ဤဆောင်းပါးသည် “ရောဂါပိုးများနှင့် ပိုးမွှားများကို ပဲပင်များ၏ ခံနိုင်ရည်ကို မြှင့်တင်ခြင်း” သုတေသနခေါင်းစဉ်၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်ပြီး ဆောင်းပါး ၅ ပုဒ်လုံးကို ကြည့်ပါ။
မှိုအပင်ရောဂါ necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary သည် မတူညီသော host plant များကို ကူးစက်ရန် multi-tiered strategy ကို အသုံးပြုသည်။ ဤလေ့လာမှုသည် Pseudomonas sclerotiorum ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော အဖြူရောင်မှိုများအပေါ် Phaseolus vulgaris L. ၏ မော်လီကျူး၊ ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ဇီဝဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ တုံ့ပြန်မှုများကို မြှင့်တင်ရန်အတွက် အခြားစီမံခန့်ခွဲမှု strategy တစ်ခုအဖြစ် အခြားအရေးကြီးသော amino acid များပေါင်းစပ်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့် ပရိုတင်းမဟုတ်သော အမိုင်နိုအက်ဆစ်ဖြစ်သည့် diamine L-ornithine ကို အသုံးပြုရန် အဆိုပြုထားသည်။ In vitro စမ်းသပ်ချက်များအရ L-ornithine သည် S. pyrenoidosa ၏ mycelial ကြီးထွားမှုကို dose-dependent ပုံစံဖြင့် သိသိသာသာ ဟန့်တားပေးကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ ၎င်းသည် greenhouse အခြေအနေများအောက်တွင် အဖြူရောင်မှို၏ပြင်းထန်မှုကို သိသိသာသာ လျှော့ချပေးနိုင်သည်။ ထို့အပြင်၊ L-ornithine သည် ကုသထားသော အပင်များ၏ ကြီးထွားမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့ပြီး L-ornithine ၏ စမ်းသပ်ထားသော ပြင်းအားများသည် ကုသထားသော အပင်များအတွက် phytotoxic မဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင်၊ L-ornithine သည် အင်ဇိုင်းမဟုတ်သော antioxidants (စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော ဖီနောလစ်များနှင့် flavonoids) နှင့် enzymatic antioxidants (catalase (CAT), peroxidase (POX), နှင့် polyphenol oxidase (PPO)) တို့၏ expression ကို မြှင့်တင်ပေးပြီး antioxidant နှင့်ဆက်စပ်သော မျိုးဗီဇသုံးမျိုး (PvCAT1, PvSOD, နှင့် PvGR) ၏ expression ကို တိုးမြှင့်ပေးပါသည်။ ထို့အပြင်၊ in silico analysis အရ S. sclerotiorum genome တွင် oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) protein ရှိနေခြင်းကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် functional analysis, conserved domains နှင့် topology အရ Aspergillus fijiensis (AfOAH) နှင့် Penicillium sp. (PlOAH) ၏ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) proteins များနှင့် အလွန်ဆင်တူပါသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ အာလူး dextrose broth (PDB) medium ထဲသို့ L-ornithine ထည့်သွင်းခြင်းသည် S. sclerotiorum mycelia ရှိ SsOAH gene ၏ expression ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေပါသည်။ အလားတူပင်၊ L-ornithine ကို ပြင်ပမှ အသုံးပြုခြင်းသည် ကုသထားသော အပင်များမှ စုဆောင်းရရှိသော မှိုမျှင်များတွင် SsOAH မျိုးဗီဇ၏ ဖော်ပြမှုကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေပါသည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ L-ornithine ကို အသုံးပြုခြင်းသည် PDB အလတ်စားနှင့် ရောဂါကူးစက်ခံရသော အရွက်နှစ်မျိုးလုံးတွင် oxalic acid ထုတ်လွှတ်မှုကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေပါသည်။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ L-ornithine သည် redox အခြေအနေကို ထိန်းသိမ်းခြင်းအပြင် ရောဂါကူးစက်ခံရသော အပင်များ၏ ကာကွယ်ရေးတုံ့ပြန်မှုကို မြှင့်တင်ရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်။ ဤလေ့လာမှု၏ ရလဒ်များသည် အဖြူရောင်မှိုကို ထိန်းချုပ်ရန်နှင့် ပဲထုတ်လုပ်မှုနှင့် အခြားသီးနှံများအပေါ် ၎င်း၏သက်ရောက်မှုကို လျှော့ချရန် ဆန်းသစ်ပြီး ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် သဟဇာတဖြစ်သော နည်းလမ်းများကို တီထွင်ရာတွင် အထောက်အကူ ဖြစ်စေနိုင်ပါသည်။
မှို Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော အဖြူရောင်မှိုသည် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ ပဲ (Phaseolus vulgaris L.) ထုတ်လုပ်မှုအတွက် ပြင်းထန်သော ခြိမ်းခြောက်မှုဖြစ်စေသော ကြောက်မက်ဖွယ်ကောင်းသော၊ အထွက်နှုန်းကျဆင်းစေသော ရောဂါတစ်မျိုးဖြစ်သည် (Bolton et al., 2006)။ Sclerotinia sclerotiorum သည် မြေဆီလွှာမှတစ်ဆင့် ကူးစက်သော မှိုအပင်ရောဂါပိုးများထဲမှ ထိန်းချုပ်ရန် အခက်ခဲဆုံးဖြစ်ပြီး အပင်မျိုးစိတ် ၆၀၀ ကျော်၏ ကျယ်ပြန့်သော လက်ခံမျိုးစိတ်နှင့် သီးခြားမဟုတ်သော နည်းလမ်းဖြင့် လက်ခံတစ်ရှူးများကို လျင်မြန်စွာ အရည်ပျော်စေနိုင်သည် (Liang and Rollins, 2018)။ မကောင်းသော အခြေအနေများအောက်တွင်၊ ၎င်းသည် ၎င်း၏ဘဝစက်ဝန်း၏ အရေးကြီးသောအဆင့်ကို ဖြတ်သန်းပြီး မြေဆီလွှာတွင် 'sclerotia' ဟုခေါ်သော အနက်ရောင်၊ မာကျောသော၊ အစေ့ကဲ့သို့သော ဖွဲ့စည်းပုံများအဖြစ် သို့မဟုတ် ရောဂါကူးစက်ခံရသော အပင်များ၏ mycelium သို့မဟုတ် ပင်စည်အူတိုင်တွင် အဖြူရောင်၊ ဖောင်းကြွနေသော အပင်များအဖြစ် ကြာရှည်စွာ အိပ်စက်နေလေ့ရှိသည် (Schwartz et al., 2005)။ S. sclerotiorum သည် sclerotia ဖွဲ့စည်းနိုင်စွမ်းရှိပြီး ရောဂါကူးစက်ခံရသော လယ်ကွင်းများတွင် ကြာရှည်စွာ ရှင်သန်နိုင်ပြီး ရောဂါဖြစ်ပွားနေစဉ်အတွင်း ဆက်လက်တည်ရှိနေနိုင်သည် (Schwartz et al., 2005)။ Sclerotia များသည် အာဟာရဓာတ်များ ကြွယ်ဝပြီး မြေဆီလွှာတွင် ကြာရှည်စွာ တည်ရှိနိုင်ပြီး နောက်ဆက်တွဲ ရောဂါပိုးများအတွက် အဓိက ပိုးမွှားအဖြစ် ဆောင်ရွက်သည် (Schwartz et al., 2005)။ အခြေအနေကောင်းများအောက်တွင်၊ sclerotia များသည် အပင်ပေါက်ပြီး လေထဲတွင်ရှိသော spores များကို ထုတ်လုပ်ပြီး ပန်းပွင့်များ၊ ပင်စည်များ သို့မဟုတ် အသီးတောင့်များ အပါအဝင် အပင်၏ မြေပြင်အထက် အစိတ်အပိုင်းအားလုံးကို ကူးစက်နိုင်သည် (Schwartz et al., 2005)။
Sclerotinia sclerotiorum သည် ၎င်း၏ host plant များကို ကူးစက်ရန် multi-tiered strategy ကို အသုံးပြုပြီး sclerotial germination မှ ရောဂါလက္ခဏာ ဖွံ့ဖြိုးမှုအထိ ညှိနှိုင်းထားသော အဖြစ်အပျက်များစွာ ပါဝင်သည်။ အစပိုင်းတွင် S. sclerotiorum သည် apothecia ဟုခေါ်သော မှိုကဲ့သို့သော ဖွဲ့စည်းပုံများမှ ဆိုင်းငံ့ထားသော spores (ascospores ဟုခေါ်သည်) ကို ထုတ်လုပ်ပြီး ၎င်းတို့သည် လေထဲတွင် လွင့်မျောကာ ရောဂါပိုးကူးစက်ခံရသော အပင်အပျက်အစီးများပေါ်တွင် ရွေ့လျားမှုမရှိသော sclerotia အဖြစ်သို့ ဖွံ့ဖြိုးလာသည် (Bolton et al., 2006)။ ထို့နောက် မှိုသည် oxalic acid ဟုခေါ်သော virulence factor ကို ထုတ်လွှတ်ပြီး အပင်ဆဲလ်နံရံ pH ကို ထိန်းချုပ်ရန်၊ enzymatic degradation နှင့် တစ်ရှူးကျူးကျော်မှုကို မြှင့်တင်ရန် (Hegedus and Rimmer, 2005) နှင့် host plant ၏ oxidative burst ကို နှိမ်နင်းရန်ဖြစ်သည်။ ဤ acidification လုပ်ငန်းစဉ်သည် အပင်ဆဲလ်နံရံကို အားနည်းစေပြီး မှိုဆဲလ်နံရံ degrading enzymes (CWDEs) များ၏ ပုံမှန်နှင့် ထိရောက်သော လည်ပတ်မှုအတွက် ကောင်းမွန်သော ပတ်ဝန်းကျင်ကို ပံ့ပိုးပေးပြီး ရောဂါပိုးသည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ အတားအဆီးကို ကျော်လွှားပြီး host tissues များထဲသို့ ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်နိုင်စေသည် (Marciano et al., 1983)။ ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်ပြီးသည်နှင့် S. sclerotiorum သည် polygalacturonase နှင့် cellulase ကဲ့သို့သော CWDE အများအပြားကို ထုတ်လွှတ်ပြီး ၎င်းသည် ကူးစက်ခံထားရသော တစ်ရှူးများတွင် ပျံ့နှံ့မှုကို အထောက်အကူပြုပြီး တစ်ရှူး necrosis ကို ဖြစ်စေသည်။ အနာများနှင့် hyphal mats များ တိုးတက်လာခြင်းသည် အဖြူရောင်မှို၏ ထူးခြားသောလက္ခဏာများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် (Hegedus နှင့် Rimmer၊ ၂၀၀၅)။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ အိမ်ရှင်အပင်များသည် ပုံစံမှတ်မိခြင်း receptors (PRRs) များမှတစ်ဆင့် ရောဂါပိုးနှင့်ဆက်စပ်သော မော်လီကျူးပုံစံများ (PAMPs) ကို မှတ်မိပြီး နောက်ဆုံးတွင် ကာကွယ်ရေးတုံ့ပြန်မှုများကို အသက်ဝင်စေသည့် အချက်ပြဖြစ်ရပ်များစွာကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။
ဆယ်စုနှစ်များစွာ ရောဂါထိန်းချုပ်ရေး ကြိုးပမ်းမှုများရှိနေသော်လည်း၊ အခြားစီးပွားဖြစ်သီးနှံများကဲ့သို့ပင် ပဲတွင် ရောဂါပိုး၏ ခုခံနိုင်စွမ်း၊ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းနှင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်နေထိုင်နိုင်မှုတို့ကြောင့် လုံလောက်သော ခံနိုင်ရည်ရှိသော မျိုးရိုးဗီဇများ ရှားပါးနေဆဲဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် ရောဂါစီမံခန့်ခွဲမှုသည် အလွန်စိန်ခေါ်မှုများပြီး ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ အလေ့အကျင့်များ၊ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထိန်းချုပ်မှုနှင့် ဓာတုမှိုသတ်ဆေးများ ပေါင်းစပ်ပါဝင်သည့် ပေါင်းစပ်ထားသော၊ မျက်နှာစုံမှ ဗျူဟာတစ်ခု လိုအပ်သည် (O'Sullivan et al., 2021)။ မှိုဖြူများကို ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ထိန်းချုပ်ခြင်းသည် အထိရောက်ဆုံးဖြစ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် မှိုသတ်ဆေးများကို မှန်ကန်စွာနှင့် မှန်ကန်သောအချိန်တွင် အသုံးပြုပါက ရောဂါပျံ့နှံ့မှုကို ထိရောက်စွာ ထိန်းချုပ်နိုင်ခြင်း၊ ရောဂါကူးစက်မှုပြင်းထန်မှုကို လျှော့ချပေးနိုင်ခြင်းနှင့် အထွက်နှုန်းဆုံးရှုံးမှုများကို လျှော့ချနိုင်ခြင်းကြောင့်ဖြစ်သည်။ သို့သော် မှိုသတ်ဆေးများကို အလွန်အကျွံသုံးစွဲခြင်းနှင့် အလွန်အကျွံအားကိုးခြင်းသည် S. sclerotiorum ၏ ခံနိုင်ရည်ရှိသော မျိုးကွဲများ ပေါ်ပေါက်လာစေပြီး ပစ်မှတ်မဟုတ်သော သက်ရှိများ၊ မြေဆီလွှာကျန်းမာရေးနှင့် ရေအရည်အသွေးကို ဆိုးကျိုးသက်ရောက်စေနိုင်သည် (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024)။ ထို့ကြောင့် ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် သဟဇာတဖြစ်သော အခြားရွေးချယ်စရာများကို ရှာဖွေခြင်းသည် ထိပ်တန်းဦးစားပေးဖြစ်လာသည်။
putrescine၊ spermidine၊ spermine နှင့် cadaverine ကဲ့သို့သော Polyamines (PAs) များသည် မြေဆီလွှာမှတစ်ဆင့် ကူးစက်သော အပင်ရောဂါများကို တိုက်ဖျက်ရန် မျှော်လင့်ချက်ကောင်းသော အစားထိုးပစ္စည်းများအဖြစ် ဆောင်ရွက်နိုင်ပြီး အန္တရာယ်ရှိသော ဓာတုပိုးသတ်ဆေးများ အသုံးပြုမှုကို လုံးဝ သို့မဟုတ် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း လျှော့ချပေးနိုင်သည် (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024)။ အပင်အမြင့်များတွင် PAs များသည် ဆဲလ်ကွဲခြင်း၊ ကွဲပြားခြင်းနှင့် abiotic နှင့် biotic stresses များကို တုံ့ပြန်ခြင်း အပါအဝင် ဇီဝကမ္မဖြစ်စဉ်များစွာတွင် ပါဝင်ပတ်သက်နေသည် (Killiny and Nehela, 2020)။ ၎င်းတို့သည် antioxidant အဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်ပြီး၊ reactive oxygen species (ROS) ကို ဖယ်ရှားပေးနိုင်သည်၊ redox homeostasis ကို ထိန်းသိမ်းပေးနိုင်သည် (Nehela and Killiny, 2023)၊ defense-related genes များကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် (Romero et al., 2018)၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းအမျိုးမျိုးကို ထိန်းညှိပေးနိုင်သည် (Nehela and Killiny, 2023)၊ endogenous phytohormones များကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲပေးနိုင်သည် (Nehela and Killiny, 2019)၊ systemic acquired resistance (SAR) ကို ထူထောင်ပေးနိုင်သည်၊ နှင့် plant-pathogen interaction များကို ထိန်းညှိပေးနိုင်သည် (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)။ အပင်ကာကွယ်ရေးတွင် PA များ၏ သီးခြားယန္တရားများနှင့် အခန်းကဏ္ဍများသည် အပင်မျိုးစိတ်များ၊ ရောဂါပိုးများနှင့် ပတ်ဝန်းကျင်အခြေအနေများပေါ် မူတည်၍ ကွဲပြားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ အပင်များတွင် အပေါများဆုံး PA ကို မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော polyamine L-ornithine မှ ဇီဝပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ထားသည် (Killiny and Nehela, 2020)။
L-ornithine သည် အပင်ကြီးထွားမှုနှင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုတွင် အခန်းကဏ္ဍများစွာမှ ပါဝင်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ ယခင်လေ့လာမှုများအရ ဆန် (Oryza sativa) တွင် ornithine သည် နိုက်ထရိုဂျင်ပြန်လည်အသုံးပြုခြင်း (Liu et al., 2018)၊ ဆန်အထွက်နှုန်း၊ အရည်အသွေးနှင့် ရနံ့ (Lu et al., 2020) နှင့် ရေဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှု (Yang et al., 2000) တို့နှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ ထို့အပြင်၊ L-ornithine ကို ပြင်ပမှအသုံးပြုခြင်းသည် သကြား beet (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) တွင် မိုးခေါင်မှုခံနိုင်ရည်ကို သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးပြီး ကြက်သွန်နီ (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu နှင့် Çavuşoǧlu, 2021) နှင့် သီဟိုဠ်စေ့ (Anacardium occidentale) အပင်များ (da Rocha et al., 2012) တွင် ဆားဖိစီးမှုကို လျော့ပါးစေသည်။ abiotic ဖိစီးမှုကာကွယ်ရေးတွင် L-ornithine ၏ အလားအလာရှိသော အခန်းကဏ္ဍသည် ကုသထားသော အပင်များတွင် proline စုဆောင်းမှုတွင် ၎င်း၏ပါဝင်မှုကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) နှင့် proline dehydrogenase (ProDH1 နှင့် ProDH2) မျိုးဗီဇများကဲ့သို့သော proline ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများသည် Nicotiana benthamiana နှင့် Arabidopsis thaliana တို့ကို non-host Pseudomonas syringae မျိုးကွဲများမှ ကာကွယ်ရာတွင် ပါဝင်ကြောင်း ယခင်က သတင်းပို့ထားပြီးဖြစ်သည် (Senthil-Kumar and Mysore, 2012)။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ မှို ornithine decarboxylase (ODC) သည် ရောဂါပိုးများ ကြီးထွားမှုအတွက် လိုအပ်သည် (Singh et al., 2020)။ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ၏ ODC ကို ပစ်မှတ်ထားခြင်းသည် host-induced gene silencing (HIGS) မှတစ်ဆင့် ခရမ်းချဉ်ပင်များ၏ Fusarium wilt ကို ခံနိုင်ရည်ရှိမှုကို သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးသည် (Singh et al., 2020)။ သို့သော်၊ phytopathogens ကဲ့သို့သော biotic stress များကို ဆန့်ကျင်သည့် exogenous ornithine application ၏ အလားအလာရှိသော အခန်းကဏ္ဍကို ကောင်းစွာ လေ့လာထားခြင်း မရှိသေးပါ။ ပိုအရေးကြီးတာက ရောဂါခံနိုင်ရည်ရှိမှုနဲ့ ဆက်စပ်နေတဲ့ ဇီဝဓာတုဗေဒနဲ့ ဇီဝကမ္မဖြစ်စဉ်တွေအပေါ် ornithine ရဲ့ အကျိုးသက်ရောက်မှုတွေကို ယေဘုယျအားဖြင့် မလေ့လာရသေးသေးပါဘူး။
ပဲပင်များတွင် S. sclerotiorum ပိုးကူးစက်မှု၏ ရှုပ်ထွေးမှုကို နားလည်ခြင်းသည် ထိရောက်သော ထိန်းချုပ်ရေး မဟာဗျူဟာများ ဖော်ဆောင်ရန်အတွက် အရေးကြီးပါသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ပဲပင်များ၏ Sclerotinia sclerotiorum ပိုးကူးစက်မှုကို ခုခံကာကွယ်သည့် ယန္တရားများနှင့် ခုခံအားကို မြှင့်တင်ရာတွင် diamine L-ornithine ၏ အလားအလာရှိသော အခန်းကဏ္ဍကို ဖော်ထုတ်ရန် ရည်ရွယ်ပါသည်။ ကူးစက်ခံရသော အပင်များ၏ ကာကွယ်ရေးတုံ့ပြန်မှုများကို မြှင့်တင်ခြင်းအပြင် L-ornithine သည် redox အခြေအနေကို ထိန်းသိမ်းရာတွင်လည်း အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ L-ornithine ၏ အလားအလာရှိသော အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် အင်ဇိုင်းနှင့် အင်ဇိုင်းမဟုတ်သော antioxidant ကာကွယ်ရေး ယန္တရားများကို ထိန်းညှိခြင်းနှင့် မှိုရောဂါဖြစ်စေသော/အဆိပ်အတောက်ဖြစ်စေသော အချက်များနှင့် ဆက်စပ်ပရိုတင်းများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ အဆိုပြုပါသည်။ L-ornithine ၏ ဤနှစ်ထပ်လုပ်ဆောင်ချက်သည် အဖြူရောင်မှို၏ သက်ရောက်မှုကို လျှော့ချရန်နှင့် ဤအစွမ်းထက်သော မှိုရောဂါပိုးကို ပဲပင်သီးနှံများ၏ ခုခံအားကို မြှင့်တင်ရန် ရေရှည်တည်တံ့သော မဟာဗျူဟာအတွက် မျှော်လင့်ချက်ကောင်းသော ကိုယ်စားလှယ်လောင်းတစ်ဦး ဖြစ်စေသည်။ လက်ရှိလေ့လာမှု၏ ရလဒ်များသည် အဖြူရောင်မှိုကို ထိန်းချုပ်ရန်နှင့် ပဲထုတ်လုပ်မှုအပေါ် ၎င်း၏သက်ရောက်မှုကို လျှော့ချရန် ဆန်းသစ်ပြီး ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် သဟဇာတဖြစ်သော နည်းလမ်းများ ဖော်ဆောင်ရာတွင် အထောက်အကူ ဖြစ်စေနိုင်ပါသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ စီးပွားဖြစ်လွယ်သော ပဲမျိုးကွဲတစ်ခုဖြစ်သည့် Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) ကို စမ်းသပ်ပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ကျန်းမာသော မျိုးစေ့များကို အီဂျစ်နိုင်ငံ၊ လယ်ကွင်းသီးနှံသုတေသနဌာန (FCRI)၊ စိုက်ပျိုးရေးသုတေသနစင်တာ (ARC) မှ ပဲသုတေသနဌာနမှ ကြင်နာစွာ ပံ့ပိုးပေးခဲ့သည်။ မျိုးစေ့ငါးစေ့ကို ပလတ်စတစ်အိုးများ (အတွင်းအချင်း ၃၅ စင်တီမီတာ၊ အနက် ၅၀ စင်တီမီတာ) တွင် S. sclerotiorum ကူးစက်ခံရသောမြေဆီလွှာဖြင့် ပြည့်အောင် စိုက်ပျိုးခဲ့ပြီး ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေ (၂၅ ± ၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်၊ ဆွေမျိုးစိုထိုင်းဆ ၇၅ ± ၁%၊ အလင်းရောင် ၈ နာရီ/မှောင်ချိန် ၁၆ နာရီ) အောက်တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ စိုက်ပျိုးပြီး ၇-၁၀ ရက်အကြာတွင် (DPS) တွင် ပျိုးပင်များကို တစ်ပြေးညီကြီးထွားသော ပျိုးပင်နှစ်ပင်နှင့် အိုးတစ်လုံးစီတွင် အပြည့်အဝကြီးထွားသော အရွက်သုံးရွက်သာကျန်စေရန် ပါးလွှာစေခဲ့သည်။ အိုးစိုက်ပင်အားလုံးကို နှစ်ပတ်တစ်ကြိမ် ရေလောင်းပြီး သတ်မှတ်ထားသော မျိုးကွဲအတွက် အကြံပြုထားသောနှုန်းထားဖြင့် လစဉ် မြေသြဇာကျွေးသည်။
L-ornithinediamine ((+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany ဟုလည်း လူသိများသည်) 500 mg/L ပါဝင်မှုကို ပြင်ဆင်ရန်အတွက် 50 mg ကို ပိုးသတ်ထားသော ပေါင်းခံရေ 100 mL တွင် ဦးစွာ ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ ထို့နောက် စတော့ရည်ကို ရောစပ်ပြီး နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်ချက်များတွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့် L-ornithine ပါဝင်မှု ခြောက်မျိုး (12.5, 25, 50, 75, 100, နှင့် 125 mg/L) ကို in vitro တွင် စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင် ပိုးသတ်ထားသော ပေါင်းခံရေကို negative control (Mock) အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး “Rizolex-T” 50% ရေစိုနိုင်သော အမှုန့် (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) ကို positive control အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ စီးပွားဖြစ်ထုတ်လုပ်ထားသော မှိုသတ်ဆေး “Rizolex-T” ကို ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် စမ်းသပ်ခဲ့သည် (ပါဝင်မှုငါးမျိုး (၂၊ ၄၊ ၆၊ ၈ နှင့် ၁၀ မီလီဂရမ်/လီတာ))။
အဖြူရောင်မှို၏ ပုံမှန်လက္ခဏာများပြသသည့် ပဲပင်စည်နှင့် ပဲတောင့်နမူနာများ (ကျရောက်မှုနှုန်း- ၁၀-၃၀%) ကို စီးပွားဖြစ်ခြံများမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ ကူးစက်ခံရသော အပင်ပစ္စည်းအများစုကို မျိုးစိတ်/မျိုးကွဲ (ထိခိုက်လွယ်သော စီးပွားဖြစ်မျိုးကွဲ Giza 3) ဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သော်လည်း အခြား၊ အထူးသဖြင့် ဒေသတွင်းဈေးကွက်များမှ ရရှိသော မျိုးစိတ်များမှာ မသိသော မျိုးစိတ်များဖြစ်သည်။ စုဆောင်းထားသော ကူးစက်ခံရသော ပစ္စည်းများကို ၀.၅% ဆိုဒီယမ် ဟိုက်ပိုကလိုရိုက် ပျော်ရည်ဖြင့် မျက်နှာပြင်ကို ၃ မိနစ်ခန့် ပိုးသတ်ပြီးနောက် ပိုးသတ်ထားသော ရေဖြင့် အကြိမ်ပေါင်းများစွာ ဆေးကြောပြီး ရေပိုများကို ဖယ်ရှားရန် ပိုးသတ်ထားသော စစ်ထုတ်စက္ကူဖြင့် အခြောက်ခံခဲ့သည်။ ထို့နောက် ကူးစက်ခံရသော အင်္ဂါအစိတ်အပိုင်းများကို အလယ်တစ်ရှူး (ကျန်းမာသောနှင့် ကူးစက်ခံရသော တစ်ရှူးများကြား) မှ အပိုင်းအစလေးများအဖြစ် ဖြတ်တောက်ကာ အာလူး dextrose agar (PDA) အလတ်စားတွင် ပြုစုပျိုးထောင်ပြီး sclerotia ဖွဲ့စည်းမှုကို လှုံ့ဆော်ရန် ၂၅ ± ၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁၂ နာရီ အလင်းရောင်/၁၂ နာရီ မှောင်မိုက်စက်ဝန်းဖြင့် ၅ ရက်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ခဲ့သည်။ mycelial tip နည်းလမ်းကို ရောနှောထားသော သို့မဟုတ် ညစ်ညမ်းသော ယဉ်ကျေးမှုများမှ မှိုသီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ပိုးမွှားများကို သန့်စင်ရန်အတွက်လည်း အသုံးပြုခဲ့သည်။ သန့်စင်ထားသော မှိုသီးခြားခွဲထုတ်ထားသော ပိုးမွှားကို ၎င်း၏ ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ morphological ဝိသေသလက္ခဏာများအပေါ် အခြေခံ၍ ဦးစွာ ခွဲခြားသတ်မှတ်ပြီးနောက် အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့်ကြည့်နိုင်သော အင်္ဂါရပ်များအပေါ် အခြေခံ၍ S. sclerotiorum ဖြစ်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ Koch ၏ ယူဆချက်များနှင့် ကိုက်ညီစေရန် သန့်စင်ထားသော သီးခြားမျိုးစိတ်အားလုံးကို ထိခိုက်လွယ်သော Giza 3 ပဲမျိုးကွဲတွင် ရောဂါဖြစ်စေနိုင်မှု ရှိမရှိ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။
ထို့အပြင်၊ အကျူးကျော်ဆုံး S. sclerotiorum isolate (isolate #3) ကို White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 မှဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း internal transcribed spacer (ITS) sequencing ကိုအခြေခံ၍ ထပ်မံအတည်ပြုခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် isolate များကို အာလူး dextrose ပြုတ်ရည် (PDB) တွင် မွေးမြူပြီး 25 ± 2 °C တွင် 5-7 ရက်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် မှိုမျှင်ကို စုဆောင်းပြီး cheesecloth ဖြင့်စစ်ထုတ်ကာ ပိုးသတ်ထားသောရေဖြင့် နှစ်ကြိမ်ဆေးကြောကာ ပိုးသတ်ထားသော filter paper ဖြင့် အခြောက်ခံခဲ့သည်။ Genomic DNA ကို Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ITS rDNA ဒေသကို သတ်မှတ်ထားသော primer pair တစ်စုံ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; မျှော်မှန်းအရွယ်အစား: 540 bp) ကို အသုံးပြု၍ ချဲ့ထွင်ခဲ့သည် (Baturo-Ciesniewska et al., 2017)။ သန့်စင်ထားသော PCR ထုတ်ကုန်များကို sequencing အတွက် တင်သွင်းခဲ့သည် (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.)။ ITS rDNA sequences များကို Sanger sequencing နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ နှစ်လမ်းသွား sequence လုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် စုစည်းထားသော query sequences များကို GenBank နှင့် National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ရှိ နောက်ဆုံးပေါ်ဒေတာနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်။ မေးမြန်းချက်အစီအစဥ်ကို NCBI GenBank (Supplementary Table S1) ရှိ နောက်ဆုံးပေါ်ဒေတာမှ ရယူထားသော အခြား S. sclerotiorum strains/isolates ၂၀ နှင့် Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; version 11) တွင် ClustalW ကို အသုံးပြု၍ နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည် (Kumar et al., 2024)။ Evolutionary analysis ကို maximum likelihood method နှင့် general time-reversible nucleotide substitution model (Nei and Kumar, 2000) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ log-likelihood အမြင့်ဆုံးရှိသော သစ်ပင်ကို ပြသထားသည်။ heuristic search အတွက် ကနဦးသစ်ပင်ကို neighbor-joining (NJ) သစ်ပင် (Kumar et al., 2024) နှင့် maximum parsimony (MP) သစ်ပင်အကြား log-likelihood မြင့်မားသော သစ်ပင်ကို ရွေးချယ်ခြင်းဖြင့် ရွေးချယ်သည်။ NJ သစ်ပင်ကို general time-reversible model (Nei and Kumar, 2000) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ထားသော pairwise distance matrix ကို အသုံးပြု၍ တည်ဆောက်ထားသည်။ NJ သစ်ပင်ကို general time-reversible model (Nei and Kumar, 2000) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ထားသော pairwise distance matrix ကို အသုံးပြု၍ တည်ဆောက်ထားသည်။
L-ornithine နှင့် ဘက်တီးရီးယားပိုးသတ်ဆေး “Rizolex-T” တို့၏ ဘက်တီးရီးယားပိုးသတ်အာနိသင်ကို agar diffusion method ဖြင့် in vitro တွင် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ နည်းလမ်း- L-ornithine ၏ stock solution (500 mg/L) ကို သင့်လျော်သောပမာဏယူပြီး PDA nutrient medium 10 ml နှင့် သေချာစွာရောမွှေကာ 12.5၊ 25၊ 50၊ 75၊ 100 နှင့် 125 mg/L အသီးသီးပါဝင်သည့် solution များကို ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ မှိုသတ်ဆေး “Rizolex-T” (2၊ 4၊ 6၊ 8 နှင့် 10 mg/L) ပါဝင်မှုငါးမျိုးနှင့် ပိုးသတ်ထားသောပေါင်းခံရေကို control အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည်။ medium ခဲသွားပြီးနောက်၊ အချင်း ၄ မီလီမီတာရှိသော Sclerotinia sclerotiorum culture ၏ အသစ်ပြင်ဆင်ထားသော mycelium plug ကို Petri dish ၏အလယ်ဗဟိုသို့ လွှဲပြောင်းပြီး mycelium သည် control Petri dish တစ်ခုလုံးကို ဖုံးလွှမ်းသွားသည်အထိ 25±2°C တွင် မွေးမြူပြီးနောက် မှိုကြီးထွားမှုကို မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ ညီမျှခြင်း ၁ ကို အသုံးပြု၍ S. sclerotiorum ၏ ရေဒီယယ်ကြီးထွားမှု ရာခိုင်နှုန်း ဟန့်တားမှုကို တွက်ချက်ပါ။
စမ်းသပ်မှုကို နှစ်ကြိမ်ထပ်ခါတလဲလဲပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ထိန်းချုပ်/စမ်းသပ်အဖွဲ့တစ်ခုစီအတွက် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူခြောက်ခုနှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူတစ်ခုစီအတွက် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်လုံးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှုရလဒ်များ၏ တိကျမှု၊ ယုံကြည်စိတ်ချရမှုနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုကို သေချာစေရန် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူတစ်ခုစီကို နှစ်ကြိမ် (နည်းပညာဆိုင်ရာမိတ္တူနှစ်ခု) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ တစ်ဝက်အမြင့်ဆုံးတားဆီးနိုင်သောအာရုံစူးစိုက်မှု (IC50) နှင့် IC99 ကိုတွက်ချက်ရန် probit regression analysis ကိုအသုံးပြုခဲ့သည် (Prentice, 1976)။
ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် L-ornithine ၏ အလားအလာကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် အိုးစမ်းသပ်မှုနှစ်ခုကို ဆက်တိုက်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် အိုးများကို ပိုးသတ်ထားသော ရွှံ့-သဲမြေ (3:1) ဖြင့်ဖြည့်ပြီး S. sclerotiorum အသစ်ပြင်ဆင်ထားသော ယဉ်ကျေးမှုဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ပထမဦးစွာ S. sclerotiorum ၏ အကျူးကျော်ဆုံး isolate (isolate #3) ကို sclerotium တစ်ခုကို ထက်ခြမ်းခြမ်းကာ PDA ပေါ်တွင် မှောက်လျက်ထားကာ 25°C တွင် မှောင်မိုက်နေချိန် (24 နာရီ) တွင် 4 ရက်ကြာ ပျိုးထောင်ခြင်းဖြင့် ပျိုးထောင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် အချင်း 5 မီလီမီတာရှိသော agar plug လေးခုကို ရှေ့အစွန်းမှယူ၍ ဂျုံနှင့်ဆန်ဖွဲနု 100 ဂရမ် (1:1, v/v) ပိုးသတ်ထားသော ရောစပ်ထားသော အရည်ဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး sclerotia ဖွဲ့စည်းမှုကို လှုံ့ဆော်ရန် ပုလင်းအားလုံးကို 25 ± 2°C တွင် 12 နာရီ အလင်းရောင်/12 နာရီ မှောင်မိုက်စက်ဝန်းအောက်တွင် 5 ရက်ကြာ ပျိုးထောင်ခဲ့သည်။ မြေဆီလွှာထည့်ခြင်းမပြုမီ ပုလင်းအားလုံး၏ အရာများကို တစ်သားတည်းဖြစ်စေရန် သေချာစွာရောစပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ရောဂါပိုးများ အဆက်မပြတ်ပါဝင်နေစေရန်အတွက် ကိုလိုနီဖြစ်စေသော ဖွဲနုအရောအနှော ၁၀၀ ဂရမ်ကို အိုးတစ်လုံးစီထဲသို့ ထည့်ပါ။ မှိုပေါက်ရောက်စေရန်အတွက် ကာကွယ်ဆေးထိုးထားသော အိုးများကို ရေလောင်းပြီး ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေတွင် ၇ ရက်ထားခဲ့သည်။
ထို့နောက် Giza 3 မျိုးကွဲ၏ မျိုးစေ့ငါးစေ့ကို အိုးတစ်လုံးစီတွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ L-ornithine နှင့် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T ဖြင့် ပြုပြင်ထားသော အိုးများအတွက်၊ ပိုးသတ်ထားသော မျိုးစေ့များကို ၂၅၀ mg/L နှင့် ၅၀ mg/L အသီးသီးရှိသော ဒြပ်ပေါင်းနှစ်မျိုးပါဝင်သော ရေပျော်ရည်တွင် နှစ်နာရီကြာစိမ်ပြီးနောက် စိုက်ပျိုးခြင်းမပြုမီ တစ်နာရီကြာ လေမှုတ်အခြောက်ခံခဲ့သည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ မျိုးစေ့များကို negative control အဖြစ် ပိုးသတ်ထားသော ပေါင်းခံရေတွင် စိမ်ခဲ့သည်။ ပထမဆုံးရေလောင်းခြင်းမပြုမီ ၁၀ ရက်အကြာတွင် ပျိုးပင်များကို ပါးလွှာစေပြီး အိုးတစ်လုံးစီတွင် သေသပ်သော ပျိုးပင်နှစ်ပင်သာကျန်ရှိစေခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ S. sclerotiorum ကူးစက်ခံရကြောင်းသေချာစေရန်၊ ကြီးထွားမှုအဆင့်တူညီသော (၁၀ ရက်) ရှိ ပဲပင်စည်များကို ပိုးသတ်ထားသော ခွဲစိတ်ဓားကို အသုံးပြု၍ နေရာနှစ်ခုတွင် ဖြတ်တောက်ပြီး ကိုလိုနီဖွဲ့စည်းထားသော ဖွဲနုအရောအနှော ၀.၅ ဂရမ်ခန့်ကို ဒဏ်ရာတစ်ခုစီတွင်ထည့်ကာ ကူးစက်ခံရသော အပင်အားလုံးတွင် ရောဂါကူးစက်မှုနှင့် ရောဂါဖွံ့ဖြိုးမှုကို လှုံ့ဆော်ရန် စိုထိုင်းဆမြင့်မားစွာ ပေးခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်အပင်များကိုလည်း အလားတူဒဏ်ရာရရှိခဲ့ပြီး ရောဂါဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် ပတ်ဝန်းကျင်ကိုတုပရန်နှင့် ကုသမှုအုပ်စုများအကြား တသမတ်တည်းရှိစေရန်အတွက် ပိုးမွှားကင်းစင်သော၊ ကိုလိုနီမပါဝင်သော ဖွဲနုအရောအနှောကို ဒဏ်ရာထဲသို့ထည့်ပြီး စိုထိုင်းဆမြင့်မားသောအောက်တွင် ထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။
ကုသနည်း- ပဲပင်ပေါက်များကို L-ornithine (250 mg/l) ရေဆေးရည် 500 ml သို့မဟုတ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T (50 mg/l) ဖြင့် မြေဆီလွှာကို ရေလောင်းပေးပြီးနောက် ၁၀ ရက်ခြား သုံးကြိမ် ထပ်မံကုသခဲ့သည်။ placebo ကုသထားသော ထိန်းချုပ်သူများကို ပိုးသတ်ထားသော ပေါင်းခံရေ 500 ml ဖြင့် ပေးခဲ့သည်။ ကုသမှုအားလုံးကို ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေ (25 ± 2°C၊ 75 ± 1% ဆွေမျိုးစိုထိုင်းဆ၊ 8 နာရီ အလင်းရောင်/16 နာရီ မှောင်ချိန်) အောက်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အိုးအားလုံးကို နှစ်ပတ်တစ်ကြိမ် ရေလောင်းပြီး လစဉ် မျှတသော NPK ဓာတ်မြေဩဇာ (20-20-20၊ 3.6% ဆာလ်ဖာနှင့် TE အဏုဇီဝဒြပ်စင်များပါဝင်သည်၊ Zain Seeds၊ အီဂျစ်) ဖြင့် 3–4 g/l ပါဝင်မှုဖြင့် သတ်မှတ်ထားသော မျိုးစိတ်အတွက် အကြံပြုချက်များနှင့် ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း အရွက်များပေါ်တွင် ပက်ဖျန်းပေးခဲ့သည်။ အခြားနည်းဖြင့်ဖော်ပြထားခြင်းမရှိပါက၊ အပြည့်အဝကျယ်ပြန့်လာသော ရင့်ကျက်သောအရွက်များ (အပေါ်မှ ဒုတိယနှင့် တတိယအရွက်များ) ကို ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူတစ်ခုစီမှ ကုသမှုအပြီး ၇၂ နာရီ (hpt) တွင် စုဆောင်းခဲ့ပြီး၊ homogenized လုပ်ကာ စုစည်းကာ -80 °C တွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး၊ oxidative stress indicators များ၏ in situ histochemical localization၊ lipid peroxidation၊ enzymatic နှင့် non-enzymatic antioxidants နှင့် gene expression အပါအဝင် နောက်ထပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများ ပါဝင်သည်။
အဖြူရောင်မှိုကူးစက်မှုပြင်းထန်မှုကို Teran et al. (2006) မှပြုပြင်ထားသော Petzoldt နှင့် Dickson scale (1996) ကိုအခြေခံ၍ 1–9 (နောက်ဆက်တွဲဇယား S2) စကေးကို အသုံးပြု၍ ကူးစက်ခံရပြီး ၂၁ ရက်အကြာတွင် အပတ်စဉ် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် ပဲပင်များ၏ ပင်စည်နှင့် အကိုင်းအခက်များကို ကူးစက်ခံရသည့်နေရာမှစတင်၍ အတွင်းပိုင်းအဖုများနှင့် အဖုများတစ်လျှောက် အနာများ၏တိုးတက်မှုကို လိုက်လံစစ်ဆေးခဲ့သည်။ ကူးစက်ခံရသည့်နေရာမှ ပင်စည် သို့မဟုတ် အကိုင်းတစ်လျှောက် အဝေးဆုံးနေရာအထိ အနာ၏အကွာအဝေးကို တိုင်းတာခဲ့ပြီး အနာ၏တည်နေရာအပေါ်အခြေခံ၍ 1–9 ရမှတ်ကို သတ်မှတ်ခဲ့ပြီး (1) ကူးစက်ခံရသည့်နေရာအနီးတွင် မြင်သာသောကူးစက်မှုမရှိကြောင်းနှင့် (2–9) အနာအရွယ်အစားနှင့် အဖုများ/အဖုများတစ်လျှောက် အနာအရွယ်အစား တဖြည်းဖြည်းတိုးလာမှုကို ညွှန်ပြသည် (နောက်ဆက်တွဲဇယား S2)။ ထို့နောက် အဖြူရောင်မှိုကူးစက်မှုပြင်းထန်မှုကို ဖော်မြူလာ 2 ကို အသုံးပြု၍ ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ်ပြောင်းလဲခဲ့သည်-
ထို့အပြင်၊ ရောဂါတိုးတက်မှုမျဉ်းကွေးအောက်ရှိဧရိယာ (AUDPC) ကို ဖော်မြူလာ (Shaner and Finney, 1977) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့ပြီး၊ မကြာသေးမီက ပဲပုပ်ပင်၏ အဖြူရောင်ပုပ်အတွက် ညီမျှခြင်း ၃ ကို အသုံးပြု၍ လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည် (Chauhan et al., 2020)။
Yi = ti အချိန်၌ ရောဂါပြင်းထန်မှု၊ Yi+1 = နောက်တစ်ကြိမ် ti+1 တွင် ရောဂါပြင်းထန်မှု၊ ti = ပထမဆုံးတိုင်းတာချိန် (ရက်)၊ ti+1 = နောက်တစ်ကြိမ်တိုင်းတာချိန် (ရက်)၊ n = အချိန်အမှတ် သို့မဟုတ် လေ့လာတွေ့ရှိချက် စုစုပေါင်းအရေအတွက်။ ပဲပင်၏ ကြီးထွားမှု ကန့်သတ်ချက်များကို အပင်အမြင့် (စင်တီမီတာ)၊ အပင်တစ်ပင်လျှင် အကိုင်းအခက်အရေအတွက်နှင့် အပင်တစ်ပင်လျှင် အရွက်အရေအတွက် အပါအဝင် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားများအားလုံးတွင် ၂၁ ရက်ကြာ အပတ်စဉ် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။
ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင်၊ အရွက်နမူနာများ (အပေါ်မှ ဒုတိယနှင့် တတိယ အပြည့်အဝဖွံ့ဖြိုးပြီးသော အရွက်များ) ကို ကုသမှုအပြီး ၄၅ ရက်မြောက်နေ့ (နောက်ဆုံးကုသမှုအပြီး ၁၅ ရက်) တွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်လုံးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ပါဝင်သည်။ ကြေမွသောတစ်ရှူး ၅၀၀ မီလီဂရမ်ခန့်ကို မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၄ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၈၀% အက်စီတုန်းကို အသုံးပြု၍ အလင်းစွမ်းအင်သုံး ရောင်ခြယ်ပစ္စည်းများ (ကလိုရိုဖီးလ် အေ၊ ကလိုရိုဖီးလ် ဘီ နှင့် ကာရိုတီနွိုက်များ) ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ၂၄ နာရီအကြာတွင်၊ နမူနာများကို ဗဟိုခွဲထုတ်ပြီး အပေါ်ယံအရည်ကို စုဆောင်းကာ UV-160A ရောင်စဉ်တန်းပြကိရိယာ (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ ကလိုရိုဖီးလ် အေ၊ ကလိုရိုဖီးလ် ဘီ နှင့် ကာရိုတီနွိုက်ပါဝင်မှုများကို အရောင်ခွဲခြားဆုံးဖြတ်ရန် (Lichtenthaler, 1987) နည်းလမ်းအရ မတူညီသော လှိုင်းအလျားသုံးခု (A470၊ A646 နှင့် A663 nm) တွင် စုပ်ယူမှုကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် စုဆောင်းခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ အလင်းစွမ်းအင်သုံး ရောင်ခြယ်ပစ္စည်းများ၏ ပါဝင်မှုကို Lichtenthaler (1987) မှဖော်ပြထားသော အောက်ပါဖော်မြူလာ ၄-၆ ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
ကုသပြီး ၇၂ နာရီအကြာတွင် (hpt)၊ အရွက်များ (အပေါ်မှ အပြည့်အဝဖွံ့ဖြိုးပြီး ဒုတိယနှင့် တတိယအရွက်များ) ကို ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ် (H2O2) နှင့် စူပါအောက်ဆိုဒ် အာနိုင်း (O2•−) ၏ in situ histochemical localization အတွက် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်အိုးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ပါဝင်သည်။ နည်းလမ်း၏ တိကျမှု၊ ယုံကြည်စိတ်ချရမှုနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုကို သေချာစေရန် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီကို ထပ်တူခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (နည်းပညာဆိုင်ရာ ပုံတူပွားနှစ်ခု)။ H2O2 နှင့် O2•− ကို Romero-Puertas et al. (၂၀၀၄) နှင့် Adam et al. (၁၉၈၉) မှဖော်ပြထားသော နည်းလမ်းများကို လိုက်နာ၍ အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ in situ တွင် H2O2 ၏ histochemical localization အတွက်၊ လက်ကမ်းစာစောင်များကို 10 mM Tris buffer (pH 7.8) တွင် 0.1% DAB ဖြင့် vacuum infiltrate လုပ်ပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်တွင် အလင်းရောင်ထဲတွင် 60 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ လက်ကမ်းစာစောင်များကို 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) တွင် 0.15% (v/v) TCA တွင် bleach လုပ်ပြီးနောက် မှောင်သွားသည်အထိ အလင်းရောင်ဖြင့် ထိတွေ့စေခဲ့သည်။ အလားတူပင်၊ in situ တွင် O2•− ၏ histochemical localization အတွက် အဆို့ရှင်များကို 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) 0.1 w/v % HBT ပါ၀င်သည့် vacuum infiltrate လုပ်ခဲ့သည်။ လက်ကမ်းစာစောင်များကို အခန်းအပူချိန်တွင် အလင်းရောင်ထဲတွင် 20 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက် အထက်ဖော်ပြပါအတိုင်း bleach လုပ်ပြီးနောက် မှောင်သော အပြာ/ခရမ်းရောင် အစက်အပြောက်များ ပေါ်လာသည်အထိ မီးထွန်းထားသည်။ ရရှိလာသော အညိုရောင် (H2O2 အညွှန်းကိန်းအနေဖြင့်) သို့မဟုတ် အပြာရောင်-ခရမ်းရောင် (O2•− အညွှန်းကိန်းအနေဖြင့်) ၏ ပြင်းအားကို image processing package ၏ Fiji ဗားရှင်းကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည် (http://fiji.sc; accessed 7 March 2024)။
Malondialdehyde (MDA; lipid peroxidation ၏ အမှတ်အသားအဖြစ်) ကို Du နှင့် Bramlage (1992) တို့၏ နည်းလမ်းအရ အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီမှ အရွက်များ (အပေါ်မှ အပြည့်အဝဖွံ့ဖြိုးပြီး ဒုတိယနှင့် တတိယအရွက်များ) ကို ကုသမှုပြီးနောက် ၇၂ နာရီအကြာတွင် စုဆောင်းခဲ့သည် (hpt)။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်အိုးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ပါဝင်သည်။ နည်းလမ်း၏ တိကျမှု၊ ယုံကြည်စိတ်ချရမှုနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုကို သေချာစေရန် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီကို နှစ်ထပ် (နည်းပညာဆိုင်ရာ ပုံတူပွားနှစ်ခု) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် မြေသားအရွက်တစ်ရှူး ၀.၅ ဂရမ်ကို ၂၀% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ဖြင့် MDA ထုတ်ယူရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထို့နောက် supernatant ရှိ MDA ပါဝင်မှုကို UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 532 နှင့် 600 nm တွင် absorbance ကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် colorimetrically ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက် nmol g−1 FW အဖြစ်ဖော်ပြသည်။
အင်ဇိုင်းမပါသောနှင့် အင်ဇိုင်းပါသော အင်တီအောက်ဆီးဒင့်များကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက်၊ အရွက်များ (အပေါ်မှ အပြည့်အဝဖွံ့ဖြိုးပြီး ဒုတိယနှင့် တတိယအရွက်များ) ကို ကုသမှုအပြီး ၇၂ နာရီ (hpt) တွင် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီမှ စုဆောင်းခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားတစ်ခုစီတွင် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်အိုးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ပါဝင်သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ နမူနာတစ်ခုစီကို နှစ်ထပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (နည်းပညာဆိုင်ရာ နမူနာနှစ်ခု)။ အရွက်နှစ်ရွက်ကို အရည်နိုက်ထရိုဂျင်ဖြင့် ကြိတ်ခွဲပြီး အင်ဇိုင်းနှင့် အင်ဇိုင်းမဟုတ်သော အင်တီအောက်ဆီးဒင့်များ၊ စုစုပေါင်း အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ၊ ပရိုလင်းပါဝင်မှု၊ မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုနှင့် အောက်ဆာလိတ်ပမာဏတို့ကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် တိုက်ရိုက်အသုံးပြုခဲ့သည်။
Kahkonen et al. (1999) မှဖော်ပြထားသောနည်းလမ်းကို အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့် Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ကို အသုံးပြု၍ စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော ဖီနောလစ်များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် ရောနှောထားသော အရွက်တစ်ရှူး ၀.၁ ဂရမ်ခန့်ကို ၈၀% မီသနော ၂၀ မီလီလီတာဖြင့် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၂၄ နာရီကြာ ထုတ်ယူခဲ့ပြီး အပေါ်ယံအရည်ကို centrifugation လုပ်ပြီးနောက် စုဆောင်းခဲ့သည်။ နမူနာထုတ်ယူမှု ၀.၁ မီလီလီတာကို Folin-Ciocalteu reagent (၁၀%) ၀.၅ မီလီလီတာနှင့် ရောစပ်ပြီး ၃၀ စက္ကန့်ကြာ လှုပ်ခါကာ မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၅ မိနစ်ထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် ၂၀% ဆိုဒီယမ်ကာဗွန်နိတ်အရည် ၀.၅ မီလီလီတာ (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ကို ပြွန်တစ်ခုစီထဲသို့ထည့်ကာ သေချာစွာရောစပ်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ၁ နာရီကြာ မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ထားခဲ့သည်။ incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှော၏ absorbance ကို UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 765 ​​nm တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ နမူနာထုတ်ယူမှုများတွင် စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော ဖီနောများ၏ ပါဝင်မှုကို gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး fresh weight တစ်ဂရမ်လျှင် gallic acid equivalent ၏ မီလီဂရမ် (mg GAE g-1 fresh weight) အဖြစ် ဖော်ပြခဲ့သည်။
Djeridane et al. (၂၀၀၆) ၏ နည်းလမ်းအရ အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော flavonoid ပါဝင်မှုကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် အထက်ဖော်ပြပါ methanol ထုတ်ယူမှု 0.3 ml ကို 5% aluminum chloride solution (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) 0.3 ml နှင့် ရောစပ်ပြီး ပြင်းပြင်းထန်ထန် မွှေကာ အခန်းအပူချိန်တွင် 5 မိနစ်ကြာ ထားပြီးနောက် 10% potassium acetate solution (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.3 ml ထည့်ကာ သေချာစွာ ရောစပ်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် 30 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။ ထားပြီးနောက်၊ ဓာတ်ပြုမှု ရောစပ်ထားသော အရာ၏ absorbance ကို UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 430 nm တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ နမူနာ ထုတ်ယူမှုများတွင် စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော flavonoid ပါဝင်မှုကို rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, USA) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက် fresh weight တစ်ဂရမ်လျှင် rutin equivalent ၏ မီလီဂရမ်အဖြစ် ဖော်ပြသည် (mg RE g-1 fresh weight)။
ပဲရွက်များတွင်ပါဝင်သော စုစုပေါင်း အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပါဝင်မှုကို Yokoyama နှင့် Hiramatsu (၂၀၀၃) မှ အဆိုပြုပြီး Sun et al. (၂၀၀၆) မှ ပြုပြင်ထားသော နည်းလမ်းအပေါ် အခြေခံ၍ ပြုပြင်ထားသော ninhydrin reagent (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့် မြေတစ်ရှူး ၀.၁ ဂရမ်ကို pH 5.4 buffer ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့ပြီး supernatant ၂၀၀ μL ကို ninhydrin ၂၀၀ μL (၂%) နှင့် pyridine ၂၀၀ μL (၁၀%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) နှင့် ဓာတ်ပြုခဲ့ပြီး ဆူနေသောရေချိုးကန်တွင် ၃၀ မိနစ်ထားပြီးနောက် အအေးခံကာ UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 580 nm တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ proline ကို Bates နည်းလမ်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (Bates et al., 1973)။ ပရိုလင်းကို ၃% ဆာလ်ဖိုဆာလီစီလစ်အက်ဆစ် (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့ပြီး ဗဟိုခွာပြီးနောက်၊ supernatant ၀.၅ မီလီလီတာကို ၁ မီလီလီတာ glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) နှင့် ninhydrin reagent တို့ဖြင့် ရောစပ်ကာ ၉၀°C တွင် ၄၅ မိနစ်ကြာ အပူပေးကာ အအေးခံကာ အထက်ဖော်ပြပါ spectrophotometer ကိုအသုံးပြု၍ 520 nm တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ အရွက်ထုတ်ယူမှုများတွင်ပါဝင်သော စုစုပေါင်း free amino acids နှင့် proline တို့ကို glycine နှင့် proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) အသီးသီးကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး mg/g fresh weight အဖြစ်ဖော်ပြသည်။
အင်တီအောက်ဆီးဒင့် အင်ဇိုင်းများ၏ အင်ဇိုင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက်၊ တစ်ရှူး ၅၀၀ မီလီဂရမ်ခန့်ကို 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ပါဝင်သော 50 mM Tris buffer (pH 7.8) ၃ မီလီလီတာ နှင့် 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့ပြီး၊ ရေခဲသေတ္တာ (၄°C) အောက်တွင် 10,000 × g တွင် ၂၀ မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ကာ supernatant (ကုန်ကြမ်းအင်ဇိုင်း ထုတ်ယူမှု) ကို စုဆောင်းခဲ့သည် (El-Nagar et al., ၂၀၂၃; Osman et al., ၂၀၂၃)။ ထို့နောက် Catalase (CAT) ကို 0.1 M ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 ml နှင့် 269 mM H2O2 ပျော်ရည် 100 μl နှင့် ဓာတ်ပြုပြီး Aebi (1984) ၏ နည်းလမ်းအရ ၎င်း၏ အင်ဇိုင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို အနည်းငယ် ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)။ Guaiacol-dependent peroxidase (POX) အင်ဇိုင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို Harrach et al. (2009) ၏ နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ (၂၀၀၈) ကို အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် (El-Nagar et al., ၂၀၂၃; Osman et al., ၂၀၂၃) နှင့် polyphenol oxidase (PPO) ၏ အင်ဇိုင်းဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို 100 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ (pH 6.0) 2.2 ml၊ guaiacol 100 μl (TCI chemicals, Portland, OR, USA) နှင့် 12 mM H2O2 100 μl တို့ဖြင့် ဓာတ်ပြုပြီးနောက် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်းကို (El-Nagar et al., ၂၀၂၃; Osman et al., ၂၀၂၃) မှ အနည်းငယ်ပြုပြင်ထားသည်။ 0.1 M ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ (pH 6.0) တွင် အသစ်ပြင်ဆင်ထားသော catechol ပျော်ရည် 3 ml (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) နှင့် ဓာတ်ပြုပြီးနောက် assay ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ CAT လှုပ်ရှားမှုကို 240 nm (A240) တွင် H2O2 ပြိုကွဲမှုကို စောင့်ကြည့်ခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့ပြီး၊ POX လှုပ်ရှားမှုကို 436 nm (A436) တွင် absorbance တိုးလာမှုကို စောင့်ကြည့်ခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့ပြီး၊ PPO လှုပ်ရှားမှုကို UV-160A spectrophotometer (Shimadzu၊ ဂျပန်) ကို အသုံးပြု၍ 30 စက္ကန့်တိုင်း 495 nm (A495) တွင် absorbance အတက်အကျများကို မှတ်တမ်းတင်ခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။
နောက်ဆုံးကုသမှုအပြီး ၇၂ နာရီအကြာတွင် ပဲရွက်များ (ထိပ်မှ အပြည့်အဝဖွံ့ဖြိုးပြီး ဒုတိယနှင့် တတိယအရွက်များ) တွင် peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1)၊ superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) နှင့် glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) အပါအဝင် antioxidant နှင့်ဆက်စပ်သော မျိုးဗီဇသုံးမျိုး၏ transcript အဆင့်များကို တိုင်းတာရန် real-time RT-PCR ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ထုတ်လုပ်သူ၏ protocol အရ Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) ကို အသုံးပြု၍ RNA ကို ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအရ TOP script™ cDNA Synthesis Kit ကို အသုံးပြု၍ cDNA ကို ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ အထက်ပါ မျိုးဗီဇသုံးမျိုး၏ primer sequence များကို Supplementary Table S3 တွင် ဖော်ပြထားသည်။ PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ကို housekeeping gene အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး relative gene expression ကို 2-ΔΔCT နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည် (Livak and Schmittgen, 2001)။ ဇီဝဖိစီးမှု (အဖြစ်များသော ပဲပင်များနှင့် anthracnose မှို Colletotrichum lindemuthianum အကြား သဟဇာတမဖြစ်သော အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု) နှင့် abiotic ဖိစီးမှု (မိုးခေါင်ခြင်း၊ ဆားငန်ခြင်း၊ အပူချိန်နိမ့်ခြင်း) အောက်တွင် Actin တည်ငြိမ်မှုကို သရုပ်ပြခဲ့သည် (Borges et al., 2012)။
ကျွန်ုပ်တို့သည် S. sclerotiorum ရှိ oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) ပရိုတိန်းများ၏ genome-protein BLAST tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ကို အသုံးပြု၍ အစပိုင်းတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် S. sclerotiorum (taxide: 5180) ရှိ homologous ပရိုတိန်းကို map လုပ်ရန် query sequences အဖြစ် Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 amino acids) နှင့် Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 amino acids) မှ OAH ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ BLASTp ကို National Center for Biotechnology Information (NCBI) ဝက်ဘ်ဆိုက် http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ တွင် GenBank ရှိ မကြာသေးမီက ရရှိနိုင်သော S. sclerotiorum genome data ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ထို့အပြင်၊ S. sclerotiorum (SsOAH) မှ ခန့်မှန်းထားသော OAH မျိုးဗီဇနှင့် A. fijiensis CBS 313.89 မှ AfOAH ၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် phylogenetic tree နှင့် P. lagena မှ PlOAH တို့ကို MEGA11 တွင် အမြင့်ဆုံးဖြစ်နိုင်ခြေနည်းလမ်း (Tamura et al., 2021) နှင့် JTT matrix-based model (Jones et al., 1992) ကို အသုံးပြု၍ phylogenetic tree ကို S. sclerotiorum မှ ခန့်မှန်းထားသော OAH မျိုးဗီဇ (SsOAH) အားလုံး၏ ပရိုတိန်း sequences များ၏ multiple alignment analysis နှင့် Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ထားသည် (Papadopoulos and Agarwala, 2007)။ ထို့အပြင်၊ S. sclerotiorum မှ SsOAH ၏ အကောင်းဆုံး ကိုက်ညီသော အမိုင်နိုအက်ဆစ် အစီအစဉ်များကို ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ကို အသုံးပြု၍ query အစီအစဉ်များ (AfOAH နှင့် PlOAH) (Larkin et al., 2007) နှင့် ချိန်ညှိခဲ့ပြီး၊ ချိန်ညှိမှုတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော ဒေသများကို ESPript tool (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ကို အသုံးပြု၍ မြင်ယောင်ခဲ့သည်။
ထို့အပြင်၊ S. sclerotiorum SsOAH ၏ ခန့်မှန်းထားသော လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ကိုယ်စားပြုဒိုမိန်းများနှင့် ထိန်းသိမ်းထားသောနေရာများကို InterPro tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) ကို အသုံးပြု၍ မတူညီသော မိသားစုများအဖြစ် အပြန်အလှန် ခွဲခြားခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ခန့်မှန်းထားသော S. sclerotiorum SsOAH ၏ သုံးဖက်မြင် (3D) ဖွဲ့စည်းပုံ မော်ဒယ်လ်ကို Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) ကို အသုံးပြု၍ အတည်ပြုခဲ့သည်။ ခန့်မှန်းထားသော သုံးဖက်မြင်ဖွဲ့စည်းပုံများ (PDB ဖော်မတ်) ကို UCSF-Chimera package (ဗားရှင်း 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ကို အသုံးပြု၍ အပြန်အလှန် မြင်ယောင်ကြည့်နိုင်သည် (Pettersen et al., 2004)။
Sclerotinia sclerotiorum မှိုမျှင်တွင် oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) ၏ transcriptional level ကို ဆုံးဖြတ်ရန် Quantitative real-time fluorescence PCR ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် S. sclerotiorum ကို PDB ပါသော flask ထဲသို့ထည့်သွင်းပြီး shaking incubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) တွင် မှိုမျှင်ကြီးထွားမှုကိုလှုံ့ဆော်ရန် 25 ± 2°C တွင် 150 rpm ဖြင့် 24 နာရီနှင့် မှောင်မိုက်နေချိန် (24 နာရီ) တွင်ထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဆဲလ်များကို L-ornithine နှင့် fungicide Rizolex-T တို့ဖြင့် နောက်ဆုံး IC50 အာရုံစူးစိုက်မှု (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 40 mg/L နှင့် 3.2 mg/L အသီးသီး) တွင် ကုသပြီးနောက် တူညီသောအခြေအနေများအောက်တွင် နောက်ထပ် 24 နာရီကြာ မွေးမြူခဲ့သည်။ ပျိုးထောင်ပြီးနောက်၊ ယဉ်ကျေးမှုများကို 2500 rpm တွင် 5 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့ပြီး supernatant (မှိုမှိုမျှင်) ကို မျိုးဗီဇဖော်ပြမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် စုဆောင်းခဲ့သည်။ အလားတူပင်၊ ကူးစက်ခံရသော တစ်ရှူးများ၏ မျက်နှာပြင်ပေါ်တွင် အဖြူရောင်မှိုနှင့် ဂွမ်းမှိုမျှင်များ ဖြစ်ပေါ်ခဲ့သော ကူးစက်ခံရသည့် အပင်များမှ မှိုမျှင်မျှင်ကို ကူးစက်ခံရပြီး 0, 24, 48, 72, 96 နှင့် 120 နာရီတွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။ မှိုမျှင်မျှင်မှ RNA ကို ထုတ်ယူပြီးနောက် cDNA ကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ SsOAH အတွက် primer sequence များကို Supplementary Table S3 တွင် ဖော်ပြထားသည်။ SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) ကို housekeeping gene အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပြီး relative gene expression ကို 2-ΔΔCT နည်းလမ်း (Livak and Schmittgen, 2001) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
အောက်ဆာလစ်အက်ဆစ်ကို အာလူးဒက်စထရို့စ်ပြုတ်ရည် (PDB) နှင့် မှိုရောဂါပိုး Sclerotinia sclerotiorum ပါ၀င်သော အပင်နမူနာများတွင် Xu နှင့် Zhang (2000) တို့၏ နည်းလမ်းဖြင့် အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် S. sclerotiorum မှိုများကို PDB ပါ၀င်သော ပုလင်းများထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီးနောက် လှုပ်ခါထားသော incubator (မော်ဒယ် I2400၊ New Brunswick Scientific Co.၊ Edison၊ NJ၊ USA) တွင် မှိုဆဲလ်ကြီးထွားမှုကို အားပေးရန်အတွက် 150 rpm ဖြင့် 25 ± 2°C တွင် 3-5 ရက်ကြာ မှောင်မိုက်နေချိန် (24 နာရီ) တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။ incubation ပြီးနောက်၊ မှိုယဉ်ကျေးမှုကို Whatman #1 filter paper မှတစ်ဆင့် ဦးစွာစစ်ထုတ်ပြီးနောက် ကျန်ရှိနေသော မှိုဆဲလ်များကို ဖယ်ရှားရန် 2500 rpm တွင် 5 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ oxalate ကို နောက်ထပ်ပမာဏဆိုင်ရာ ဆုံးဖြတ်ချက်ချရန်အတွက် supernatant ကို စုဆောင်းပြီး 4°C တွင် သိမ်းဆည်းခဲ့သည်။ အပင်နမူနာများပြင်ဆင်ရန်အတွက် အပင်တစ်ရှူးအပိုင်းအစ 0.1 ဂရမ်ခန့်ကို distilled water (တစ်ကြိမ်လျှင် 2 ml) ဖြင့် သုံးကြိမ်ထုတ်ယူခဲ့သည်။ ထို့နောက် နမူနာများကို 2500 rpm တွင် 5 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့ပြီး၊ supernatant ကို Whatman No. 1 filter paper မှတစ်ဆင့် ခြောက်သွေ့စွာစစ်ထုတ်ကာ နောက်ထပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် စုဆောင်းခဲ့သည်။
oxalic acid ၏ ပမာဏဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှောကို ဖန်အဆို့ပါပြွန်တစ်ခုတွင် အောက်ပါအစီအစဉ်အတိုင်း ပြင်ဆင်ခဲ့သည်- နမူနာ 0.2 ml (သို့မဟုတ် PDB culture filtrate သို့မဟုတ် oxalic acid standard solution)၊ bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA) 0.11 ml၊ 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.198 ml နှင့် 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) 0.176 ml၊ ထို့နောက် ပျော်ရည်ကို ပေါင်းခံရေဖြင့် 4.8 ml အထိ ရောစပ်ပြီး ပြင်းပြင်းထန်ထန် ရောမွှေကာ 60 °C ရေချိုးကန်ထဲတွင် ချက်ချင်းထည့်ပါ။ 10 မိနစ်အကြာတွင် ဆိုဒီယမ်ဟိုက်ဒရောက်ဆိုဒ် ပျော်ရည် 0.5 ml (NaOH; 0.75 M) ထည့်ခြင်းဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို ရပ်တန့်လိုက်သည်။ ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှော၏ absorbance (A600) ကို UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) ကို အသုံးပြု၍ 600 nm တွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ PDB နှင့် distilled water ကို culture filtrates နှင့် plant samples များ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းအတွက် control အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ PDB medium ၏ milliliter လျှင် oxalic acid မိုက်ခရိုဂရမ် (μg.mL−1) အဖြစ်ဖော်ပြထားသော culture filtrates များတွင် oxalic acid ပါဝင်မှုများကို နှင့် အရွက်ထုတ်ယူမှုများတွင် fresh weight တစ်ဂရမ်လျှင် oxalic acid မိုက်ခရိုဂရမ် (μg.g−1 FW) အဖြစ်ဖော်ပြထားသော oxalic acid calibration curve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
လေ့လာမှုတစ်လျှောက်လုံးတွင်၊ စမ်းသပ်ချက်အားလုံးကို လုံးဝကျပန်းဒီဇိုင်း (CRD) ဖြင့် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားပြီး ကုသမှုတစ်ခုလျှင် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူခြောက်ခုနှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူတစ်ခုလျှင် အိုးငါးလုံး (အိုးတစ်လုံးလျှင် အပင်နှစ်ပင်) ဖြင့် အခြားနည်းဖြင့်ဖော်ပြထားခြင်းမရှိပါက။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူများကို ထပ်တူခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (နည်းပညာဆိုင်ရာမိတ္တူနှစ်ခု)။ နည်းပညာဆိုင်ရာမိတ္တူများကို စမ်းသပ်မှုတစ်ခုတည်း၏ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုကို စစ်ဆေးရန် အသုံးပြုခဲ့သော်လည်း အတုအယောင်မိတ္တူများကို ရှောင်ရှားရန် စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အသုံးမပြုခဲ့ပါ။ ဒေတာများကို variance analysis (ANOVA) ကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းအရ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) စမ်းသပ်မှု (p ≤ 0.05) ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ in vitro စမ်းသပ်ချက်များအတွက် IC50 နှင့် IC99 တန်ဖိုးများကို probit မော်ဒယ်ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့ပြီး 95% ယုံကြည်မှုကြားကာလများကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။
အီဂျစ်နိုင်ငံ၊ အယ်လ်ဂါဘီယာ အုပ်ချုပ်ရေးမှူးရုံးရှိ ပဲပုပ်စိုက်ခင်းအမျိုးမျိုးမှ စုစုပေါင်း isolate လေးခုကို စုဆောင်းခဲ့သည်။ PDA medium ပေါ်တွင်၊ isolate အားလုံးသည် ဝါဂွမ်းဖြူရောင်သို့ လျင်မြန်စွာပြောင်းလဲသွားပြီးနောက် sclerotium အဆင့်တွင် အညိုရောင် သို့မဟုတ် အညိုရောင်သို့ ပြောင်းလဲသွားသော creamy white mycelium ကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 1A)။ Sclerotia များသည် ပုံမှန်အားဖြင့် သိပ်သည်းသော၊ အနက်ရောင်၊ လုံးဝိုင်းသော သို့မဟုတ် ပုံသဏ္ဍာန်မမှန်ဘဲ၊ အရှည် 5.2 မှ 7.7 မီလီမီတာနှင့် အချင်း 3.4 မှ 5.3 မီလီမီတာရှိသည် (ပုံ 1B)။ ၂၅ ± ၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁၀-၁၂ ရက်ကြာ incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ culture medium ၏ အစွန်းတွင် sclerotia ၏ marginal pattern တစ်ခု ဖြစ်ပေါ်လာသော်လည်း (ပုံ 1A)၊ plate တစ်ခုလျှင် sclerotia အရေအတွက်မှာ ၎င်းတို့အကြားတွင် သိသိသာသာ ကွာခြားသည် (P < 0.001)၊ isolate 3 တွင် sclerotia အရေအတွက် အများဆုံးရှိသည် (plate တစ်ခုလျှင် sclerotia ၃၂.၃၃ ± ၁.၅၃၊ ပုံ 1C)။ အလားတူပင်၊ isolate #3 သည် အခြား isolate များထက် PDB တွင် oxalic acid ပိုမိုထုတ်လုပ်သည် (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; ပုံ 1D)။ Isolate #3 သည် phytopathogenic မှို Sclerotinia sclerotiorum ၏ ပုံမှန် morphological နှင့် microscopic ဝိသေသလက္ခဏာများကို ပြသခဲ့သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ PDA တွင်၊ isolate #3 ၏ ကိုလိုနီများသည် လျင်မြန်စွာကြီးထွားလာပြီး creamy white (ပုံ 1A)၊ reverse beige သို့မဟုတ် light salmon yellow-brown ဖြစ်ပြီး အချင်း ၉ စင်တီမီတာရှိသော ပြား၏ မျက်နှာပြင်ကို အပြည့်အဝဖုံးအုပ်ရန် ၂၅ ± ၂°C တွင် ၆-၇ ရက်ကြာခဲ့သည်။ အထက်ဖော်ပြပါ morphological နှင့် microscopic ဝိသေသလက္ခဏာများအပေါ် အခြေခံ၍ isolate #3 ကို Sclerotinia sclerotiorum အဖြစ်သတ်မှတ်ခဲ့သည်။
ပုံ ၁။ ပဲအမျိုးမျိုးမှ S. sclerotiorum ပိုးမျိုးကွဲများ၏ ဝိသေသလက္ခဏာများနှင့် ရောဂါဖြစ်စေနိုင်မှု။ (A) PDA အလယ်အလတ်ပေါ်ရှိ S. sclerotiorum ပိုးမျိုးကွဲလေးခု၏ မှိုများကြီးထွားမှု၊ (B) S. sclerotiorum ပိုးမျိုးကွဲလေးခု၏ sclerotia၊ (C) sclerotia အရေအတွက် (ပန်းကန်တစ်ခုလျှင်)၊ (D) PDB အလယ်အလတ်ပေါ်ရှိ oxalic acid ထုတ်လွှတ်မှု (μg.mL−1) နှင့် (E) ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် စီးပွားဖြစ်ထိခိုက်လွယ်သော ပဲမျိုးကွဲ Giza 3 ရှိ S. sclerotiorum ပိုးမျိုးကွဲလေးခု၏ ရောဂါပြင်းထန်မှု (%)။ တန်ဖိုးများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူငါးခု၏ ပျမ်းမျှ ± SD ကိုကိုယ်စားပြုသည် (n = 5)။ မတူညီသောအက္ခရာများသည် ကုသမှုများအကြား စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (p < 0.05)။ (F–H) ပုံမှန်အဖြူရောင်မှိုလက္ခဏာများသည် ပိုးမျိုးကွဲ #3 (dpi) ဖြင့် ကူးစက်ပြီး ၁၀ ရက်အကြာတွင် မြေပြင်အထက်ပင်စည်များနှင့် siliques များတွင် အသီးသီးပေါ်လာသည်။ (I) S. sclerotiorum isolate #3 ၏ internal transcribed spacer (ITS) ဒေသ၏ Evolutionary analysis ကို maximum likelihood method ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး National Center for Biotechnology Information (NCBI) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) မှ ရရှိသော reference isolates/strains ၂၀ နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်။ clustering lines များအထက်ရှိ ဂဏန်းများသည် ဒေသလွှမ်းခြုံမှု (%) ကို ညွှန်ပြပြီး clustering lines များအောက်ရှိ ဂဏန်းများသည် branch length ကို ညွှန်ပြသည်။
ထို့အပြင်၊ ရောဂါဖြစ်စေနိုင်မှုကို အတည်ပြုရန်အတွက်၊ ရရှိလာသော S. sclerotiorum isolate လေးမျိုးကို ခံနိုင်ရည်ရှိသော စီးပွားဖြစ်ပဲမျိုးစိတ် Giza 3 ကို ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် ထိုးနှံရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် Koch's postulates နှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ 1E)။ ရရှိလာသော မှို isolate အားလုံးသည် ရောဂါဖြစ်စေနိုင်ပြီး ပဲစိမ်း (cv. Giza 3) ကို ကူးစက်နိုင်သော်လည်း၊ မြေပြင်အထက် အစိတ်အပိုင်းအားလုံးတွင် (ပုံ 1F)၊ အထူးသဖြင့် ပင်စည် (ပုံ 1G) နှင့် အသီးတောင့်များ (ပုံ 1H) တွင် ပုံမှန်အဖြူရောင်မှိုလက္ခဏာများကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ထိုးနှံပြီး ၁၀ ရက် (dpi) တွင်၊ isolate 3 သည် သီးခြားစမ်းသပ်မှုနှစ်ခုတွင် အပြင်းထန်ဆုံး isolate ဖြစ်သည်။ Isolate 3 သည် ပဲပင်များတွင် ရောဂါပြင်းထန်မှု အမြင့်ဆုံး (%) ရှိခဲ့သည် (ကူးစက်ပြီး ၇၊ ၁၄ နှင့် ၂၁ ရက် အသီးသီးတွင် ၂၄.၀ ± ၄.၀၊ ၅၈.၀ ± ၂.၀ နှင့် ၇၆.၇ ± ၃.၁; ပုံ 1F)။
အကျူးကျော်မှုအရှိဆုံး S. sclerotiorum isolate #3 ကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းကို internal transcribed spacer (ITS) sequencing (ပုံ 1I) အပေါ်အခြေခံ၍ ထပ်မံအတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 1I)။ isolate #3 နှင့် reference isolate/strains ၂၀ အကြား phylogenetic analysis အရ ၎င်းတို့အကြား ဆင်တူမှုမြင့်မားသည် (>99%) ကို ပြသခဲ့သည်။ S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) သည် ခြောက်သွေ့သောပဲစေ့များမှ ခွဲထုတ်ထားသော အမေရိကန် S. sclerotiorum isolate LPM36 (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) နှင့် တရုတ် S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number OR206374.1; 548 bp) တို့နှင့် ဆင်တူမှုမြင့်မားသည်ကို သတိပြုသင့်သည်၊ ၎င်းသည် violet (Matthiola incana) ပင်စည်ပုပ်ခြင်းကို ဖြစ်စေပြီး ၎င်းတို့အားလုံးကို dendrogram ၏ထိပ်တွင် သီးခြားစီအုပ်စုဖွဲ့ထားသည် (ပုံ 1I)။ အသစ်ထွက်ရှိလာတဲ့ sequence ကို NCBI database မှာ ထည့်သွင်းထားပြီး “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792) လို့ အမည်ပေးထားပါတယ်။ isolate 3 ဟာ အကျူးကျော်ဆုံး isolate ဖြစ်တာကိုလည်း တွေ့မြင်နိုင်ပါတယ်။ ဒါကြောင့် ဒီ isolate ကို နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်ချက်အားလုံးမှာ လေ့လာဖို့ ရွေးချယ်ခဲ့တာပါ။
diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ၏ ဘက်တီးရီးယားပိုးသတ်ဆေးအာနိသင်ကို မတူညီသော ပြင်းအားများ (12.5, 25, 50, 75, 100 နှင့် 125 mg/L) တွင် S. sclerotiorum isolate 3 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ in vitro တွင် လေ့လာခဲ့သည်။ L-ornithine သည် ဘက်တီးရီးယားပိုးသတ်ဆေးအာနိသင်ရှိပြီး S. sclerotiorum hyphae ၏ radial ကြီးထွားမှုကို ပမာဏပေါ်မူတည်၍ တဖြည်းဖြည်း ဟန့်တားပေးသည်ကို သတိပြုသင့်သည် (ပုံ 2A, B)။ စမ်းသပ်ထားသော အမြင့်ဆုံးပြင်းအား (125 mg/L) တွင် L-ornithine သည် အမြင့်ဆုံး mycelial ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားမှုနှုန်း (99.62 ± 0.27%; ပုံ 2B) ကို ပြသခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် စမ်းသပ်ထားသော အမြင့်ဆုံးပြင်းအား (10 mg/L) တွင် စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T (ဟန့်တားမှုနှုန်း 99.45 ± 0.39%; ပုံ 2C) နှင့် ညီမျှပြီး အလားတူအာနိသင်ရှိကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
ရုပ်ပုံ ၂။ Sclerotinia sclerotiorum ကို ဆန့်ကျင်သော L-ornithine ၏ in vitro ပိုးသတ်ဆေးအာနိသင်။ (က) S. sclerotiorum ကို ဆန့်ကျင်သော L-ornithine ပြင်းအားအမျိုးမျိုး၏ ပိုးသတ်ဆေးအာနိသင်ကို စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T (10 mg/L) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်း။ (ခ၊ ဂ) L-ornithine (12.5၊ 25၊ 50၊ 75၊ 100 နှင့် 125 mg/L) သို့မဟုတ် Rizolex-T (2၊ 4၊ 6၊ 8 နှင့် 10 mg/L) အသီးသီးဖြင့် ကုသပြီးနောက် S. sclerotiorum မှိုကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားနှုန်း (%)။ တန်ဖိုးများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားငါးခု၏ ပျမ်းမျှ ± SD ကို ကိုယ်စားပြုသည် (n = 5)။ မတူညီသော အက္ခရာများသည် ကုသမှုများအကြား စာရင်းအင်းဆိုင်ရာ ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (p < 0.05)။ (ဃ၊ င) L-ornithine နှင့် စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T ၏ Probit မော်ဒယ် ဆုတ်ယုတ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု အသီးသီး။ probit မော်ဒယ် regression မျဉ်းကို solid blue line အဖြစ်ပြသထားပြီး၊ confidence interval (95%) ကို dashed red line အဖြစ်ပြသထားသည်။
ထို့အပြင်၊ probit regression analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး သက်ဆိုင်ရာ plots များကို ဇယား ၁ နှင့် ပုံ ၂D၊ E တွင် ပြသထားသည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် L-ornithine ၏ လက်ခံနိုင်သော slope တန်ဖိုး (y = 2.92x − 4.67) နှင့် ဆက်စပ်သော သိသာထင်ရှားသော စာရင်းအင်းများ (Cox & Snell R2 = 0.3709၊ Nagelkerke R2 = 0.4998 နှင့် p < 0.0001; ပုံ ၂D) သည် စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99၊ Cox & Snell R2 = 0.1242၊ Nagelkerke R2 = 0.1708 နှင့် p < 0.0001) (ဇယား ၁) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက S. sclerotiorum ကို ဆန့်ကျင်သော မှိုသတ်ဆေး အာနိသင် မြင့်မားကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
ဇယား ၁။ S. sclerotiorum ကို ဆန့်ကျင်သည့် L-ornithine နှင့် စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး “Rizolex-T” ၏ ထက်ဝက်အများဆုံး တားဆီးနိုင်စွမ်း (IC50) နှင့် IC99 (mg/l) တန်ဖိုးများ။
အလုံးစုံသော်၊ L-ornithine (250 mg/L) သည် ကုသမှုမခံယူရသေးသော S. sclerotiorum ကူးစက်ခံထားရသော အပင်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကုသထားသော သာမန်ပဲပင်များတွင် အဖြူရောင်မှိုများ ဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် ပြင်းထန်မှုကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (ထိန်းချုပ်မှု၊ ပုံ 3A)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ကုသမှုမခံယူရသေးသော ကူးစက်ခံထားရသော ထိန်းချုပ်အပင်များ၏ ရောဂါပြင်းထန်မှုသည် တဖြည်းဖြည်း မြင့်တက်လာသော်လည်း (52.67 ± 1.53၊ 83.21 ± 2.61 နှင့် 92.33 ± 3.06%)၊ ကုသမှုပြီး 7၊ 14 နှင့် 21 ရက်အကြာတွင် (dpt) တွင် L-ornithine သည် စမ်းသပ်မှုတစ်လျှောက်လုံး ရောဂါပြင်းထန်မှု (%) ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (8.97 ± 0.15၊ 18.00 ± 1.00 နှင့် 26.36 ± 3.07) (ပုံ 3A)။ အလားတူပင်၊ S. sclerotiorum ကူးစက်ခံရသော ပဲပင်များကို 250 mg/L L-ornithine ဖြင့် ကုသသောအခါ၊ ရောဂါတိုးတက်မှုမျဉ်းကွေးအောက်ရှိ ဧရိယာ (AUDPC) သည် ကုသမှုမခံယူရသေးသော ထိန်းချုပ်မှုတွင် 1274.33 ± 33.13 မှ 281.03 ± 7.95 သို့ လျော့ကျသွားပြီး၊ ၎င်းသည် အပြုသဘောဆောင်သော ထိန်းချုပ်မှု 50 mg/L Rizolex-T မှိုသတ်ဆေး (183.61 ± 7.71; ပုံ 3B) ထက် အနည်းငယ်နိမ့်ပါသည်။ ဒုတိယစမ်းသပ်မှုတွင်လည်း အလားတူလမ်းကြောင်းကို တွေ့ရှိရပါသည်။
ပုံ ၃။ ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် Sclerotinia sclerotiorum ကြောင့်ဖြစ်သော ပဲစင်းငုံဖြူဥ ဖွံ့ဖြိုးမှုအပေါ် L-ornithine ကို ပြင်ပမှအသုံးပြုခြင်း၏ အကျိုးသက်ရောက်မှု။ (က) ပဲစင်းငုံဖြူမှို ၂၅၀ မီလီဂရမ်/လီတာ L-ornithine ဖြင့် ကုသပြီးနောက် ပဲစင်းငုံဖြူမှို၏ ရောဂါတိုးတက်မှုမျဉ်းကွေး။ (ခ) L-ornithine ဖြင့် ကုသပြီးနောက် ပဲစင်းငုံဖြူမှို၏ ရောဂါတိုးတက်မှုမျဉ်းကွေးအောက်ရှိ ဧရိယာ (AUDPC)။ တန်ဖိုးများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားငါးခု၏ ပျမ်းမျှ ± SD ကို ကိုယ်စားပြုသည် (n = 5)။ မတူညီသော အက္ခရာများသည် ကုသမှုများအကြား စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (p < 0.05)။
L-ornithine ၂၅၀ မီလီဂရမ်/လီတာကို ပြင်ပမှ ထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် ၄၂ ရက်အကြာတွင် အပင်၏ အမြင့်ကို တဖြည်းဖြည်း မြှင့်တင်ပေးသည် (ပုံ ၄က)၊ အပင်တစ်ပင်လျှင် အကိုင်းအခက်အရေအတွက် (ပုံ ၄ခ) နှင့် အပင်တစ်ပင်လျှင် အရွက်အရေအတွက် (ပုံ ၄ဂ)။ စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T (၅၀ မီလီဂရမ်/လီတာ) သည် လေ့လာထားသော အာဟာရဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်အားလုံးအပေါ် အကြီးမားဆုံး အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသော်လည်း၊ L-ornithine ၂၅၀ မီလီဂရမ်/လီတာကို ပြင်ပမှ ထိုးသွင်းခြင်းသည် ကုသမှုမခံယူရသေးသော ထိန်းချုပ်မှုများထက် ဒုတိယအကြီးမားဆုံး အကျိုးသက်ရောက်မှု ရှိသည် (ပုံ ၄က-ဂ)။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ L-ornithine ကုသမှုသည် photosynthetic pigments chlorophyll a (ပုံ ၄ဃ) နှင့် chlorophyll b (ပုံ ၄င) တို့၏ ပါဝင်မှုကို သိသာထင်ရှားသော အကျိုးသက်ရောက်မှု မရှိသော်လည်း၊ negative control (၀.၄၄ ± ၀.၀၂ မီလီဂရမ်/ဂရမ် fr wt) နှင့် positive control (၀.၄၆ ± ၀.၀၂ မီလီဂရမ်/ဂရမ် fr wt; ပုံ ၄ဖ) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက စုစုပေါင်း carotenoid ပါဝင်မှု (၀.၅၆ ± ၀.၀၃ မီလီဂရမ်/ဂရမ် fr wt) ကို အနည်းငယ် မြင့်တက်စေခဲ့သည်။ အလုံးစုံသော် ဤရလဒ်များက L-ornithine သည် ကုသထားသော ပဲပင်များအတွက် phytotoxic မဖြစ်စေဘဲ ၎င်းတို့၏ ကြီးထွားမှုကိုပင် လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပါသည်။
ပုံ ၄။ ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် Sclerotinia sclerotiorum ကူးစက်ခံရသော ပဲရွက်များ၏ ကြီးထွားမှုဝိသေသလက္ခဏာများနှင့် photosynthetic pigments များအပေါ် ပြင်ပမှ L-ornithine လိမ်းဆေး၏ အကျိုးသက်ရောက်မှု။ (A) အပင်အမြင့် (စင်တီမီတာ)၊ (B) အပင်တစ်ပင်လျှင် အကိုင်းအခက်အရေအတွက်၊ (C) အပင်တစ်ပင်လျှင် အရွက်အရေအတွက်၊ (D) Chlorophyll a ပါဝင်မှု (mg g-1 fr wt)၊ (E) Chlorophyll b ပါဝင်မှု (mg g-1 fr wt)၊ (F) စုစုပေါင်း carotenoid ပါဝင်မှု (mg g-1 fr wt)။ တန်ဖိုးများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားငါးခု၏ ပျမ်းမျှ ± SD ဖြစ်သည် (n = 5)။ မတူညီသော အက္ခရာများသည် ကုသမှုများအကြား စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (p < 0.05)။
reactive oxygen species (ROS; hydrogen peroxide [H2O2] အဖြစ်ဖော်ပြသည်) နှင့် free radicals (superoxide anions [O2•−] အဖြစ်ဖော်ပြသည်) တို့၏ in situ histochemical localization အရ L-ornithine (250 mg/L) ကို exogenously အသုံးပြုခြင်းသည် H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) နှင့် O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) စုပုံမှုကို သိသိသာသာ လျော့နည်းစေကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ကုသမှုမခံယူရသေးသော ရောဂါပိုးကူးစက်ခံရသော အပင်များ (173.31 ± 12.06 နှင့် 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, အသီးသီး) နှင့် စီးပွားဖြစ် မှိုသတ်ဆေး Rizolex-T 50 mg/L (170.12 ± 9.50 နှင့် 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, အသီးသီး) စုပုံမှုကို 72 နာရီတွင် ကုသထားသော အပင်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက တွေ့ရှိရသည်။ hpt အောက်တွင် H2O2 နှင့် O2•− မြင့်မားစွာစုပုံလာသည် (ပုံ 5A၊ B)။ အလားတူပင်၊ TCA-based malondialdehyde (MDA) assay အရ S. sclerotiorum ကူးစက်ခံရသော ပဲပင်များသည် ၎င်းတို့၏အရွက်များတွင် MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) မြင့်မားစွာစုပုံနေကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 5C)။ သို့သော် L-ornithine ကို ပြင်ပမှအသုံးပြုခြင်းသည် lipid peroxidation ကို သိသိသာသာလျော့ကျစေပြီး ကုသထားသောအပင်များတွင် MDA ပါဝင်မှုလျော့နည်းသွားခြင်း (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) ဖြင့်သက်သေပြခဲ့သည်။
ပုံ ၅။ ပြင်ပမှ L-ornithine လိမ်းဆေးသည် S. sclerotiorum ကူးစက်ခံရပြီး ၇၂ နာရီအကြာတွင် ဖန်လုံအိမ်အခြေအနေအောက်တွင် ကူးစက်ခံရပြီး ၇၂ နာရီတွင် အောက်ဆီဒေးရှင်းဖိစီးမှုနှင့် အင်ဇိုင်းမဟုတ်သော အင်ဇိုင်းဆန့်ကျင်ရေး ကာကွယ်ရေးယန္တရားများ၏ အဓိကအမှတ်အသားများအပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှု။ (A) ၇၂ hpt တွင် ဟိုက်ဒရိုဂျင်ပါအောက်ဆိုဒ် (H2O2; nmol g−1 FW)၊ (B) ၇၂ hpt တွင် စူပါအောက်ဆိုဒ် အန်အိုင်းယွန်း (O2•−; nmol g−1 FW)၊ (C) ၇၂ hpt တွင် malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW)၊ (D) ၇၂ hpt တွင် စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော ဖီနောများ (mg GAE g−1 FW)၊ (E) ၇၂ hpt တွင် စုစုပေါင်းပျော်ဝင်နိုင်သော flavonoids (mg RE g−1 FW)၊ (F) ၇၂ hpt တွင် စုစုပေါင်းလွတ်လပ်သော အမိုင်နိုအက်ဆစ် (mg g−1 FW) နှင့် (G) ၇၂ hpt တွင် ပရိုလင်းပါဝင်မှု (mg g−1 FW)။ တန်ဖိုးများသည် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွား ၅ ခု (n = 5) ၏ ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှု (ပျမ်းမျှ ± SD) ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ မတူညီသော အက္ခရာများသည် ကုသမှုများအကြား စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (p < 0.05)။