Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးရလဒ်များအတွက် သင့် browser ၏ ဗားရှင်းအသစ်ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ စဉ်ဆက်မပြတ် ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styling သို့မဟုတ် JavaScript မပါဘဲ ပြသနေပါသည်။
ပရိုပီယွန်နစ်အက်ဆစ် (PPA) ကို အော်တစ်ဇင်ရောင်စဉ်ရောဂါကဲ့သို့သော အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာရောဂါများတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှု၏ အခန်းကဏ္ဍကို လေ့လာရန် အသုံးပြုသည်။ PPA သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဇီဝဖြစ်စဉ်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် လည်ပတ်မှုကို နှောင့်ယှက်သည်ဟု လူသိများသည်။ သို့သော်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်၊ ကွဲထွက်မှုနှင့် ပေါင်းစည်းမှုအပေါ် PPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် ဤယန္တရားများ၏ ရှုပ်ထွေးသော ယာယီသဘောသဘာဝကြောင့် ပြဿနာရှိနေဆဲဖြစ်သည်။ ဤနေရာတွင်၊ PPA သည် အာရုံကြောဆဲလ်များနှင့်ဆင်တူသော SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အစွန်းရောက်ဖွဲ့စည်းပုံ၊ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များကို မည်သို့အကျိုးသက်ရောက်သည်ကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် ဖြည့်စွက် ပမာဏဆိုင်ရာ ရုပ်ပုံဖော်နည်းပညာများကို အသုံးပြုပါသည်။ PPA (5 mM) သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဧရိယာ (p < 0.01)၊ Feret အချင်းနှင့် ပတ်လည်အတိုင်းအတာ (p < 0.05) နှင့် ဧရိယာ 2 (p < 0.01) တို့တွင် သိသိသာသာ ကျဆင်းစေခဲ့သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အဖြစ်အပျက်တည်နေရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ကွဲထွက်မှုနှင့် ပေါင်းစည်းမှုဖြစ်ရပ်များတွင် သိသိသာသာ တိုးလာမှု (p < 0.05) ကို ပြသခဲ့ပြီး ဖိစီးမှုအခြေအနေများအောက်တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ကွန်ရက်၏ သမာဓိကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ထို့အပြင်၊ cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) နှင့် OPA1 (p < 0.05) တို့၏ mRNA ဖော်ပြမှုသည် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားခဲ့သည်။ 01)။ ၎င်းသည် ဖိစီးမှုအခြေအနေများအောက်တွင် လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းသိမ်းရန် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များကို ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းကို သရုပ်ပြသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်အပေါ် PPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများအပေါ် အမြင်သစ်များကို ပေးစွမ်းပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုများတွင် ပါဝင်သော ရှုပ်ထွေးသော ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများကို လေ့လာရန်အတွက် ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများ၏ အသုံးဝင်မှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယာများသည် စွမ်းအင်ထုတ်လုပ်မှုနှင့် ဇီဝပေါင်းစပ်မှုတွင် ၎င်းတို့၏ပုံမှန်အခန်းကဏ္ဍများအပြင် ဆဲလ်လုပ်ငန်းဆောင်တာအမျိုးမျိုးတွင် မရှိမဖြစ်ပါဝင်သူများဖြစ်သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယာဇီဝဖြစ်စဉ်သည် ကယ်လ်စီယမ်အချက်ပြမှု၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာနှင့် အောက်ဆီဒင့်လျော့ချမှု homeostasis၊ ရောင်ရမ်းမှုအချက်ပြမှု၊ ဗီဇပြောင်းလဲမှုများ၊ ဆဲလ်ပွားများခြင်း၊ ကွဲပြားခြင်းနှင့် ပရိုဂရမ်ရေးဆွဲထားသောဆဲလ်သေဆုံးမှုတို့၏ အဓိကထိန်းညှိပေးသူဖြစ်သည်။ အထူးသဖြင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာဇီဝဖြစ်စဉ်သည် အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှု၊ ရှင်သန်မှုနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်အတွက် အလွန်အရေးကြီးပြီး အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါဗေဒ2,3,4 ၏ အမျိုးမျိုးသောလက္ခဏာများတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ပါဝင်ပတ်သက်နေသည်။
လွန်ခဲ့သောဆယ်စုနှစ်အတွင်း ဇီဝဖြစ်စဉ်အခြေအနေသည် အာရုံကြောဆဲလ်များ ဖွံ့ဖြိုးမှု၊ ကွဲပြားမှု၊ ရင့်ကျက်မှုနှင့် ပလတ်စတစ်ဖြစ်မှုတို့၏ ဗဟိုထိန်းညှိပေးသည့်အရာအဖြစ် ပေါ်ထွက်လာခဲ့သည်5,6။ မကြာသေးမီက မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များသည် ဆဲလ်များအတွင်း ကျန်းမာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်အစုအဝေးကို ထိန်းသိမ်းပေးသည့် ဒိုင်းနမစ်လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုဖြစ်သည့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဇီဝစွမ်းအင်မှသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပြိုကွဲမှု၊ ပေါင်းစပ်မှု၊ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးနှင့် ရှင်းလင်းခြင်း7,8 အထိ ရှုပ်ထွေးသော အပြန်အလှန်မှီခိုလမ်းကြောင်းများဖြင့် ထိန်းညှိထားသည်။ ဤပေါင်းစပ်ယန္တရားများထဲမှ တစ်စုံတစ်ရာကို ပျက်ယွင်းစေခြင်းသည် ကျန်းမာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ကွန်ရက်များ၏ ထိန်းသိမ်းမှုကို ထိခိုက်စေပြီး အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် နက်ရှိုင်းသော လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်များရှိသည်9,10။ အမှန်စင်စစ် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်၏ ထိန်းညှိမှု မမှန်ခြင်းကို အော်တစ်ဇင်ရောင်စဉ်ရောဂါများ (ASD)11,12 အပါအဝင် စိတ်ရောဂါ၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာနှင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာရောဂါများစွာတွင် တွေ့ရှိရသည်။
ASD သည် ရှုပ်ထွေးသော မျိုးရိုးဗီဇနှင့် မျိုးရိုးဗီဇဆက်စပ်ဖွဲ့စည်းပုံရှိသော ကွဲပြားသည့် အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာရောဂါတစ်ခုဖြစ်သည်။ ASD ၏ အမွေဆက်ခံနိုင်မှုမှာ အငြင်းပွားစရာမရှိသော်လည်း အခြေခံမော်လီကျူးဆိုင်ရာရောဂါဗေဒကို နားမလည်နိုင်သေးပါ။ ဆေးခန်းမတိုင်မီ မော်ဒယ်များ၊ ဆေးခန်းလေ့လာမှုများနှင့် multi-omics မော်လီကျူးဒေတာစုများမှ အချက်အလက်များကို စုဆောင်းခြင်းသည် ASD13,14 တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှု၏ အထောက်အထားများကို တိုးပွားစေပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခင်က ASD ရှိသော လူနာအုပ်စုတွင် genome-wide DNA methylation screen ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများတစ်လျှောက်တွင် အစုအဝေးဖွဲ့ထားသော ကွဲပြားသည့် methylated မျိုးဗီဇများကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်15။ နောက်ပိုင်းတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဒိုင်းနမစ်၏ ဗဟိုထိန်းညှိပေးသည့်အရာများ၏ ကွဲပြားသည့် methylation ကို အစီရင်ခံခဲ့ပြီး ၎င်းသည် ASD16 တွင် mtDNA မိတ္တူအရေအတွက် တိုးလာခြင်းနှင့် ဆီးဇီဝဖြစ်စဉ်ပရိုဖိုင် ပြောင်းလဲခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်နှင့် homeostasis တို့သည် ASD ၏ ရောဂါဗေဒတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း အထောက်အထားများကို တိုးပွားစေပါသည်။ ထို့ကြောင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်၊ morphology နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်တို့အကြား ဆက်နွယ်မှုကို ယန္တရားဆိုင်ရာ နားလည်မှုကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေခြင်းသည် ဒုတိယမိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုဖြင့် သွင်ပြင်လက္ခဏာရှိသော အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများကို ဆက်လက်သုတေသနပြုခြင်း၏ အဓိကရည်မှန်းချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဖိစီးမှု တုံ့ပြန်မှုများတွင် သီးခြား မျိုးဗီဇများ၏ အခန်းကဏ္ဍကို လေ့လာရန် မော်လီကျူးနည်းပညာများကို မကြာခဏ အသုံးပြုလေ့ရှိသည်။ သို့သော် ဤချဉ်းကပ်မှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ထိန်းချုပ်မှု ယန္တရားများ၏ ဘက်စုံနှင့် ယာယီသဘောသဘာဝကြောင့် ကန့်သတ်ခံရနိုင်သည်။ ထို့အပြင်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် မျိုးဗီဇများ၏ ကွဲပြားသော ဖော်ပြမှုသည် လုပ်ဆောင်ချက်ပြောင်းလဲမှုများ၏ သွယ်ဝိုက်ညွှန်ပြချက်တစ်ခုဖြစ်သည်၊ အထူးသဖြင့် မျိုးဗီဇ အကန့်အသတ်ရှိသော အရေအတွက်ကိုသာ ပုံမှန်အားဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာလေ့ရှိသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ဇီဝစွမ်းအင်ဆိုင်ရာများကို လေ့လာရန် ပိုမိုတိုက်ရိုက်နည်းလမ်းများကို အဆိုပြုထားသည်17။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပုံသဏ္ဍာန်သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်နှင့် နီးကပ်စွာ ဆက်စပ်နေသည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပုံသဏ္ဍာန်၊ ချိတ်ဆက်မှုနှင့် ဖွဲ့စည်းပုံသည် စွမ်းအင်ထုတ်လုပ်မှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်နှင့် ဆဲလ်ရှင်သန်မှုအတွက် အရေးကြီးသည်5,18။ ထို့အပြင်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပုံသဏ္ဍာန်ပြောင်းလဲမှုများကို အာရုံစိုက်ပြီး ၎င်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှု၏ အသုံးဝင်သော အဆုံးမှတ်များအဖြစ် ဆောင်ရွက်နိုင်ပြီး နောက်ဆက်တွဲ ယန္တရားဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများအတွက် အခြေခံတစ်ခု ပေးစွမ်းနိုင်သည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပုံသဏ္ဍာန်ကို transmission electron microscopy (TEM) ကို အသုံးပြု၍ တိုက်ရိုက်ကြည့်ရှုနိုင်ပြီး ဆဲလ်များ၏ ultrastructure ကို အသေးစိတ်လေ့လာနိုင်စေပါသည်။ TEM သည် ဆဲလ်လူဦးရေတွင် gene transcription၊ protein expression သို့မဟုတ် mitochondrial functional parameters များကိုသာ အားကိုးမည့်အစား mitochondrial cristae ၏ morphology၊ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် structure ကို တိုက်ရိုက်မြင်သာစေသည်17,19,20။ ထို့အပြင်၊ TEM သည် mitochondrial function နှင့် homeostasis တွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည့် endoplasmic reticulum နှင့် autophagosomes ကဲ့သို့သော mitochondrial နှင့် အခြား organelles များအကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို လေ့လာခြင်းကို လွယ်ကူချောမွေ့စေသည်21,22။ ထို့ကြောင့်၊ ၎င်းသည် TEM ကို သီးခြားလမ်းကြောင်းများ သို့မဟုတ် မျိုးဗီဇများကို အာရုံစိုက်ခြင်းမပြုမီ mitochondrial dysfunction ကို လေ့လာရန်အတွက် ကောင်းမွန်သော အစပြုရာနေရာတစ်ခု ဖြစ်စေသည်။ mitochondrial function သည် neuropathology နှင့် ပိုမိုသက်ဆိုင်လာသည်နှင့်အမျှ in vitro neuronal models များတွင် mitochondrial morphology နှင့် dynamics ကို တိုက်ရိုက်နှင့် အရေအတွက်အားဖြင့် လေ့လာနိုင်ရန် လိုအပ်ချက်ရှိပါသည်။
ဤဆောင်းပါးတွင်၊ အော်တစ်ဇင်ရောဂါတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှု၏ အာရုံကြောပုံစံတစ်ခုတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးပါမည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား propionyl-CoA carboxylase အင်ဇိုင်း PCC ၏ လက်အောက်ခံယူနစ်တစ်ခုဖြစ်သော ASD15 တွင် propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) ၏ ကွဲပြားသော မီသိုင်းလေးရှင်းကို ယခင်က ကျွန်ုပ်တို့ တင်ပြခဲ့ပါသည်။ PCC ၏ ထိန်းညှိမှု မမှန်ခြင်းသည် propionic acid (PPA)23,24,25 အပါအဝင် propionyl derivatives များ အဆိပ်သင့်စုပုံခြင်းကို ဖြစ်စေသည်ဟု လူသိများသည်။ PPA သည် အာရုံကြောဇီဝဖြစ်စဉ်ကို နှောင့်ယှက်ပြီး in vivo တွင် အပြုအမူကို ပြောင်းလဲစေကြောင်း ပြသထားပြီး ASD26,27,28 တွင် ပါဝင်သော အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှု ယန္တရားများကို လေ့လာရန်အတွက် တည်ထောင်ထားသော တိရစ္ဆာန်ပုံစံတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ PPA သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အမြှေးပါး အလားအလာ၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် အသက်ရှူခြင်းကို in vitro တွင် နှောင့်ယှက်ကြောင်း သတင်းပို့ထားပြီး အာရုံကြောများတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှုကို ပုံစံထုတ်ရန် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုခဲ့သည်29,30။ သို့သော်၊ PPA ကြောင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ဒိုင်းနမစ်အပေါ် သက်ရောက်မှုကို ကောင်းစွာနားမလည်သေးပါ။
ဤလေ့လာမှုသည် SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်၊ ဒိုင်းနမစ်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ် PPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို တွက်ချက်ရန် ဖြည့်စွက်ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများကို အသုံးပြုသည်။ ပထမဦးစွာ၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ultrastructure17,31,32 တို့တွင် ပြောင်းလဲမှုများကို မြင်ယောင်ရန် TEM နည်းလမ်းကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား33 ၏ ဒိုင်းနမစ်သဘောသဘာဝကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခြင်းဖြင့်၊ PPA ဖိစီးမှုအောက်ရှိ fission နှင့် fusion events၊ mitochondrial အရေအတွက်နှင့် volume အကြား မျှခြေပြောင်းလဲမှုများကို တွက်ချက်ရန် mitochondrial event localizer (MEL) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကိုလည်း အသုံးပြုခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ဒိုင်းနမစ်တို့သည် biogenesis၊ fission နှင့် fusion တွင်ပါဝင်သော မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုပြောင်းလဲမှုများနှင့် ဆက်စပ်မှုရှိမရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်ကို ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများ၏ ရှုပ်ထွေးမှုကို ရှင်းလင်းစွာဖော်ပြရန် စိန်ခေါ်မှုကို ဖော်ပြသည်။ SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် mitosis ၏ တိုင်းတာနိုင်သော convergent endpoint အဖြစ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်ကို လေ့လာရာတွင် TEM ၏ အသုံးဝင်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ မီးမောင်းထိုးပြသည်။ ထို့အပြင်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်သည့် ဒိုင်းနမစ်ဖြစ်ရပ်များကိုလည်း ဖမ်းယူသည့် ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများနှင့် ပေါင်းစပ်သောအခါ TEM ဒေတာသည် အကြွယ်ဝဆုံးသော အချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ မီးမောင်းထိုးပြသည်။ အာရုံကြောဆဲလ် mitosis ကို ပံ့ပိုးပေးသော မော်လီကျူး ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများ၏ နောက်ထပ် လက္ခဏာရပ်များသည် အာရုံကြောစနစ်နှင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုရောဂါများ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယ အစိတ်အပိုင်းအပေါ် အရေးကြီးသော ထိုးထွင်းသိမြင်မှုကို ပေးစွမ်းနိုင်ပါသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဖိစီးမှုကိုဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် SH-SY5Y ဆဲလ်များကို 3 mM နှင့် 5 mM ဆိုဒီယမ်ပရိုပီယိုနိတ် (NaP) ကိုအသုံးပြု၍ PPA ဖြင့်ကုသခဲ့သည်။ TEM မတိုင်မီက နမူနာများကို မြင့်မားသောဖိအားဖြင့် အေးခဲစေပြီး အေးခဲစေခြင်းဖြင့် cryogenic နမူနာပြင်ဆင်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 1a)။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူသုံးခုတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားလူဦးရေ၏ morphological parameters ရှစ်ခုကိုတိုင်းတာရန် ကျွန်ုပ်တို့သည် automated mitochondrial image analysis pipeline တစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့သည်။ PPA ကုသမှုသည် parameters လေးခုကို သိသိသာသာပြောင်းလဲစေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်- area 2၊ area၊ perimeter နှင့် Feret အချင်း (ပုံ 1b–e)။ 3 mM နှင့် 5 mM PPA ကုသမှု (p = 0.0183 နှင့် p = 0.002 အသီးသီး) (ပုံ 1b) ဖြင့် area 2 သိသိသာသာလျော့နည်းသွားပြီး area (p = 0.003)၊ perimeter (p = 0.0106) နှင့် Feret အချင်းအားလုံးသည် သိသိသာသာလျော့နည်းသွားသည်။ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့ (ပုံ 1c–e) နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက 5 mM ကုသမှုအုပ်စုတွင် သိသိသာသာလျော့ကျမှု (p = 0.0172) ရှိခဲ့သည်။ ဧရိယာနှင့် လုံးပတ်တွင် သိသာထင်ရှားသော လျော့ကျမှုများက 5 mM PPA ဖြင့် ကုသထားသော ဆဲလ်များတွင် ပိုသေးငယ်ပြီး ပိုလုံးဝိုင်းသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားရှိပြီး ဤမိုက်တိုခွန်ဒရီးယားများသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များထက် ပိုရှည်ပုံမပေါ်ကြောင်း ပြသသည်။ ၎င်းသည် Feret အချင်းတွင် သိသာထင်ရှားသော ကျဆင်းမှုနှင့်လည်း ကိုက်ညီပြီး အမှုန်အနားများကြား အကြီးဆုံးအကွာအဝေး လျော့ကျခြင်းကို ညွှန်ပြသည့် လွတ်လပ်သော ကန့်သတ်ချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ cristae ၏ ultrastructure တွင် ပြောင်းလဲမှုများကို တွေ့ရှိခဲ့သည်- PPA ဖိစီးမှု၏ လွှမ်းမိုးမှုအောက်တွင် cristae သည် သိသိသာသာ လျော့နည်းလာသည် (ပုံ 1a၊ panel B)။ သို့သော် ရုပ်ပုံအားလုံးသည် cristae ၏ ultrastructure ကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ထင်ဟပ်ခြင်းမဟုတ်သောကြောင့် ဤပြောင်းလဲမှုများ၏ အရေအတွက်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို မပြုလုပ်ခဲ့ပါ။ ဤ TEM အချက်အလက်များသည် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အခြေအနေသုံးခုကို ထင်ဟပ်နိုင်သည်- (1) PPA သည် fission ကို မြှင့်တင်ပေးသည် သို့မဟုတ် fusion ကို တားဆီးပေးပြီး ရှိပြီးသား မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကို အရွယ်အစား ကျုံ့စေသည်။ (2) ဇီဝဖြစ်စဉ် မြှင့်တင်ခြင်းသည် အသစ်၊ ပိုသေးငယ်သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကို ဖန်တီးသည် သို့မဟုတ် (3) ယန္တရားနှစ်ခုလုံးကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ဤအခြေအနေများကို TEM ဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်၍မရသော်လည်း သိသာထင်ရှားသော morphological ပြောင်းလဲမှုများသည် PPA ဖိစီးမှုအောက်ရှိ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား homeostasis နှင့် ဒိုင်းနမစ်များတွင် ပြောင်းလဲမှုများကို ညွှန်ပြသည်။ ဤဒိုင်းနမစ်များနှင့် ၎င်းတို့ကို အခြေခံသည့် အလားအလာရှိသော ယန္တရားများကို ပိုမိုသွင်ပြင်လက္ခဏာပြရန် နောက်ထပ် parameters များကို နောက်ပိုင်းတွင် ကျွန်ုပ်တို့ လေ့လာခဲ့သည်။
ပရိုပီယွန်နစ်အက်ဆစ် (PPA) သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပုံသဏ္ဍာန်ကို ပြန်လည်ပြုပြင်ပေးသည်။ (က) မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားအရွယ်အစား လျော့ကျလာပြီး PPA ကုသမှုတိုးလာသည်နှင့်အမျှ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားသည် ပိုမိုသေးငယ်ပြီး ပိုမိုဝိုင်းစက်လာကြောင်း ပြသသည့် ကိုယ်စားပြု အီလက်ထရွန် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အဏုကြည့်မှန်ပြောင်း (TEM) ပုံများ။ အသီးသီး 0 mM (မကုသရသေး)၊ 3 mM နှင့် 5 mM။ အနီရောင်မြားများသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကို ညွှန်ပြသည်။ (ခ-င) PPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသထားသော SH-SY5Y ဆဲလ်များကို TEM အတွက် ပြင်ဆင်ထားပြီး ရလဒ်များကို Fiji/ImageJ ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ကန့်သတ်ချက် ရှစ်ခုအနက် လေးခုသည် ထိန်းချုပ် (မကုသရသေး၊ 0 mM PPA) နှင့် ကုသထားသော (3 mM နှင့် 5 mM PPA) ဆဲလ်များအကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ပြသသည်။ (ခ) ဒေသ ၂၊ (ဂ) ဧရိယာ၊ (ဃ) ပတ်လည်အတိုင်းအတာ၊ (င) Feret အချင်း။ ကွဲလွဲမှု (ထိန်းချုပ် vs. ကုသမှု) နှင့် Dunnett ၏ မျိုးစုံနှိုင်းယှဉ်စမ်းသပ်မှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည် (p < 0.05)။ ဒေတာအမှတ်များသည် တစ်ဦးချင်းဆဲလ်တစ်ခုစီအတွက် ပျမ်းမျှ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားတန်ဖိုးကို ကိုယ်စားပြုပြီး အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ပြသထားသောဒေတာသည် n = 3 ကိုကိုယ်စားပြုပြီး၊ ထပ်တူပြုမှုတစ်ခုလျှင် အနည်းဆုံးဆဲလ် ၂၄ ခုရှိသည်။ စုစုပေါင်းရုပ်ပုံ ၂၆၆ ပုံကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ * သည် p < 0.05 ကိုညွှန်ပြသည်၊ ** သည် p < 0.01 ကိုညွှန်ပြသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်များသည် PPA ကို မည်သို့တုံ့ပြန်သည်ကို ပိုမိုသိရှိနိုင်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်ကို tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) ဖြင့် ဆေးဆိုးပြီး 3 နှင့် 5 mM PPA တွင် ၂၄ နာရီအကြာတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ တည်နေရာကို သတ်မှတ်ပြီး ပမာဏသတ်မှတ်ရန် time-lapse microscopy နှင့် MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ fission နှင့် fusion ဖြစ်ရပ်များကို ကုသခြင်း။ (ပုံ ၂က)။ MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးနောက်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်ဖွဲ့စည်းပုံအရေအတွက်နှင့် ၎င်းတို့၏ပျမ်းမျှထုထည်ကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်ဖွဲ့စည်းပုံများကို ထပ်မံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] တွင် ဖစ်ရှင်း [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] နှင့် ဖျူးရှင်း [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] နှင့် ဖျူးရှင်း [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ဖြစ်ရပ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 5 mM တွင် သိသိသာသာ တိုးလာသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3b)။ 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] နှင့် 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (ပုံ 3c) နှစ်ခုလုံးတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရေအတွက် သိသိသာသာ တိုးလာသော်လည်း မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား တည်ဆောက်ပုံတစ်ခုစီ၏ ပျမ်းမျှ ထုထည်မှာ မပြောင်းလဲဘဲ ရှိနေသည် (ပုံ 3c)။ 3d)။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ဒိုင်းနမစ်၏ ပြန်လည်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာကွန်ရက်၏ သမာဓိကို အောင်မြင်စွာ ထိန်းသိမ်းပေးသည့် အစားထိုးတုံ့ပြန်မှုတစ်ခုအဖြစ် ဆောင်ရွက်ကြောင်း ဤအချက်က အကြံပြုထားသည်။ 3 mM PPA တွင် ကွဲထွက်မှုဖြစ်ရပ်များ တိုးလာခြင်းက မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ အရေအတွက် တိုးလာခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ကွဲထွက်မှုကြောင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုသော်လည်း ပျမ်းမျှမိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ပမာဏသည် အခြေခံအားဖြင့် မပြောင်းလဲဘဲ ရှိနေသောကြောင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို နောက်ထပ် အစားထိုးတုံ့ပြန်မှုအဖြစ် ပယ်ချ၍မရပါ။ သို့သော် ဤဒေတာများသည် TEM မှ လေ့လာတွေ့ရှိရသော သေးငယ်ပြီး လုံးဝိုင်းသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယာဖွဲ့စည်းပုံများနှင့် ကိုက်ညီပြီး PPA ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ဒိုင်းနမစ်တွင် သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများကိုလည်း ပြသသည်။
ပရိုပီယွန်နစ်အက်ဆစ် (PPA) သည် ကွန်ရက်တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုကို ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် dynamic mitochondrial remodeling ကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ SH-SY5Y ဆဲလ်များကို ပြုစုပျိုးထောင်ပြီး ၂၄ နာရီကြာ 3 နှင့် 5 mM PPA ဖြင့် ကုသကာ TMRE နှင့် Hoechst 33342 ဖြင့် ဆေးဆိုးပြီးနောက် MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ (က) အခြေအနေတစ်ခုစီအတွက် အချိန် 2 (t2) တွင် အရောင်နှင့် binarized အမြင့်ဆုံးပြင်းထန်မှု ခန့်မှန်းချက်များကို သရုပ်ဖော်သည့် ကိုယ်စားပြု time-lapse microscopy ရုပ်ပုံများ။ binary image တစ်ခုစီတွင် ဖော်ပြထားသော ရွေးချယ်ထားသော ဒေသများကို အချိန်နှင့်အမျှ ဒိုင်းနမစ်ကို သရုပ်ဖော်ရန် မတူညီသော အချိန်ဘောင်သုံးခု (t1-t3) တွင် မြှင့်တင်ထားပြီး 3D တွင် ပြသထားသည်။ fusion events များကို အစိမ်းရောင်ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။ fission events များကို အစိမ်းရောင်ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။ အနီရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။ (ခ) အခြေအနေတစ်ခုစီအတွက် dynamic events ပျမ်းမျှအရေအတွက်။ (ဂ) ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် mitochondrial structures ပျမ်းမျှအရေအတွက်။ (ဃ) ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် mitochondrial structure တစ်ခုစီ၏ ပျမ်းမျှထုထည် (µm3)။ ပြသထားသော data များသည် ကုသမှုအုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = 15 ဆဲလ်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ပြသထားသော error bar များသည် mean ± SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်၊ scale bar = 10 μm၊ * p < 0.05။
ပရိုပီယွန်နစ်အက်ဆစ် (PPA) သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်နှင့်ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ၏ transcriptional suppression ကို ဖြစ်စေသည်။ SH-SY5Y ဆဲလ်များကို 3 နှင့် 5 mM PPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသခဲ့သည်။ မျိုးဗီဇ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းကို RT-qPCR ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ပြီး B2M သို့ ပုံမှန်ဖြစ်စေခဲ့သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဇီဝဖြစ်စဉ် မျိုးဗီဇများ (က) cMYC၊ (ခ) TFAM၊ (ဂ) NRF1 နှင့် (ဃ) NFE2L2။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ပေါင်းစပ်မှုနှင့် ကွဲထွက်မှု မျိုးဗီဇများ (င) STOML2၊ (စ) OPA1၊ (ဆ) MFN1၊ (ဇ) MFN2 နှင့် (ဈ) DRP1။ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များ (p < 0.05) ကို one-way ANOVA (ထိန်းချုပ်မှု vs ကုသမှု) နှင့် Dunnett's multiple comparison test ကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်ခဲ့သည်- * သည် p < 0.05 ကို ညွှန်ပြသည်၊ ** သည် p < 0.01 ကို ညွှန်ပြသည်၊ နှင့် **** သည် p < 0.0001 ကို ညွှန်ပြသည်။ ဘားများသည် ပျမ်းမျှဖော်ပြချက် ± SEM ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ပြသထားသောဒေတာသည် n = 3 (STOML2၊ OPA1၊ TFAM)၊ n = 4 (cMYC၊ NRF1၊ NFE2L2) နှင့် n = 5 (MFN1၊ MFN2၊ DRP1) ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာမိတ္တူများကိုကိုယ်စားပြုသည်။
TEM နှင့် MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများမှ ရရှိသောဒေတာများက PPA သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ဒိုင်းနမစ်များကို ပြောင်းလဲစေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ သို့သော် ဤပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများသည် ဤလုပ်ငန်းစဉ်များကို မောင်းနှင်သည့် အခြေခံယန္တရားများအကြောင်း ထိုးထွင်းသိမြင်မှုကို မပေးစွမ်းနိုင်ပါ။ ထို့ကြောင့် PPA ကုသမှုအပေါ် တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် မိုက်တိုစစ်တို့၏ အဓိကထိန်းညှိပေးသည့်အရာ ကိုးခု၏ ​​mRNA ဖော်ပြမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ 3 mM နှင့် 5 mM PPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကုသပြီးနောက် cell myeloma oncogene (cMYC), nuclear respiratory factor (NRF1), mitochondrial transcription factor 1 (TFAM), NFE2-like transcription factor BZIP (NFE2L2), gastrin-like protein 2 (STOML2), optic nerve atrophy 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) နှင့် dynamin-related protein 1 (DRP1) တို့ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် 3 mM (p = 0.0053၊ p = 0.0415 နှင့် p < 0.0001 အသီးသီး) နှင့် 5 mM (p = 0.0031၊ p = 0.0233၊ p < 0.0001) PPA ကုသမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ (ပုံ ၃က-ဂ)။ mRNA ဖော်ပြမှု လျော့ကျခြင်းသည် ဆေးပမာဏပေါ် မူတည်သည်- cMYC၊ NRF1 နှင့် TFAM ဖော်ပြမှုသည် 3 mM တွင် အသီးသီး 5.7၊ 2.6 နှင့် 1.9 ဆ လျော့ကျပြီး 5 mM တွင် 11.2၊ 3 နှင့် 2.2 ဆ လျော့ကျသွားသည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ဗဟို redox biogenesis မျိုးဗီဇ NFE2L2 သည် PPA ၏ မည်သည့်အာရုံစူးစိုက်မှုတွင်မျှ မပြောင်းလဲသော်လည်း၊ အလားတူ ဆေးပမာဏပေါ် မူတည်၍ ဖော်ပြမှု လျော့နည်းသွားသည့် လမ်းကြောင်းကို တွေ့ရှိရသည် (ပုံ ၃ဃ)။
fission နှင့် fusion ကို ထိန်းညှိပေးရာတွင် ပါဝင်သော ဂန္ထဝင်ဂျင်းများ၏ expression ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ STOML2 သည် fusion၊ mitophagy နှင့် biogenesis တို့တွင် ပါဝင်သည်ဟု ယူဆရပြီး ၎င်း၏ expression သည် 3 mM (2.4 ဆ ပြောင်းလဲမှု) နှင့် 5 mM (2.8 ဆ ပြောင်းလဲမှု) PPA ဖြင့် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည် (p < 0.0001) (ပုံ ၁)။ 3d)။ အလားတူပင်၊ OPA1 fusion gene expression သည် 3 mM (1.6 ဆ ပြောင်းလဲမှု) နှင့် 5 mM (1.9 ဆ ပြောင်းလဲမှု) PPA တွင် လျော့နည်းသွားသည် (p = 0.006 နှင့် p = 0.0024 အသီးသီး) (ပုံ ၃f)။ သို့သော်၊ ၂၄ နာရီ PPA stress အောက်တွင် fusion gene MFN1၊ MFN2 သို့မဟုတ် fission gene DRP1 ၏ expression တွင် သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားချက်များကို ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ ၃g–i)။ ထို့အပြင်၊ ပေါင်းစပ်မှုနှင့် ဖစ်ရှင်းပရိုတိန်းလေးမျိုး (OPA1၊ MFN1၊ MFN2 နှင့် DRP1) ၏ အဆင့်များသည် တူညီသောအခြေအနေများတွင် မပြောင်းလဲကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၄က-ဃ)။ ဤဒေတာသည် အချိန်တစ်ခုတည်းကို ထင်ဟပ်စေပြီး PPA ဖိစီးမှု၏ အစောပိုင်းအဆင့်များတွင် ပရိုတိန်းဖော်ပြမှု သို့မဟုတ် လုပ်ဆောင်ချက်အဆင့်များတွင် ပြောင်းလဲမှုများကို ထင်ဟပ်မည်မဟုတ်ကြောင်း မှတ်သားထားရန် အရေးကြီးပါသည်။ သို့သော် cMYC၊ NRF1၊ TFAM၊ STOML2 နှင့် OPA1 တို့၏ ဖော်ပြမှုတွင် သိသိသာသာလျော့ကျခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဇီဝဖြစ်စဉ်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဒိုင်းနမစ်တို့၏ သိသာထင်ရှားသော မှတ်တမ်းဆိုင်ရာ ချို့ယွင်းမှုကို ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင်၊ ဤဒေတာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားလုပ်ဆောင်ချက်တွင် အဆုံးအခြေအနေပြောင်းလဲမှုများကို တိုက်ရိုက်လေ့လာရန် ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများ၏ အသုံးဝင်မှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။
propionic acid (PPA) ကုသပြီးနောက် Fusion နှင့် fission factor ပရိုတိန်းအဆင့်များ မပြောင်းလဲပါ။ SH-SY5Y ဆဲလ်များကို 3 နှင့် 5 mM PPA ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသခဲ့သည်။ Western blot analysis ဖြင့် ပရိုတိန်းအဆင့်များကို ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့ပြီး expression အဆင့်များကို total protein အဖြစ် ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပျမ်းမျှပရိုတိန်းဖော်ပြမှုနှင့် target နှင့် total protein ၏ ကိုယ်စားပြု Western blots များကို ပြသထားသည်။ a – OPA1၊ b – MFN1၊ c – MFN2၊ d – DRP1။ Bar များသည် mean ± SEM ကိုကိုယ်စားပြုပြီး ပြသထားသောဒေတာများသည် n = 3 biological replicates ကိုကိုယ်စားပြုသည်။ variance ၏ one-way analysis နှင့် Dunnett's test ကို အသုံးပြု၍ မျိုးစုံနှိုင်းယှဉ်မှုများ (p < 0.05) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ မူရင်း gel နှင့် blot ကို Figure S1 တွင်ပြသထားသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှုသည် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ၊ နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာနှင့် ကြွက်သားဆိုင်ရာရောဂါများမှသည် အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများအထိ အမျိုးမျိုးသော စနစ်များစွာဆိုင်ရာရောဂါများနှင့် ဆက်စပ်နေပါသည်။ အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးခြင်းနှင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများစွာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ဦးနှောက်၏ သက်တမ်းတစ်လျှောက်လုံး ဤအင်္ဂါအစိတ်အပိုင်းများ၏ အရေးပါမှုကို မီးမောင်းထိုးပြနေပါသည်။ ဤရောဂါများတွင် ပါကင်ဆန်ရောဂါ၊ အယ်လ်ဇိုင်းမားရောဂါနှင့် ASD၃,၄,၁၈ တို့ ပါဝင်သည်။ သို့သော် ဤရောဂါများကို လေ့လာရန် ဦးနှောက်တစ်ရှူးများသို့ ဝင်ရောက်ရန်မှာ အထူးသဖြင့် ယန္တရားအဆင့်တွင် ခက်ခဲသောကြောင့် ဆဲလ်မော်ဒယ်စနစ်များသည် မရှိမဖြစ် ရွေးချယ်စရာတစ်ခု ဖြစ်လာပါသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများ၊ အထူးသဖြင့် အော်တစ်ဇင်ရောဂါများတွင် တွေ့ရှိရသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှုကို ပြန်လည်ဖော်ပြရန် PPA-treated SH-SY5Y ဆဲလ်များကို အသုံးပြုသည့် ဆဲလ်မော်ဒယ်စနစ်ကို အသုံးပြုပါသည်။ အာရုံကြောများတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်ကို လေ့လာရန် ဤ PPA မော်ဒယ်ကို အသုံးပြုခြင်းသည် ASD ၏ အကြောင်းရင်းကို ထိုးထွင်းသိမြင်စေနိုင်ပါသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology ပြောင်းလဲမှုများကိုကြည့်ရှုရန် TEM ကိုအသုံးပြုနိုင်ခြေကို ကျွန်ုပ်တို့စူးစမ်းလေ့လာခဲ့ပါသည်။ ၎င်း၏ထိရောက်မှုကိုအမြင့်ဆုံးဖြစ်စေရန်အတွက် TEM ကိုမှန်ကန်စွာအသုံးပြုရမည်ကိုသတိပြုရန်အရေးကြီးပါသည်။ cryo-specimens များပြင်ဆင်ခြင်းသည် ဆဲလ်အစိတ်အပိုင်းများကိုတစ်ပြိုင်နက်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် artifacts ဖွဲ့စည်းမှုကိုလျှော့ချခြင်းဖြင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာဖွဲ့စည်းပုံများကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာထိန်းသိမ်းနိုင်စေပါသည်။ ၎င်းနှင့်အညီ၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာ SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် subcellular organelles များနှင့်ရှည်လျားသော mitochondria ရှိကြောင်းကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 1a)။ ၎င်းသည် အာရုံကြောဆိုင်ရာဆဲလ်မော်ဒယ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology ကိုလေ့လာရန်အတွက် cryogenic ပြင်ဆင်မှုနည်းစနစ်များ၏အသုံးဝင်မှုကိုမီးမောင်းထိုးပြသည်။ TEM အချက်အလက်များ၏ objective analysis အတွက် quantitative တိုင်းတာမှုများသည်အရေးကြီးသော်လည်း၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphological ပြောင်းလဲမှုများကိုအတည်ပြုရန် မည်သည့်တိကျသော parameters များကိုတိုင်းတာသင့်သည်အပေါ် သဘောတူညီမှုမရှိသေးပါ။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology17,31,32 ကို quantitatively စစ်ဆေးခဲ့သော လေ့လာမှုအများအပြားအပေါ်အခြေခံ၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် morphological parameters ရှစ်ခုကိုတိုင်းတာသည့် automated mitochondrial image analysis pipeline တစ်ခုကိုတီထွင်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့မှာ area, aspect ratio, perimeter, circularity, degree, Feret diameter နှင့် roundness တို့ဖြစ်သည်။
၎င်းတို့အနက် PPA သည် ဧရိယာ ၂၊ ဧရိယာ၊ ပတ်လည်အတိုင်းအတာနှင့် Feret အချင်းတို့ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (ပုံ ၁ခ-င)။ ၎င်းက မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားသည် ပိုမိုသေးငယ်ပြီး ပိုမိုလုံးဝန်းလာကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး PPA30 ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဖိစီးမှု ၇၂ နာရီအကြာတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဧရိယာ လျော့ကျသွားကြောင်းပြသသည့် ယခင်လေ့လာမှုများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ ဤပုံသဏ္ဌာန်ဆိုင်ရာ လက္ခဏာများသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အက်ရှင်ဖြစ်စဉ်ကို ညွှန်ပြနိုင်ပြီး၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကွန်ရက်မှ ပျက်စီးနေသော အစိတ်အပိုင်းများကို မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အက်ရှင်မှတစ်ဆင့် ၎င်းတို့၏ ပျက်စီးမှုကို မြှင့်တင်ရန် လိုအပ်သော လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုဖြစ်သည့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အက်ရှင်ဖြစ်စဉ်ကို ညွှန်ပြနိုင်သည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ ပျမ်းမျှမိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရွယ်အစား လျော့ကျခြင်းသည် ဇီဝဖြစ်စဉ် တိုးလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နိုင်ပြီး ၎င်းသည် သေးငယ်သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖွဲ့စည်းမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ အက်ရှင်ဖြစ်စဉ် သို့မဟုတ် ဇီဝဖြစ်စဉ် တိုးလာခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဖိစီးမှုကို ဆန့်ကျင်၍ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဆဲလ်များကို ထိန်းသိမ်းရန် လျော်ကြေးတုံ့ပြန်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။ သို့သော် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကြီးထွားမှု လျော့နည်းလာခြင်း၊ ပေါင်းစပ်မှု ချို့ယွင်းခြင်း သို့မဟုတ် အခြားအခြေအနေများကို ချန်လှပ်ထား၍မရပါ။
TEM မှဖန်တီးထားသော မြင့်မားသော resolution ရှိသည့် ရုပ်ပုံများသည် တစ်ဦးချင်း mitochondria အဆင့်တွင် morphological ဝိသေသလက္ခဏာများကို ဆုံးဖြတ်နိုင်စေသော်လည်း၊ ဤနည်းလမ်းသည် အချိန်တစ်ခုအတွင်း နှစ်ဖက်မြင် snapshot များကို ထုတ်လုပ်ပေးသည်။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုအပေါ် dynamic responses များကို လေ့လာရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် mitochondria ကို TMRE ဖြင့် ဆေးဆိုးပြီး MEL analysis ပါသည့် time-lapse microscopy ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် mitochondrial network တွင် အချိန်နှင့်အမျှ ပြောင်းလဲမှုများကို high-throughput 3D visualization ပေးနိုင်သည်33,38။ PPA stress အောက်ရှိ mitochondrial dynamics တွင် သိမ်မွေ့သော်လည်း သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၂)။ 3 mM တွင် fission events အရေအတွက်သည် သိသိသာသာ တိုးလာသော်လည်း fusion events များသည် control တွင်ကဲ့သို့ အတူတူပင်ဖြစ်သည်။ 5 mM PPA တွင် fission နှင့် fusion events နှစ်ခုလုံး၏ အရေအတွက် တိုးလာသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်၊ သို့သော် ဤပြောင်းလဲမှုများသည် အချိုးကျပြီး fission နှင့် fusion kinetics များသည် မြင့်မားသော အာရုံစူးစိုက်မှုများတွင် equilibrium ရောက်ရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ ၂ခ)။ ပျမ်းမျှ mitochondrial volume သည် 3 နှင့် 5 mM PPA နှစ်ခုလုံးတွင် မပြောင်းလဲဘဲ ရှိနေပြီး mitochondrial network ၏ သမာဓိကို ထိန်းသိမ်းထားသည်ကို ညွှန်ပြသည် (ပုံ ၂ဃ)။ ၎င်းသည် ကွန်ရက်ကွဲအက်မှုမဖြစ်စေဘဲ homeostasis ကို ထိရောက်စွာထိန်းသိမ်းရန် အပျော့စားဇီဝဖြစ်စဉ်ဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်ရန် ဒိုင်းနမစ်မိုက်တိုခွန်ဒရီယကွန်ရက်များ၏စွမ်းရည်ကို ထင်ဟပ်စေသည်။ 3 mM PPA တွင်၊ ကွဲထွက်မှုတိုးလာခြင်းသည် မျှခြေအသစ်သို့ကူးပြောင်းရန် လုံလောက်သော်လည်း၊ PPA မြင့်မားသောပါဝင်မှုများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသောဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် ပိုမိုနက်ရှိုင်းသော kinetic remodeling လိုအပ်ပါသည်။
PPA ဖိစီးမှုပြင်းအားနှစ်ခုလုံးတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားအရေအတွက်တိုးလာသော်လည်း ပျမ်းမျှမိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပမာဏမှာ သိသိသာသာမပြောင်းလဲပါ (ပုံ ၂ဂ)။ ၎င်းသည် ဇီဝဖြစ်စဉ်တိုးလာခြင်း သို့မဟုတ် ပိုင်းခြားမှုတိုးလာခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။ သို့သော် ပျမ်းမျှမိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပမာဏ သိသိသာသာကျဆင်းခြင်းမရှိပါက ဇီဝပေါင်းစပ်မှုတိုးလာနိုင်ခြေပိုများသည်။ သို့သော် ပုံ ၂ ရှိဒေတာသည် အစားထိုးယန္တရားနှစ်ခုရှိကြောင်း ထောက်ခံသည်- မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖစ်ရှင်းမြင့်တက်လာခြင်းနှင့် ကိုက်ညီသော ဖစ်ရှင်းဖြစ်ရပ်အရေအတွက်တိုးလာခြင်းနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ကိုက်ညီသော ဖစ်ရှင်းဖြစ်ရပ်အရေအတွက်တိုးလာခြင်း။ အဆုံးစွန်အားဖြင့် အပျော့စားဖိစီးမှုအတွက် တက်ကြွသောလျော်ကြေးတွင် ဖစ်ရှင်း၊ ပေါင်းစပ်မှု၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားတို့ပါဝင်သည့် တစ်ပြိုင်နက်တည်းလုပ်ငန်းစဉ်များ ပါဝင်နိုင်သည်။ ယခင်စာရေးဆရာများက PPA သည် mitosis30,39 နှင့် mitophagy29 ကို မြှင့်တင်ပေးသည်ဟု ပြသခဲ့သော်လည်း PPA ကိုတုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖစ်ရှင်းနှင့် ပေါင်းစပ်ဒိုင်းနမစ်များကို ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းအတွက် အထောက်အထားများကို ကျွန်ုပ်တို့ ပေးပါသည်။ ဤဒေတာသည် TEM မှတွေ့ရှိရသော morphological ပြောင်းလဲမှုများကို အတည်ပြုပြီး PPA ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသော ယန္တရားများအကြောင်း နောက်ထပ်ထိုးထွင်းသိမြင်မှုကို ပေးစွမ်းသည်။
TEM သို့မဟုတ် MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှစ်ခုစလုံးသည် တွေ့ရှိရသော morphological ပြောင်းလဲမှုများ၏ အခြေခံတွင်ရှိသော မျိုးဗီဇထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများ၏ တိုက်ရိုက်သက်သေအထောက်အထားကို မပေးခဲ့သောကြောင့်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဇီဝဖြစ်စဉ်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ဒိုင်းနမစ်တို့တွင် ပါဝင်သော မျိုးဗီဇများ၏ RNA ဖော်ပြမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ cMYC proto-oncogene သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား၊ ဂလိုင်ကိုလိုင်းစစ်၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ်နှင့် အဆီအက်ဆစ်ဇီဝဖြစ်စဉ်တို့ကို ထိန်းညှိပေးရာတွင် ပါဝင်သော transcription factor တစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ cMYC သည် NRF1 နှင့် TFAM41 အပါအဝင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား transcription၊ translation နှင့် complex assembly တွင် ပါဝင်သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မျိုးဗီဇ ၆၀၀ နီးပါး၏ ဖော်ပြမှုကို ထိန်းညှိပေးသည်ဟု လူသိများသည်။ NRF1 နှင့် TFAM တို့သည် mitochondrial transcription၊ translation နှင့် complex assembly တို့တွင် ပါဝင်သော မျိုးဗီဇ ၆၀၀ နီးပါး၏ ဖော်ပြမှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် ဗဟိုထိန်းညှိပေးသည့် နှစ်ခုဖြစ်ပြီး mtDNA မိတ္တူကူးခြင်းကို အသက်ဝင်စေရန် PGC-1α ၏ အောက်ဘက်သို့ လုပ်ဆောင်သည်။ ဤလမ်းကြောင်းကို cAMP နှင့် AMPK signaling မှ အသက်ဝင်စေပြီး စွမ်းအင်အသုံးစရိတ်နှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဖိစီးမှုကို ထိခိုက်လွယ်သည်။ PPA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို oxidative stress ကြောင့် ဖြစ်နိုင်မနိုင် ဆုံးဖြတ်ရန် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဇီဝဖြစ်စဉ်၏ redox ထိန်းညှိပေးသည့် NFE2L2 ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။
NFE2L2 ဖော်ပြမှု မပြောင်းလဲသော်လည်း၊ 3 mM နှင့် 5 mM PPA ဖြင့် ၂၄ နာရီ ကုသပြီးနောက် cMYC၊ NRF1 နှင့် TFAM တို့၏ ဖော်ပြမှုတွင် တသမတ်တည်း လျော့ကျမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3a-c)။ cMYC ဖော်ပြမှု လျော့ကျခြင်းကို မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖိစီးမှုအပေါ် တုံ့ပြန်မှုအဖြစ် ယခင်က ဖော်ပြခဲ့ပြီး42၊ ပြောင်းပြန်အားဖြင့် cMYC ဖော်ပြမှု လျော့ကျခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ်၊ ကွန်ရက်ချိတ်ဆက်မှုနှင့် အမြှေးပါး செறிவுக்க ... မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ cMYC သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပြိုကွဲမှုနှင့် ပေါင်းစပ်မှု ထိန်းညှိမှု42,43 တွင်လည်း ပါဝင်ပတ်သက်ပြီး ဆဲလ်ကွဲပွားမှုအတွင်း DRP1 ဖော့စဖောရီလေးရှင်းနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒေသအလိုက် တိုးပွားစေသည်ဟု လူသိများသည်44၊ ထို့အပြင် အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မော်ဖိုလော်လော်ဂျီ ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းကို ဖြစ်စေသည်ဟု လူသိများသည်45။ အမှန်စင်စစ်၊ cMYC ချို့တဲ့သော fibroblasts များသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရွယ်အစား လျော့နည်းသွားပြီး PPA43 ဖိစီးမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြောင်းလဲမှုများနှင့် ကိုက်ညီသည်။ ဤဒေတာသည် cMYC နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ဒိုင်းနမစ်အကြား စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော်လည်း မရှင်းလင်းသေးသော ဆက်နွယ်မှုကို ပြသထားပြီး PPA ဖိစီးမှုကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းဆိုင်ရာ အနာဂတ်လေ့လာမှုများအတွက် စိတ်ဝင်စားဖွယ်ပစ်မှတ်တစ်ခုကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
NRF1 နှင့် TFAM လျော့ကျမှုသည် cMYC ၏ အရေးကြီးသော transcriptional activator အခန်းကဏ္ဍနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ ဤဒေတာများသည် PPA သည် ၂၂ နာရီတွင် NRF1 mRNA ဖော်ပြမှုကို လျော့ကျစေပြီး ATP ကုန်ဆုံးမှုနှင့် ဆက်စပ်နေပြီး ROS46 ကို မြင့်တက်စေကြောင်း ပြသသည့် လူသားအူမကြီးကင်ဆာဆဲလ်များတွင် ယခင်လေ့လာမှုများနှင့်လည်း ကိုက်ညီပါသည်။ ဤစာရေးသူများသည် TFAM ဖော်ပြမှုသည် ၈.၅ နာရီတွင် တိုးလာသော်လည်း ၂၂ နာရီတွင် အခြေခံအဆင့်သို့ ပြန်ရောက်သွားကြောင်းလည်း တင်ပြခဲ့သည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့် Kim et al. (၂၀၁၉) က SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် PPA ဖိစီးမှု ၄ နာရီကြာပြီးနောက် TFAM mRNA ဖော်ပြမှု သိသိသာသာ လျော့နည်းသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော် ၇၂ နာရီအကြာတွင် TFAM ပရိုတင်းဖော်ပြမှုသည် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာပြီး mtDNA မိတ္တူအရေအတွက် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့် ၂၄ နာရီအကြာတွင် ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ် မျိုးဗီဇအရေအတွက် လျော့ကျခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို အစောပိုင်းအချိန်များတွင် အသက်ဝင်စေခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည့် ဖြစ်နိုင်ခြေကို ဖယ်ထုတ်ခြင်းမဟုတ်ပါ။ ယခင်လေ့လာမှုများအရ PPA သည် SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် PGC-1α mRNA နှင့် ပရိုတင်းကို ၄ နာရီ ၃၀ မိနစ်တွင် သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးပြီး propionic acid သည် ၁၂ နာရီ ၃၉ မိနစ်တွင် PGC-1α မှတစ်ဆင့် နွားသငယ် hepatocytes များတွင် mitochondrial biogenesis ကို မြှင့်တင်ပေးကြောင်း ပြသထားသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ PGC-1α သည် NRF1 နှင့် TFAM ၏ တိုက်ရိုက် transcriptional regulator တစ်ခုသာမက fission နှင့် fusion47 ကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် MFN2 နှင့် DRP1 ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိပေးကြောင်း ပြသထားသည်။ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ၎င်းသည် PPA မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော mitochondrial compensatory responses များကို ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများ၏ နီးကပ်စွာ ပေါင်းစပ်မှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် PPA ဖိစီးမှုအောက်တွင် biogenesis နှင့် metabolism ၏ transcriptional regulation ကို သိသိသာသာ dysregulation ဖြစ်စေသည်။
STOML2၊ OPA1၊ MFN1၊ MFN2 နှင့် DRP1 မျိုးဗီဇများသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပြိုကွဲခြင်း၊ ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် ဒိုင်းနမစ်များ၏ ဗဟိုထိန်းညှိပေးသည့်အရာများထဲတွင် ပါဝင်သည်37,48,49။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်တွင် ပါဝင်သော အခြားမျိုးဗီဇများစွာ ရှိသော်လည်း၊ STOML2၊ OPA1 နှင့် MFN2 တို့သည် ASD cohorts များတွင် ကွဲပြားသော မီသိုင်းဓာတ်ပါဝင်ကြောင်း ယခင်က တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊16 နှင့် လွတ်လပ်သော လေ့လာမှုများစွာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဖိစီးမှုကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် ဤ transcription factors များတွင် ပြောင်းလဲမှုများကို အစီရင်ခံခဲ့သည်50,51။52။ OPA1 နှင့် STOML2 နှစ်မျိုးလုံး၏ ဖော်ပြမှုကို 3 mM နှင့် 5 mM PPA ကုသမှုဖြင့် သိသိသာသာ လျှော့ချခဲ့သည် (ပုံ 3e၊ f)။ OPA1 သည် MFN1 နှင့် 2 နှင့် တိုက်ရိုက် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုမှတစ်ဆင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်ခြင်း၏ ဂန္ထဝင် ထိန်းညှိပေးသည့်အရာများထဲမှ တစ်ခုဖြစ်ပြီး cristae ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်ဗေဒတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်53။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်တွင် STOML2 ၏ တိကျသော အခန်းကဏ္ဍမှာ မရှင်းလင်းသေးသော်လည်း၊ ၎င်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်ခြင်း၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် မိုက်တိုဖိုးဂျီတို့တွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း အထောက်အထားများက ဖော်ပြသည်။
STOML2 သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ချိတ်ဆက်မှုနှင့် အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ကွင်းဆက် ရှုပ်ထွေးမှုများ ဖွဲ့စည်းခြင်းကို ထိန်းသိမ်းခြင်း54,55 တွင် ပါဝင်ပတ်သက်ပြီး ကင်ဆာဆဲလ်များ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများကို သိသိသာသာ ပြောင်းလဲစေကြောင်း ပြသထားသည်56။ လေ့လာမှုများအရ STOML2 သည် BAN နှင့် cardiolipin 55, 57, 58 နှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုမှတစ်ဆင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အမြှေးပါး အလားအလာနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို မြှင့်တင်ပေးကြောင်း ပြသထားသည်။ ထို့အပြင်၊ လွတ်လပ်သော လေ့လာမှုများအရ STOML2 နှင့် PINK1 အကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုသည် mitophagy59,60 ကို ထိန်းညှိပေးကြောင်း ပြသထားသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ STOML2 သည် MFN2 နှင့် တိုက်ရိုက် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုရှိပြီး တည်ငြိမ်ကြောင်းနှင့် OPA1 ပျက်စီးခြင်းအတွက် တာဝန်ရှိသော protease ကို ဟန့်တားခြင်းဖြင့် ရှည်လျားသော OPA1 isoforms များကို တည်ငြိမ်စေရန် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း သတင်းပို့ထားသည်53,61,62။ PPA တုံ့ပြန်မှုများတွင် တွေ့ရှိရသော STOML2 ဖော်ပြမှု လျော့ကျခြင်းသည် ဤ fusion ပရိုတိန်းများကို ubiquitin- နှင့် proteasome-dependent pathways48 မှတစ်ဆင့် ပျက်စီးခြင်းကို ပိုမိုခံရလွယ်စေနိုင်သည်။ PPA အပေါ် ပြောင်းလဲတုံ့ပြန်မှုတွင် STOML2 နှင့် OPA1 တို့၏ တိကျသောအခန်းကဏ္ဍမှာ မရှင်းလင်းသော်လည်း၊ ဤ fusion မျိုးဗီဇများ၏ ဖော်ပြမှုလျော့နည်းသွားခြင်း (ပုံ ၃) သည် fission နှင့် fusion အကြား မျှခြေကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အရွယ်အစားကို လျော့နည်းစေသည် (ပုံ ၃)။ ၁)။
အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ OPA1 ပရိုတိန်းဖော်ပြမှုသည် ၂၄ နာရီကြာပြီးနောက် မပြောင်းလဲဘဲရှိနေခဲ့ပြီး MFN1၊ MFN2 သို့မဟုတ် DRP1 ၏ mRNA နှင့် ပရိုတိန်းအဆင့်များသည် PPA ကုသမှုပြီးနောက် သိသိသာသာမပြောင်းလဲပါ (ပုံ 3g-i၊ ပုံ 4)။ ၎င်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်မှုနှင့် ကွဲထွက်မှုတွင်ပါဝင်သော ဤအချက်များ၏ ထိန်းညှိမှုတွင် ပြောင်းလဲမှုမရှိကြောင်း ညွှန်ပြနိုင်သည်။ သို့သော်၊ ဤဂျင်းလေးခုစလုံးကို ပရိုတိန်းလှုပ်ရှားမှုကို ထိန်းချုပ်သော posttranscriptional modifications (PTMs) များဖြင့်လည်း ထိန်းညှိထားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ OPA1 တွင် ကွဲပြားသော isoforms နှစ်ခုထုတ်လုပ်ရန် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားတွင် proteolytically cleaved လုပ်သည့် အခြားရွေးချယ်စရာ splice variants ရှစ်ခုရှိသည်။ ရှည်လျားသောနှင့် တိုတောင်းသော isoforms များအကြား ချိန်ခွင်လျှာညှိမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်မှုနှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကွန်ရက် 64 ၏ ထိန်းသိမ်းမှုတွင် OPA1 ၏ အခန်းကဏ္ဍကို နောက်ဆုံးတွင် ဆုံးဖြတ်ပေးသည်။ DRP1 လှုပ်ရှားမှုကို calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) phosphorylation ဖြင့် ထိန်းညှိပြီး DRP1 ပျက်ဆီးခြင်းကို ubiquitination နှင့် SUMOylation65 ဖြင့် ထိန်းညှိသည်။ နောက်ဆုံးအနေနဲ့ DRP1 နဲ့ MFN1/2 နှစ်ခုစလုံးဟာ GTPases တွေဖြစ်တာကြောင့် လုပ်ဆောင်ချက်ဟာ mitochondria 66 မှာ GTP ထုတ်လုပ်မှုနှုန်းက လွှမ်းမိုးမှုခံရနိုင်ပါတယ်။ ဒါကြောင့် ဒီပရိုတင်းတွေရဲ့ ဖော်ပြမှုဟာ တည်ငြိမ်နေပေမယ့် မပြောင်းလဲတဲ့ ပရိုတင်းလှုပ်ရှားမှု ဒါမှမဟုတ် ဒေသအလိုက်ပြောင်းလဲမှုတွေကို ထင်ဟပ်မှာ မဟုတ်ပါဘူး67,68။ အမှန်စင်စစ်၊ ရှိပြီးသား PTM ပရိုတင်းစာရင်းတွေဟာ မကြာခဏဆိုသလို ပြင်းထန်တဲ့ ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုတွေကို ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးတဲ့ ပထမခံစစ်အဖြစ် ဆောင်ရွက်လေ့ရှိပါတယ်။ ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ မော်ဒယ်မှာ အလယ်အလတ် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဖိစီးမှုတွေ ရှိနေချိန်မှာ၊ PTM ဟာ mRNA ဒါမှမဟုတ် ပရိုတင်းအဆင့်မှာ ဒီမျိုးဗီဇတွေရဲ့ နောက်ထပ် activation မလိုအပ်ဘဲ mitochondrial integrity ကို လုံလောက်စွာ ပြန်လည်ရရှိစေဖို့ fusion နဲ့ fission ပရိုတင်းတွေရဲ့ လုပ်ဆောင်ချက်ကို တိုးမြှင့်ပေးဖွယ်ရှိပါတယ်။
အထက်ပါဒေတာများကို ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား မော်ဖိုလော်ဂျီ၏ ရှုပ်ထွေးပြီး အချိန်ပေါ်မူတည်သော ထိန်းညှိမှုနှင့် ဤယန္တရားများကို ရှင်းလင်းဖော်ပြခြင်း၏ စိန်ခေါ်မှုများကို မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။ မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုကို လေ့လာရန်အတွက်၊ လမ်းကြောင်းရှိ သီးခြားပစ်မှတ်မျိုးဗီဇများကို ဦးစွာဖော်ထုတ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာများက တူညီသောလမ်းကြောင်းရှိ မျိုးဗီဇများသည် တူညီသောဖိစီးမှုကို တူညီသောနည်းလမ်းဖြင့် မတုံ့ပြန်ကြောင်း ပြသထားသည်။ အမှန်မှာ၊ ယခင်လေ့လာမှုများက တူညီသောလမ်းကြောင်းရှိ မတူညီသော မျိုးဗီဇများသည် မတူညီသော ယာယီတုံ့ပြန်မှုပရိုဖိုင်များကို ပြသနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်30,46။ ထို့အပြင်၊ ကူးယူခြင်းနှင့် မျိုးဗီဇလုပ်ဆောင်ချက်ကြား ဆက်နွယ်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသည့် ရှုပ်ထွေးသော post-transcriptional ယန္တရားများ ရှိပါသည်။ Proteomic လေ့လာမှုများသည် PTM များနှင့် ပရိုတိန်းလုပ်ဆောင်ချက်၏ သက်ရောက်မှုကို ထိုးထွင်းသိမြင်စေနိုင်သော်လည်း၊ ၎င်းတို့သည် throughput နည်းများ၊ signal-to-noise ratios မြင့်မားခြင်းနှင့် resolution ညံ့ဖျင်းခြင်း အပါအဝင် စိန်ခေါ်မှုများကိုလည်း ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
ဤအခြေအနေတွင်၊ TEM နှင့် MEL ကိုအသုံးပြု၍ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်ဗေဒကို လေ့လာခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဒိုင်းနမစ်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ကြား ဆက်နွယ်မှုနှင့် ၎င်းသည် ရောဂါအပေါ် မည်သို့သက်ရောက်မှုရှိသည်ဆိုသည့် အခြေခံမေးခွန်းများကို ဖြေရှင်းရန် အလားအလာကောင်းများ ရှိပါသည်။ အရေးကြီးဆုံးကတော့ TEM သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုနှင့် ဒိုင်းနမစ်51 ၏ ပေါင်းစပ်အဆုံးမှတ်အဖြစ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံသဏ္ဍာန်ဗေဒကို တိုင်းတာရန် တိုက်ရိုက်နည်းလမ်းတစ်ခုကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။ MEL သည် သုံးဖက်မြင်ဆဲလ်ပတ်ဝန်းကျင်တွင် ကွဲထွက်ခြင်းနှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြစ်ရပ်များကို မြင်ယောင်ရန် တိုက်ရိုက်နည်းလမ်းတစ်ခုကိုလည်း ပံ့ပိုးပေးပြီး မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုတွင် ပြောင်းလဲမှုမရှိသည့်တိုင် ဒိုင်နမစ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပြန်လည်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းကို တိုင်းတာနိုင်စေပါသည်။ ဤနေရာတွင် ဒုတိယ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားရောဂါများတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများ၏ အသုံးဝင်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ မီးမောင်းထိုးပြထားပါသည်။ ဤရောဂါများသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပျက်စီးမှုထက် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကွန်ရက်များ၏ သိမ်မွေ့သော ပြန်လည်ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့် လက္ခဏာရပ်များရှိသော နာတာရှည် အပျော့စား ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုဖြင့် လက္ခဏာရပ်များ ရှိပါသည်။ သို့သော် နာတာရှည်ဖိစီးမှုအောက်တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လျော်ကြေးပေးခြင်းသည် နက်ရှိုင်းသော လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်များ ရှိပါသည်။ အာရုံကြောသိပ္ပံနှင့် ဆက်စပ်၍ ဤလျော်ကြေးပေးသည့် ယန္တရားများကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ နားလည်ခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသော pleiotropic neuropathology အကြောင်း အရေးကြီးသော အချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းနိုင်ပါသည်။
အဆုံးစွန်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် အာရုံကြောဆဲလ်မိုက်တိုခွန်ဒရီယာကိုထိန်းချုပ်သော မျိုးဗီဇဖော်ပြမှု၊ ပရိုတိန်းပြုပြင်မွမ်းမံမှုနှင့် ပရိုတိန်းလှုပ်ရှားမှုတို့အကြား ရှုပ်ထွေးသော အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်များကို နားလည်ရန်အတွက် ပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများ၏ အသုံးဝင်မှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။ ASD ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ အစိတ်အပိုင်းကို ထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်ရန် အာရုံကြောဆဲလ်မော်ဒယ်တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ချို့ယွင်းမှုကို ပုံစံပြုရန် PPA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ PPA ဖြင့် ကုသထားသော SH-SY5Y ဆဲလ်များသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ပုံသဏ္ဍာန်တွင် ပြောင်းလဲမှုများကို ပြသခဲ့သည်- မိုက်တိုခွန်ဒရီယာသည် သေးငယ်ပြီး လုံးဝိုင်းလာပြီး TEM ဖြင့် တွေ့ရှိသောအခါ cristae များကို ညံ့ဖျင်းစွာ သတ်မှတ်သည်။ MEL ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ဤပြောင်းလဲမှုများသည် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုအနည်းငယ်ကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာကွန်ရက်ကို ထိန်းသိမ်းရန် fission နှင့် fusion ဖြစ်ရပ်များ တိုးလာခြင်းနှင့်အတူ တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဖြစ်ပေါ်ကြောင်း ပြသသည်။ ထို့အပြင်၊ PPA သည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် homeostasis ၏ transcriptional regulation ကို သိသိသာသာ နှောင့်ယှက်သည်။ cMYC၊ NRF1၊ TFAM၊ STOML2 နှင့် OPA1 တို့ကို PPA ဖိစီးမှုကြောင့် နှောင့်ယှက်ထားသော အဓိက မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ထိန်းညှိပေးသူများအဖြစ် ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်တွင် PPA ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြောင်းလဲမှုများကို ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးရာတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်နိုင်သည်။ PPA ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုနှင့် ပရိုတင်းလှုပ်ရှားမှု၊ ဒေသအလိုက်ပြောင်းလဲမှုနှင့် ဘာသာပြန်ပြီးနောက်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများတွင် ယာယီပြောင်းလဲမှုများကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာဖော်ပြနိုင်ရန်အတွက် အနာဂတ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုကို ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးသော ထိန်းညှိပေးသည့်ယန္တရားများ၏ ရှုပ်ထွေးမှုနှင့် အပြန်အလှန်မှီခိုမှုကို မီးမောင်းထိုးပြပြီး ပိုမိုပစ်မှတ်ထားယန္တရားလေ့လာမှုများအတွက် TEM နှင့် အခြားပုံရိပ်ဖော်နည်းပညာများ၏ အသုံးဝင်မှုကို သရုပ်ပြပါသည်။
SH-SY5Y ဆဲလ်လိုင်း (ECACC, 94030304-1VL) ကို Sigma-Aldrich မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။ SH-SY5Y ဆဲလ်များကို Dulbecco ၏ ပြုပြင်ထားသော Eagle's medium/F-12 အာဟာရဓာတ် ရောစပ်ထားသော (DMEM/F-12) နှင့် L-glutamine (SC09411, ScienCell) တွင် 20% fetal bovine serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) နှင့် 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော 25 cm2 ပုလင်းများတွင် 37 °C, 5% CO2 တွင် ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ 80% confluence အထိ subcultured လုပ်ခဲ့ပြီး 300 g တွင် centrifuge လုပ်ကာ cells/ml ခန့် သိပ်သည်းဆ 7 × 105 ဖြင့် ပြားချပ်စေခဲ့သည်။ အပိုင်း ၁၉ မှ ၂၂ အထိ မခွဲခြားနိုင်သေးသော SH-SY5Y ဆဲလ်များတွင် စမ်းသပ်ချက်အားလုံးကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ PPA ကို NaP အဖြစ် ပေးပါသည်။ NaP အမှုန့် (CAS နံပါတ် 137-40-6၊ ဓာတုဗေဒဖော်မြူလာ C3H5NaO2၊ P5436-100G၊ Sigma-Aldrich) ကို နွေးသော MilliQ ရေတွင် 1 M ပြင်းအားအထိ ပျော်ဝင်စေပြီး 4°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။ ကုသသည့်နေ့တွင်၊ ဤပျော်ရည်ကို 1 M PPA ဖြင့် serum-free medium (DMEM/F-12 with L-glutamine) တွင် 3 mM နှင့် 5 mM PPA အထိ ရောစပ်ပါ။ စမ်းသပ်ချက်အားလုံးအတွက် ကုသမှုပြင်းအားများမှာ PPA မရှိပါ (0 mM၊ ထိန်းချုပ်မှု)၊ 3 mM နှင့် 5 mM PPA။ စမ်းသပ်ချက်များကို အနည်းဆုံး ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ထပ်တူပြုမှု သုံးခုတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
SH-SY5Y ဆဲလ်များကို 5.5 × 105 ဆဲလ်/ml နှုန်းဖြင့် 25 cm5 ပုလင်းများထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီး 24 နာရီကြာ ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ 24 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားခြင်းမပြုမီ PPA ကုသမှုကို ပုလင်းထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ပုံမှန်နို့တိုက်သတ္တဝါတစ်ရှူးမျိုးပွားမှုဆိုင်ရာ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများကို လိုက်နာ၍ ဆဲလ်အလုံးများကို စုဆောင်းပါ (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည်)။ ဆဲလ်အလုံးများကို 100 µl 2.5% glutaraldehyde၊ 1× PBS တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး လုပ်ငန်းစဉ်မပြီးမချင်း 4°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။ SH-SY5Y ဆဲလ်များကို ဆဲလ်များအလုံးများဖြစ်စေရန်နှင့် 2.5% glutaraldehyde၊ 1× PBS ပျော်ရည်ကို ဖယ်ရှားရန် ခေတ္တ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ ပေါင်းခံရေတွင် ပြင်ဆင်ထားသော 4% agarose ဂျယ်တွင် အနည်အနှစ်ကို ပြန်လည်ရောစပ်ပါ (agarose နှင့် အနည်အနှစ်ပမာဏအချိုးမှာ 1:1)။ Agarose အပိုင်းအစများကို ပြားချပ်ချပ်ပြားများပေါ်ရှိ grid များပေါ်တွင် ထားရှိပြီး မြင့်မားသောဖိအားဖြင့် အေးခဲစေခြင်းမပြုမီ 1-hexadecene ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။ နမူနာများကို -90°C တွင် 100% ခြောက်သွေ့သော acetone တွင် 24 နာရီကြာ အေးခဲစေခဲ့သည်။ ထို့နောက် အပူချိန်ကို -၈၀°C အထိ မြှင့်တင်ပြီး ၁% osmium tetroxide နှင့် ၀.၁% glutaraldehyde ပျော်ရည်ကို ထည့်ပါ။ နမူနာများကို -၈၀°C တွင် ၂၄ နာရီကြာ သိမ်းဆည်းထားသည်။ ထို့နောက် အပူချိန်ကို ရက်အတော်ကြာ အခန်းအပူချိန်အထိ တဖြည်းဖြည်း မြှင့်တင်ခဲ့သည်- ၂၄ နာရီကြာ -၈၀°C မှ -၅၀°C အထိ၊ ၂၄ နာရီကြာ -၃၀°C အထိ၊ ၂၄ နာရီကြာ -၁၀°C အထိ နောက်ဆုံးတွင် အခန်းအပူချိန်အထိ ရောက်ရှိခဲ့သည်။
cryogenic ပြင်ဆင်မှုပြီးနောက်၊ နမူနာများကို resin ဖြင့်စိမ်ထားပြီး Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems) ကို အသုံးပြု၍ အလွန်ပါးလွှာသော အပိုင်းများ (∼100 nm) ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အပိုင်းများကို 2% uranyl acetate နှင့် lead citrate ဖြင့် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ 200 kV (Lab6 transmitter) တွင်လည်ပတ်သော FEI Tecnai 20 transmission electron microscope (ThermoFisher (ယခင် FEI), Eindhoven, The Netherlands) နှင့် Tridiem energy filter တပ်ဆင်ထားသော Gatan CCD ကင်မရာ (Gatan, UK) ကို အသုံးပြု၍ နမူနာများကို လေ့လာခဲ့သည်။
နည်းပညာဆိုင်ရာ ပုံတူကူးယူမှုတစ်ခုစီတွင် အနည်းဆုံး single cell ပုံ ၂၄ ပုံရရှိခဲ့ပြီး စုစုပေါင်းပုံ ၂၆၆ ပုံရှိသည်။ ပုံအားလုံးကို Region of Interest (ROI) macro နှင့် Mitochondria macro ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ mitochondrial macro သည် ထုတ်ဝေထားသော methods17,31,32 ကို အခြေခံထားပြီး Fiji/ImageJ69 တွင် TEM ပုံများ၏ semi-automated batch processing ကို ခွင့်ပြုသည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင်- ပုံကို rolling ball background subtraction (60 pixel radius) နှင့် FFT bandpass filter (60 နှင့် 8 pixel upper နှင့် lower bounds အသီးသီးကို အသုံးပြု၍) နှင့် 5% ၏ orientation tolerance ဖြင့် vertical line suppression ကို အသုံးပြု၍ inverted နှင့် inverted လုပ်ထားသည်။ လုပ်ဆောင်ထားသောပုံကို maximum entropy algorithm ကို အသုံးပြု၍ အလိုအလျောက် threshold လုပ်ထားပြီး binary mask ကို ထုတ်ပေးပါသည်။ raw TEM ပုံများတွင် manually ရွေးချယ်ထားသော ROIs နှင့် ဆက်စပ်နေသော image regions များကို ထုတ်ယူခဲ့ပြီး mitochondria ကို လက္ခဏာရပ်ဖော်ပြပြီး plasma membrane နှင့် အခြား high-contrast regions များကို ဖယ်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထုတ်ယူထားသော ROI တစ်ခုစီအတွက်၊ pixel ၆၀၀ ထက်ပိုကြီးသော binary အမှုန်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး၊ အမှုန်ဧရိယာ၊ ပတ်လည်အတိုင်းအတာ၊ အဓိကနှင့် အသေးစား ဝင်ရိုးများ၊ Feret အချင်း၊ လုံးဝန်းမှုနှင့် စက်ဝိုင်းတို့ကို Fiji/ImageJ ၏ built-in တိုင်းတာမှုလုပ်ဆောင်ချက်များကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ Merrill, Flippo, and Strack (2017) ပြီးနောက်၊ ဧရိယာ ၂၊ အမှုန်ရှုထောင့်အချိုး (အဓိကမှ အသေးစားဝင်ရိုးအချိုး) နှင့် ပုံသဏ္ဍာန်အချက် (FF) တို့ကို ဤဒေတာမှ တွက်ချက်ခဲ့ပြီး FF = ပတ်လည်အတိုင်းအတာ 2/4pi x ဧရိယာဖြစ်သည်။ parametric ဖော်မြူလာ၏ အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက်ကို Merrill, Flippo, and Strack (2017) တွင် ရှာဖွေနိုင်သည်။ ဖော်ပြထားသော macros များကို GitHub တွင် ရရှိနိုင်ပါသည် (ဒေတာရရှိနိုင်မှုဖော်ပြချက်ကိုကြည့်ပါ)။ ပျမ်းမျှအားဖြင့်၊ PPA ကုသမှုတစ်ခုလျှင် အမှုန် ၅,၆၀၀ ခန့်ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး၊ စုစုပေါင်း အမှုန် ၁၇,၀၀၀ ခန့်ရှိသည် (ဒေတာမပြထားပါ)။
SH-SH5Y ဆဲလ်များကို တစ်ညလုံး ကပ်ငြိနိုင်စေရန် 8-chamber culture dishs (ThermoFisher, #155411) ထဲတွင် ထည့်ပြီး TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) နှင့် Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) တို့ဖြင့် incubation လုပ်ခဲ့သည်။ ပုံများကို 405 nm နှင့် 561 nm laser များကို အသုံးပြု၍ 10 မိနစ်ပတ်ဝန်းကျင်တွင် ရိုက်ယူခဲ့ပြီး၊ raw ပုံများကို နောက်ဆက်တွဲအချိန်အမှတ် 12 ခုတွင် image frame များအကြား 0.2 μm az step ရှိသော 10 image micrographs ပါရှိသော z-stacks အဖြစ် ရိုက်ယူခဲ့သည်။ ပုံများကို LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens ကို အသုံးပြု၍ Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolution platform (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) ကို အသုံးပြု၍ ရိုက်ယူခဲ့သည်။ ပုံရိပ်များကို ImageJ တွင် ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သော pipeline နှင့် ImageJ plugin ကို အသုံးပြု၍ fusion နှင့် fission events များ၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားဖွဲ့စည်းပုံများ၏ ပျမ်းမျှအရေအတွက်နှင့် ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် ပျမ်းမျှမိုက်တိုခွန်ဒရီးယားပမာဏကို တိုင်းတာရန် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်33။ MEL macros များကို GitHub တွင် ရရှိနိုင်ပါသည် (Data Availability Statement ကိုကြည့်ပါ)။
SH-SY5Y ဆဲလ်များကို ကုသမှုမပြုလုပ်မီ ၂၄ နာရီကြာ 0.3 × 106 cells/mL သိပ်သည်းဆဖြင့် six-well plates များတွင် ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ RNA ကို Quick-RNA™ Miniprep protocol (ZR R1055, Zymo Research) ကို အသုံးပြု၍ အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့သည်- ဖယ်ရှားခြင်းမပြုမီ well တစ်ခုစီတွင် RNA lysis buffer 300 μl ထည့်ပြီး နောက်ဆုံးအဆင့်အနေဖြင့် DNase/RNase elution 30 μl ပါဝင်သော ရေဖြင့် နမူနာတစ်ခုစီကို lyse လုပ်ခဲ့သည်။ NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer ကို အသုံးပြု၍ နမူနာအားလုံးကို ပမာဏနှင့် အရည်အသွေးကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။ ဆဲလ် lysates မှ စုစုပေါင်းပရိုတင်းကို 200 μl RIPA lysis buffer ကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့ပြီး၊ Bradford protein assay70 ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းပါဝင်မှုကို တိုင်းတာခဲ့သည်။
cDNA ပေါင်းစပ်မှုကို Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043၊ Meridian Bioscience) ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း ပြုပြင်မွမ်းမံမှုအချို့ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ cDNA ကို စုစုပေါင်း RNA ၀.၇ မှ ၁ μg အထိ အသုံးပြု၍ 20-μl ဓာတ်ပြုမှုများတွင် ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ ယခင်ထုတ်ဝေခဲ့သော စာတမ်းများ ၄၂၊ ၇၁၊ ၇၂၊ ၇၃၊ ၇၄၊ ၇၅၊ ၇၆၊ ၇၇၊ ၇၈ (ဇယား S1) မှ ပရိုင်းမာများကို ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး ပူးတွဲပါ စမ်းသပ်ကိရိယာများကို Integrated DNA Technologies မှ PrimerQuest ကိရိယာကို အသုံးပြု၍ ဒီဇိုင်းထုတ်ခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားဖွယ် မျိုးဗီဇအားလုံးကို nuclear B2M မျိုးဗီဇသို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ STOML2၊ NRF1၊ NFE2L2၊ TFAM၊ cMYC နှင့် OPA1 တို့၏ မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုကို RT-qPCR ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ မာစတာရောစပ်မှုတွင် LUNA Taq polymerase (M3003L၊ New England Biolabs)၊ 10 μM forward နှင့် reverse primers၊ cDNA နှင့် PCR-grade ရေတို့ပါဝင်ပြီး ဓာတ်ပြုမှုတစ်ခုစီအတွက် နောက်ဆုံးပမာဏ 10 μL ရရှိစေပါသည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ကွဲထွက်မှုဂျင်းများ၏ ဖော်ပြမှု (DRP1၊ MFN1/2) ကို TaqMan multiplex assays များကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S၊ New England Biolabs) ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် အသုံးပြုခဲ့သည်။ multiplex RT-qPCR မာစတာရောစပ်မှုတွင် 1X LUNA Taq polymerase၊ 10 μM forward နှင့် reverse primers၊ 10 μM probe၊ cDNA နှင့် PCR-grade ရေတို့ပါဝင်ပြီး ဓာတ်ပြုမှုတစ်ခုစီအတွက် နောက်ဆုံးပမာဏ 20 μL ရရှိစေခဲ့သည်။ RT-qPCR ကို Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—serial number: R0618110) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ လည်ပတ်မှုအခြေအနေများကို ဇယား S1 တွင် ပြသထားသည်။ cDNA နမူနာအားလုံးကို triplicate ဖြင့် ချဲ့ထွင်ခဲ့ပြီး ဆယ်ဆ dilution စီးရီးကို အသုံးပြု၍ standard curve တစ်ခုကို ထုတ်ပေးခဲ့သည်။ data reproducibility ကိုသေချာစေရန် cycle threshold standard deviation (Ct) >0.5 ရှိသော triplicate နမူနာများရှိ outliers များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်30,72။ Relative gene expression ကို 2-ΔΔCt79 နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
ပရိုတင်းနမူနာများ (60 μg) ကို Laemmli loading buffer နှင့် 2:1 အချိုးဖြင့် ရောစပ်ပြီး 12% အရောင်မဲ့ပရိုတင်းဂျယ် (Bio-Rad #1610184) တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ပရိုတင်းများကို Trans-Blot Turbo စနစ် (#170-4155၊ Bio-Rad) ကိုအသုံးပြု၍ PVDF (polyvinylidene fluoride) အမြှေးပါး (#170-84156၊ Bio-Rad) သို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ အမြှေးပါးကိုပိတ်ဆို့ပြီး သင့်လျော်သော မူလပဋိပစ္စည်းများ (OPA1၊ MFN1၊ MFN2 နှင့် DRP1) (1:1000 ရောစပ်ပြီး) ဖြင့် ၄၈ နာရီကြာ ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် ဒုတိယပဋိပစ္စည်းများ (1:10,000) ဖြင့် ၁ နာရီကြာ ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် အမြှေးပါးများကို Clarity Western ECL Substrate (#170-5061၊ Bio-Rad) ကိုအသုံးပြု၍ ရုပ်ပုံဖော်ကာ Bio-Rad ChemiDoc MP စနစ်ကိုအသုံးပြု၍ မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ Western blot ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ImageLab version 6.1 ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ မူရင်း ဂျယ်နှင့် အစက်အပြောက်ကို ပုံ S1 တွင် ပြသထားသည်။ ပဋိပစ္စည်း အချက်အလက်များကို ဇယား S2 တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။
ဒေတာအစုံများကို အနည်းဆုံး လွတ်လပ်သောနမူနာသုံးခု၏ ပျမ်းမျှနှင့် စံအမှား (SEM) အဖြစ် တင်ပြထားသည်။ Gaussian ဖြန့်ဖြူးမှုနှင့် စံသွေဖည်မှုညီမျှသည်ဟု ယူဆပြီး ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ခြင်းမပြုမီ Shapiro-Wilks စမ်းသပ်မှု (အခြားနည်းဖြင့်ဖော်ပြထားခြင်းမရှိပါက) ကို အသုံးပြု၍ ဒေတာအစုံများကို ပုံမှန်ဖြစ်မှုအတွက် စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ Fisher's MEL LSD (p < 0.05)၊ one-way ANOVA (ကုသမှု vs. ထိန်းချုပ်မှုပျမ်းမျှ) နှင့် Dunnett's multiple comparison test တို့ကို အသုံးပြု၍ ဒေတာအစုံကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအပြင် အရေးပါမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် (p < 0.05)။ သိသာထင်ရှားသော p တန်ဖိုးများကို ဂရပ်တွင် *p < 0.05၊ **p < 0.01၊ ***p < 0.001၊ ****p < 0.0001 အဖြစ် ပြသထားသည်။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများနှင့် ဂရပ်များအားလုံးကို GraphPad Prism 9.4.0 ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ပြီး ထုတ်လုပ်ထားသည်။
TEM ပုံရိပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် Fiji/ImageJ မက်ခရိုများကို GitHub- https://github.com/caaja/TEMMitoMacro တွင် အများပြည်သူရရှိနိုင်ပါသည်။ Mitochondrial Event Locator (MEL) မက်ခရိုကို GitHub- https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin တွင် အများပြည်သူရရှိနိုင်ပါသည်။
Meiliana A., Devi NM နှင့် Vijaya A. မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ: ဇီဝဖြစ်စဉ်၊ homeostasis၊ စိတ်ဖိစီးမှု၊ အိုမင်းခြင်းနှင့် epigenetics တို့၏ အဓိက ထိန်းညှိပေးသူများ။ အင်ဒိုနီးရှား။ ဇီဝဆေးပညာသိပ္ပံ။ J. 13, 221–241 (2021)။
Ben-Shachar၊ D။ စိတ်ကစဉ့်ကလျားရောဂါတွင် မျက်နှာစာများစွာရှိသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယ ချို့ယွင်းမှု၊ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ရောဂါဗေဒပစ်မှတ်အဖြစ် ရှုပ်ထွေးသော I။ စိတ်ကစဉ့်ကလျားရောဂါ။ အရင်းအမြစ်။ ၁၈၇၊ ၃–၁၀ (၂၀၁၇)။
Bose, A. နှင့် Beal, MF ပါကင်ဆန်ရောဂါတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှု။ J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK၊ Singh TG နှင့် Mehta V။ ဖိစီးမှုရှိသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား- အယ်လ်ဇိုင်းမားရောဂါတွင် ကျူးကျော်မှု၏ပစ်မှတ်များ။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယာ ၅၉၊ ၄၈–၅၇ (၂၀၂၁)။
Belenguer P.၊ Duarte JMN၊ Shook PF နှင့် Ferreira GK မိုက်တိုခွန်ဒရီယာနှင့် ဦးနှောက်- ဇီဝစွမ်းအင်နှင့် အခြားအရာများ။ အာရုံကြောဆိုင်ရာ အဆိပ်များ။ အရင်းအမြစ်။ ၃၆၊ ၂၁၉–၂၃၈ (၂၀၁၉)။
Rangaraju၊ V. et al. Pleiotropic mitochondria- အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် ရောဂါအပေါ် mitochondria ၏ သက်ရောက်မှု။ J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos၊ C. နှင့် Morais၊ VA။ အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဇီဝဖြစ်စဉ်- မည်သို့နှင့် မည်သည့်နေရာတွင်။ နိုင်ငံတကာရေးရာ။ J. Mohr။ သိပ္ပံ။ ၂၂၊ ၁၃၀၅၉ (၂၀၂၁)။
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. နှင့် Zhao, J. နို့တိုက်သတ္တဝါ မိုက်တိုခွန်ဒရီယ ဒိုင်းနမစ်ကို ထိန်းညှိခြင်း- အခွင့်အလမ်းများနှင့် စိန်ခေါ်မှုများ။ ရှေ့တန်း။ endocrine။ (Lausanne) 11, 374 (2020)။
Khacho၊ M. နှင့် Slack၊ RS အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်များ- ဖွံ့ဖြိုးဆဲဦးနှောက်မှ အရွယ်ရောက်ပြီးသူဦးနှောက်အထိ။ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု။ ဒိုင်းနမစ်။ ၂၄၇၊ ၄၇–၅၃ (၂၀၁၈)။