဆဲလ်လူဦးရေကို သတ်မှတ်ရန် SSC-A/FSC-A၊ doublets များကို ဖော်ထုတ်ရန် FSC-H/FSC-A နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစားနှင့် ရှုပ်ထွေးမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် SSC-H/FSC-H။ ဆဲလ်များကို TGF-β1 (5 ng/ml) နှင့် 1 mM IPA တို့ဖြင့် serum-free medium တွင် ၂၄ နာရီကြာ ထားခဲ့သည်။ LX-2 ဆဲလ်များကို ဆဲလ်အရွယ်အစားနှင့် ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရှုပ်ထွေးမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ဘယ်ဘက်အောက် quadrant (SSC-H-/FSC-H-)၊ ဘယ်ဘက်အပေါ် quadrant (SSC-H+/FSC-H-)၊ ညာဘက်အောက် quadrant (SSC-H-/FSC-H+) နှင့် ညာဘက်အပေါ် quadrant (SSC-H+/FSC-H+) အဖြစ် ဖြန့်ဝေခဲ့သည်။ B. ဆဲလ်ပုံသဏ္ဌာန်ကို FSC-H (ရှေ့သို့ပြန့်ကျဲခြင်း၊ ဆဲလ်အရွယ်အစား) နှင့် SSC-H (ဘေးထွက်ပြန့်ကျဲခြင်း၊ ဆိုက်တိုပလာစမစ်ရှုပ်ထွေးမှု) (ဖြစ်ရပ် ၃၀,၀၀၀) တို့ကို အသုံးပြု၍ flow cytometry ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SD၊ n = လွတ်လပ်သောစမ်းသပ်ချက် ၃ ခုအဖြစ် တင်ပြထားသည်။ စာရင်းအင်းနှိုင်းယှဉ်မှုများကို one-way ANOVA နှင့် Bonferroni post hoc စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 နှင့် ****p < 0.0001
IPA ကဲ့သို့သော အူလမ်းကြောင်းဇီဝဖြစ်စဉ်များသည် သုတေသန၏ ရေပန်းစားသော အကြောင်းအရာတစ်ခု ဖြစ်လာခဲ့ပြီး အူလမ်းကြောင်း အဏုဇီဝပိုးမွှားများတွင် ပစ်မှတ်အသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ ထို့ကြောင့် လူသားများတွင် အသည်းမာကျောခြင်းနှင့် ကျွန်ုပ်တို့ ဆက်စပ်နေသော ဇီဝဖြစ်စဉ်တစ်ခုဖြစ်သည့် IPA [15] သည် တိရစ္ဆာန်မော်ဒယ်များတွင် အလားအလာရှိသော အမာရွတ်ဆန့်ကျင်ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ပြသထားသည်မှာ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းပါသည် [13၊ 14]။ ဤနေရာတွင် အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါ (T2D) မရှိသော အဝလွန်သူများတွင် သွေးရည်ကြည် IPA နှင့် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ အသည်း transcriptomics နှင့် DNA methylation အကြား ဆက်စပ်မှုကို ပထမဆုံးအကြိမ်အဖြစ် ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ပြီး apoptosis၊ mitophagy နှင့် အသက်ရှည်မှုအပြင် အသည်း homeostasis ကို ထိန်းညှိပေးသည့် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော မျိုးဗီဇ AKT1 ကို မီးမောင်းထိုးပြခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာမှု၏ နောက်ထပ်ထူးခြားချက်တစ်ခုမှာ IPA ကုသမှုသည် LX-2 ဆဲလ်များတွင် apoptosis၊ ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝစွမ်းအင်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များနှင့် အပြန်အလှန် ဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ခြင်းဖြစ်ပြီး HSC phenotype ကို inactivation ဆီသို့ ပြောင်းလဲစေသည့် နိမ့်သော စွမ်းအင်ရောင်စဉ်တန်းကို ညွှန်ပြပြီး IPA သည် အသည်းမာကျောခြင်းကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေရန် အလားအလာရှိသော ကိုယ်စားလှယ်လောင်းတစ်ဦးဖြစ်စေသည်။
apoptosis၊ mitophagy နှင့် longevity တို့သည် သွေးရည်ကြည် IPA လည်ပတ်မှုနှင့် ဆက်စပ်နေသော အသည်းမျိုးဗီဇများတွင် ကြွယ်ဝသော အရေးကြီးဆုံး canonical pathways များဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ mitochondrial quality control (MQC) system ပျက်ယွင်းခြင်းသည် mitochondrial dysfunction၊ mitophagy နှင့် apoptosis တို့ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး MASLD ဖြစ်ပေါ်မှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည်[33, 34]။ ထို့ကြောင့် IPA သည် အသည်းတွင် apoptosis၊ mitophagy နှင့် longevity မှတစ်ဆင့် ဆဲလ် dynamics နှင့် mitochondrial integrity ကို ထိန်းသိမ်းခြင်းတွင် ပါဝင်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ခန့်မှန်းနိုင်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ data အရ assays သုံးခုတွင် မျိုးဗီဇနှစ်ခု တူညီကြောင်း ပြသခဲ့သည်- YKT6 နှင့် AKT1။ YKT6 သည် ဆဲလ်အမြှေးပါး fusion လုပ်ငန်းစဉ်တွင် ပါဝင်သော SNARE protein တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ ၎င်းသည် autophagosome ပေါ်တွင် STX17 နှင့် SNAP29 ဖြင့် initiation complex တစ်ခု ဖွဲ့စည်းခြင်းဖြင့် autophagy နှင့် mitophagy တွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပြီး၊ ထို့ကြောင့် autophagosomes နှင့် lysosomes ၏ fusion ကို မြှင့်တင်ပေးသည်[35]။ ထို့အပြင်၊ YKT6 လုပ်ဆောင်ချက်ဆုံးရှုံးမှုသည် mitophagy ချို့ယွင်းမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး [36]၊ YKT6 မြင့်တက်လာခြင်းသည် hepatocellular carcinoma (HCC) တိုးတက်မှုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ဆဲလ်ရှင်သန်မှု တိုးလာသည်ကို ပြသသည် [37]။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ AKT1 သည် အရေးကြီးဆုံး အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု မျိုးဗီဇဖြစ်ပြီး PI3K/AKT အချက်ပြလမ်းကြောင်း၊ ဆဲလ်စက်ဝန်း၊ ဆဲလ် ရွှေ့ပြောင်းခြင်း၊ မျိုးပွားခြင်း၊ focal adhesion၊ mitochondrial function နှင့် collagen ထုတ်လွှတ်မှု အပါအဝင် အသည်းရောဂါများတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်။ [38–40] အသက်ဝင်သော PI3K/AKT အချက်ပြလမ်းကြောင်းသည် extracellular matrix (ECM) ထုတ်လုပ်မှုအတွက် တာဝန်ရှိသော ဆဲလ်များဖြစ်သည့် hematopoietic stem cells (HSCs) ကို အသက်ဝင်စေပြီး ၎င်း၏ ပုံမှန်မဟုတ်မှုသည် အသည်း fibrosis ဖြစ်ပွားမှုနှင့် တိုးတက်မှုကို အထောက်အကူပြုနိုင်သည် [40]။ ထို့အပြင်၊ AKT သည် p53-dependent cell apoptosis ကို တားဆီးပေးသည့် အဓိက ဆဲလ်ရှင်သန်မှု အချက်များထဲမှ တစ်ခုဖြစ်ပြီး AKT အသက်ဝင်မှုသည် အသည်းဆဲလ် apoptosis ကို တားဆီးခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်သည် [41၊ 42]။ ရရှိလာသောရလဒ်များအရ IPA သည် apoptosis သို့ဝင်ရောက်ခြင်း သို့မဟုတ် ရှင်သန်ခြင်းအကြား hepatocytes များ၏ဆုံးဖြတ်ချက်ကို ထိခိုက်စေခြင်းဖြင့် အသည်း mitochondria နှင့်ဆက်စပ်သော apoptosis တွင်ပါဝင်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အသည်း homeostasis အတွက် အရေးပါသော AKT နှင့်/သို့မဟုတ် YKT6 မျိုးဗီဇများက ထိန်းချုပ်နိုင်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ TGF-β1 ကုသမှုမပါဝင်ဘဲ LX-2 ဆဲလ်များတွင် 1 mM IPA သည် apoptosis ကိုဖြစ်ပေါ်စေပြီး mitochondrial respiration ကိုလျော့နည်းစေကြောင်းပြသခဲ့သည်။ apoptosis သည် fibrosis ဖြေရှင်းခြင်းနှင့် hematopoietic stem cell (HSC) activation အတွက် အဓိကလမ်းကြောင်းတစ်ခုဖြစ်ပြီး အသည်း fibrosis ၏ ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်သော ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာတုံ့ပြန်မှုတွင်လည်း အဓိကဖြစ်ရပ်တစ်ခုဖြစ်သည်ကို သတိပြုသင့်သည် [4, 43]။ ထို့အပြင်၊ ပေါင်းစပ်ကုသမှုပြီးနောက် LX-2 ဆဲလ်များတွင် BHI ပြန်လည်ထူထောင်ခြင်းသည် mitochondrial bioenergetics ကိုထိန်းညှိရာတွင် IPA ၏ အလားအလာရှိသောအခန်းကဏ္ဍအပေါ် အမြင်အသစ်များကို ပေးစွမ်းခဲ့သည်။ အနားယူနေသောနှင့် မလှုပ်ရှားသောအခြေအနေများတွင်၊ hematopoietic ဆဲလ်များသည် ATP ထုတ်လုပ်ရန် mitochondrial oxidative phosphorylation ကို အသုံးပြုပြီး ဇီဝဖြစ်စဉ်လှုပ်ရှားမှုနည်းပါးသည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ HSC activation သည် glycolytic state သို့ဝင်ရောက်ခြင်း၏ စွမ်းအင်လိုအပ်ချက်များကို ဖြည့်ဆည်းရန် mitochondrial respiration နှင့် biosynthesis ကို မြှင့်တင်ပေးသည် [44]။ IPA သည် ဇီဝဖြစ်စဉ်အလားအလာနှင့် ECAR ကို မထိခိုက်သောကြောင့် glycolytic လမ်းကြောင်းသည် ဦးစားပေးမှုနည်းပါးကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ အလားတူပင်၊ နောက်ထပ်လေ့လာမှုတစ်ခုအရ 1 mM IPA သည် cardiomyocytes၊ human hepatocyte cell line (Huh7) နှင့် human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) တို့တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ကွင်းဆက်လှုပ်ရှားမှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော်၊ cardiomyocytes ရှိ glycolysis တွင် IPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို မတွေ့ရှိရဘဲ IPA သည် အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ဇီဝစွမ်းအင်ကို ထိခိုက်စေနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည် [45]။ ထို့ကြောင့်၊ 1 mM IPA သည် mtDNA ပမာဏကို မပြောင်းလဲဘဲ fibrogenic gene expression၊ cell morphology နှင့် mitochondrial bioenergetics များကို သိသိသာသာ လျှော့ချနိုင်သောကြောင့် အပျော့စား chemical uncoupler အဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည် [46]။ Mitochondrial uncouplers များသည် culture-induced fibrosis နှင့် HSC activation ကို ဟန့်တားနိုင်ပြီး [47] uncoupling proteins (UCP) သို့မဟုတ် adenine nucleotide translocase (ANT) ကဲ့သို့သော အချို့သောပရိုတင်းများမှ ထိန်းညှိထားသော သို့မဟုတ် လှုံ့ဆော်ပေးသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ATP ထုတ်လုပ်မှုကို လျှော့ချနိုင်သည်။ ဆဲလ်အမျိုးအစားပေါ် မူတည်၍ ဤဖြစ်စဉ်သည် ဆဲလ်များကို apoptosis မှ ကာကွယ်ပေးနိုင်ပြီး/သို့မဟုတ် apoptosis ကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည် [46]။ သို့သော်၊ hematopoietic stem cell inactivation တွင် mitochondrial uncoupler အဖြစ် IPA ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ရှင်းလင်းစေရန် နောက်ထပ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်ပါသည်။
ထို့နောက် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အသက်ရှူခြင်းတွင် ပြောင်းလဲမှုများသည် အသက်ရှင်နေသော LX-2 ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်တွင် ထင်ဟပ်ခြင်း ရှိမရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ TGF-β1 ကုသမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အချိုးအစားကို စက်ဝိုင်းပုံသဏ္ဍာန်မှ အလယ်အလတ်ပုံစံသို့ ပြောင်းလဲစေပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အကိုင်းအခက် လျော့နည်းခြင်းနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကွဲထွက်ခြင်းတွင် အဓိကအချက်ဖြစ်သည့် DRP1 ၏ အဖော်ပြမှု တိုးလာခြင်းနှင့်အတူ [48]။ ထို့အပြင်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အကွဲအပြဲဖြစ်ခြင်းသည် ကွန်ရက် ရှုပ်ထွေးမှုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ပေါင်းစပ်မှုမှ ကွဲထွက်ခြင်းသို့ အကူးအပြောင်းသည် hematopoietic stem cell (HSC) activation အတွက် အရေးကြီးပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကွဲထွက်ခြင်းကို ဟန့်တားခြင်းသည် HSC apoptosis ကို ဖြစ်စေသည် [49]။ ထို့ကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ ရလဒ်များက TGF-β1 ကုသမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကွန်ရက် ရှုပ်ထွေးမှုကို အကိုင်းအခက် လျော့နည်းခြင်းဖြင့် လျော့ကျစေနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပြီး ၎င်းသည် activated hematopoietic stem cells (HSCs) နှင့် ဆက်စပ်နေသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကွဲထွက်ခြင်းတွင် ပိုမိုအဖြစ်များသည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ ဒေတာက IPA သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား၏ အချိုးအစားကို စက်ဝိုင်းပုံသဏ္ဍာန်မှ အလယ်အလတ်ပုံစံသို့ ပြောင်းလဲစေနိုင်ပြီး ထို့ကြောင့် OPA1 နှင့် MFN2 ၏ အဖော်ပြမှုကို လျှော့ချပေးနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ OPA1 ကို လျော့နည်းစေခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အမြှေးပါး အလားအလာကို လျော့ကျစေပြီး ဆဲလ် apoptosis ကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ကြောင်း လေ့လာမှုများက ပြသထားသည် [50]။ MFN2 သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်မှုနှင့် apoptosis ကို ဖြစ်စေသည်ဟု လူသိများသည် [51]။ ရရှိလာသော ရလဒ်များအရ TGF-β1 နှင့်/သို့မဟုတ် IPA မှ LX-2 ဆဲလ်များ induction သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် အရွယ်အစား၊ activation state နှင့် network complexity ကို ထိန်းညှိပေးပုံရသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ TGFβ-1 နှင့် IPA ပေါင်းစပ်ကုသမှုသည် apoptosis ကိုရှောင်ရှားသောဆဲလ်များတွင် fibrosis၊ apoptosis နှင့် ရှင်သန်မှုနှင့်ဆက်စပ်သော မျိုးဗီဇများ၏ mRNA ဖော်ပြမှုကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် mtDNA နှင့် ဆဲလ် morphological parameters များကို လျှော့ချနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ IPA သည် AKT1 ၏ mRNA ဖော်ပြမှုအဆင့်နှင့် COL1A2 နှင့် MMP2 ကဲ့သို့သော အရေးကြီးသော fibrosis မျိုးဗီဇများ၏ mRNA ဖော်ပြမှုအဆင့်ကို လျော့ကျစေသော်လည်း apoptosis နှင့်ဆက်စပ်နေသော CASP8 ၏ ဖော်ပြမှုအဆင့်ကို မြင့်တက်စေခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များအရ IPA ကုသမှုပြီးနောက် BAX ဖော်ပြမှုလျော့ကျသွားပြီး TIMP1 မိသားစု subunits များ၊ BCL-2 နှင့် NF-κB တို့၏ mRNA ဖော်ပြမှုတိုးလာပြီး IPA သည် apoptosis ကိုရှောင်ရှားသော hematopoietic stem cells (HSCs) ရှိ ရှင်သန်မှုအချက်ပြမှုများကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ဤမော်လီကျူးများသည် activated hematopoietic stem cells များတွင် pro-survival signals များအဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် anti-apoptotic ပရိုတိန်းများ (Bcl-2 ကဲ့သို့) တိုးလာခြင်း၊ pro-apoptotic BAX လျော့နည်းလာခြင်းနှင့် TIMP နှင့် NF-κB အကြား ရှုပ်ထွေးသော အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုတို့နှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်သည် [5, 7]။ IPA သည် PXR မှတစ်ဆင့် ၎င်း၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ထုတ်လွှတ်ပြီး TGF-β1 နှင့် IPA ဖြင့် ပေါင်းစပ်ကုသမှုသည် PXR mRNA expression အဆင့်များကို တိုးမြင့်စေပြီး HSC activation ကို နှိမ်နင်းကြောင်း ညွှန်ပြသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ရပါသည်။ activated PXR signaling သည် in vivo နှင့် in vitro နှစ်ခုလုံးတွင် HSC activation ကို ဟန့်တားကြောင်း လူသိများသည် [52, 53]။ ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက IPA သည် apoptosis ကို မြှင့်တင်ခြင်း၊ fibrosis နှင့် mitochondrial metabolism ကို လျှော့ချခြင်းနှင့် survival signals ကို မြှင့်တင်ခြင်းဖြင့် activated HSCs များ ရှင်းလင်းခြင်းတွင် ပါဝင်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပြီး၊ ၎င်းတို့သည် activated HSC phenotype ကို in activated အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲပေးသည့် ပုံမှန်လုပ်ငန်းစဉ်များ ဖြစ်သည်။ apoptosis တွင် IPA ၏ ယန္တရားနှင့် အခန်းကဏ္ဍအတွက် နောက်ထပ်ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ရှင်းလင်းချက်တစ်ခုမှာ ၎င်းသည် mitophagy (အတွင်းပိုင်းလမ်းကြောင်း) နှင့် NF-κB ရှင်သန်မှုအချက်ပြလမ်းကြောင်း (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7) နှင့် တိုက်ရိုက်ဆက်စပ်နေသော extrinsic TNF အချက်ပြလမ်းကြောင်း (ဇယား 1) မှတစ်ဆင့် အဓိကအားဖြင့် ချို့ယွင်းနေသော mitochondria ကို ဖယ်ရှားပေးခြင်းဖြစ်သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ IPA နှင့် ဆက်စပ်သော ကြွယ်ဝသော မျိုးဗီဇများသည် apoptosis လမ်းကြောင်းတွင် pro-apoptotic နှင့် pro-survival အချက်ပြမှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည် [54]၊ IPA သည် ဤမျိုးဗီဇများနှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိခြင်းဖြင့် apoptosis လမ်းကြောင်း သို့မဟုတ် ရှင်သန်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ သို့သော် HSC activation နှင့် ၎င်း၏ ယန္တရားလမ်းကြောင်းများအတွင်း IPA သည် apoptosis သို့မဟုတ် ရှင်သန်မှုကို မည်သို့ဖြစ်ပေါ်စေသည်ကို မရှင်းလင်းသေးပါ။
IPA သည် အူလမ်းကြောင်း အဏုဇီဝပိုးမွှားများမှတစ်ဆင့် အစားအသောက်တွင်ပါဝင်သော ထရစ်ပတိုဖန်မှ ဖွဲ့စည်းထားသော အဏုဇီဝဇီဝဖြစ်စဉ် ဇီဝဖြစ်စဉ်တစ်ခုဖြစ်သည်။ လေ့လာမှုများအရ အူလမ်းကြောင်းပတ်ဝန်းကျင်တွင် ရောင်ရမ်းမှုကို ဆန့်ကျင်ခြင်း၊ အင်တီအောက်ဆီးဒင့်နှင့် ဗီဇပြောင်းလဲမှု ထိန်းညှိပေးသည့် ဂုဏ်သတ္တိများရှိကြောင်း ပြသထားသည်။[55] IPA သည် အူလမ်းကြောင်းအတားအဆီးလုပ်ဆောင်ချက်ကို ချိန်ညှိပေးနိုင်ပြီး အောက်ဆီဒေးရှင်းဖိစီးမှုကို လျှော့ချပေးနိုင်ကြောင်း၊ ၎င်းသည် ၎င်း၏ဒေသဆိုင်ရာ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အထောက်အကူပြုနိုင်ကြောင်း လေ့လာမှုများအရ ပြသထားသည်။[56] အမှန်မှာ၊ IPA ကို သွေးလည်ပတ်မှုမှတစ်ဆင့် ပစ်မှတ်အင်္ဂါများသို့ သယ်ယူပို့ဆောင်ပြီး IPA သည် ထရစ်ပတိုဖန်၊ ဆီရိုတိုနင်နှင့် အင်ဒိုးလ် ဆင်းသက်လာပစ္စည်းများနှင့် အလားတူ အဓိက ဇီဝဖြစ်စဉ်ဖွဲ့စည်းပုံကို မျှဝေထားသောကြောင့် IPA သည် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်များကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ယှဉ်ပြိုင်နိုင်သော ဇီဝဖြစ်စဉ်ကံကြမ္မာများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။[52] IPA သည် အင်ဇိုင်းများ သို့မဟုတ် အာရုံခံကိရိယာများပေါ်တွင် ချည်နှောင်သည့်နေရာများအတွက် ထရစ်ပတိုဖန်မှ ဆင်းသက်လာသော ဇီဝဖြစ်စဉ်များနှင့် ယှဉ်ပြိုင်နိုင်ပြီး ပုံမှန်ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ၎င်းသည် ၎င်း၏ ကုထုံးဆိုင်ရာ ပြတင်းပေါက်ကို ပိုမိုနားလည်ရန် ၎င်း၏ ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်နှင့် ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်ဆိုင်ရာ နောက်ထပ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်ကြောင်း မီးမောင်းထိုးပြသည်။[57] ၎င်းသည် သွေးနီဥပင်မဆဲလ်များ (HSCs) တွင်လည်း ဖြစ်ပွားနိုင်မလားဆိုသည်ကို စောင့်ကြည့်ရဦးမည်ဖြစ်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင် ကန့်သတ်ချက်အချို့ရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဝန်ခံပါသည်။ IPA နှင့် ဆက်စပ်သော ဆက်စပ်မှုများကို အထူးစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါ (T2DM) ရှိသော လူနာများကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖယ်ထုတ်ထားပါသည်။ ၎င်းသည် အမျိုးအစား ၂ ဆီးချိုရောဂါနှင့် အသည်းရောဂါ အဆင့်မြင့်ရှိသော လူနာများအတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များ၏ ကျယ်ပြန့်သော အသုံးချနိုင်မှုကို ကန့်သတ်ထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဝန်ခံပါသည်။ လူ့သွေးရည်ကြည်တွင် IPA ၏ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ပါဝင်မှုသည် 1–10 μM [11၊ 20] ရှိသော်လည်း၊ 1 mM IPA ပါဝင်မှုကို အမြင့်ဆုံး အဆိပ်မရှိသော ပါဝင်မှု [15] နှင့် apoptosis နှုန်း အမြင့်ဆုံးအပေါ် အခြေခံ၍ ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး၊ necrotic cell လူဦးရေ ရာခိုင်နှုန်းတွင် ကွာခြားချက် မရှိပါ။ ဤလေ့လာမှုတွင် IPA ၏ supraphysiological အဆင့်များကို အသုံးပြုခဲ့သော်လည်း၊ IPA ၏ ထိရောက်သော ပမာဏနှင့်ပတ်သက်၍ လက်ရှိတွင် သဘောတူညီမှု မရှိသေးပါ [52]။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ရလဒ်များသည် သိသာထင်ရှားသော်လည်း၊ IPA ၏ ပိုမိုကျယ်ပြန့်သော ဇီဝဖြစ်စဉ် ကံကြမ္မာသည် သုတေသန၏ တက်ကြွသော နယ်ပယ်တစ်ခုအဖြစ် ရှိနေဆဲဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ သွေးရည်ကြည် IPA အဆင့်များနှင့် အသည်းမှတ်တမ်းများ၏ DNA methylation အကြား ဆက်စပ်မှုဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များကို hematopoietic stem cells (HSCs) မှသာမက အသည်းတစ်ရှူးများမှပါ ရရှိခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် IPA သည် hematopoietic stem cell (HSC) activation နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း transcriptome analysis မှ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်တွေ့ရှိချက်များအပေါ် အခြေခံ၍ human LX-2 ဆဲလ်များကို အသုံးပြုရန် ရွေးချယ်ခဲ့ပါသည် [15]၊ HSC များသည် အသည်း fibrosis တိုးတက်မှုတွင် ပါဝင်သော အဓိကဆဲလ်များဖြစ်သည်။ အသည်းသည် ဆဲလ်အမျိုးအစားများစွာဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသောကြောင့် hepatocyte-HSC-immune cell co-culture system နှင့် caspase activation နှင့် DNA fragmentation ပေါင်းစပ်ထားသည့်အပြင် protein level အပါအဝင် လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားကဲ့သို့သော အခြားဆဲလ်မော်ဒယ်များကို IPA ၏ အခန်းကဏ္ဍနှင့် အခြားအသည်းဆဲလ်အမျိုးအစားများနှင့် ၎င်း၏ အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို လေ့လာရန် ထည့်သွင်းစဉ်းစားသင့်သည်။