လက်ရှိ *လက်ရှိလိပ်စာ- ဂျာမနီနိုင်ငံ၊ Cologne 50931၊ Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD)။
မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားရောဂါများ၏ အာရုံကြောပျက်စီးခြင်းကို အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲနိုင်စွမ်းသည် အကန့်အသတ်ရှိသောကြောင့် ပြန်လည်ကောင်းမွန်လာမည်မဟုတ်ဟု ယူဆရသော်လည်း ခန္ဓာကိုယ်ရှိ အာရုံကြောဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ်၏ ဆဲလ်ကိုယ်ပိုင်အုပ်ချုပ်ခွင့်အပေါ် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကောင်းစွာနားမလည်ကြပေ။ ဤနေရာတွင်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်မှု ဒိုင်းနမစ်များ အနှောင့်အယှက်ဖြစ်ခြင်းကြောင့် OXPHOS ချို့တဲ့မှုဖြင့် Purkinje အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ဆဲလ်-သီးသန့် ပရိုတီယိုမ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ မိတ်ဆက်ပေးပါသည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုသည် ပရိုတီယိုမစ်စ်နယ်ပယ်တွင် ကြီးမားသောပြောင်းလဲမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့ပြီး နောက်ဆုံးတွင် ဆဲလ်သေဆုံးခြင်းမပြုမီ တိကျသော ဇီဝဖြစ်စဉ်အစီအစဉ်များ၏ အစဉ်လိုက် အသက်ဝင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ မမျှော်လင့်ဘဲ၊ TCA သံသရာ၏ အလယ်အလတ်ပစ္စည်းများကို ဖြည့်စွက်ပေးသည့် ပိုင်ရူဗိတ် ကာဘောက်ဆီလိတ် (PCx) နှင့် အခြားအိုမင်းရင့်ရော်မှုကို ဆန့်ကျင်သည့် အင်ဇိုင်းများ၏ ထင်ရှားသော လှုံ့ဆော်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ PCx ကို တားဆီးခြင်းသည် အောက်ဆီဒေးရှင်းဖိစီးမှုနှင့် အာရုံကြောပျက်စီးမှုကို ပိုမိုဆိုးရွားစေပြီး atherosclerosis သည် OXPHOS ချို့တဲ့သော အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် အကာအကွယ်ပေးသည့် အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ နောက်ဆုံးတွင် ယိုယွင်းပျက်စီးနေသော အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပေါင်းစပ်မှုကို ပြန်လည်ထိန်းသိမ်းခြင်းသည် ဤဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ လက္ခဏာများကို လုံးဝပြောင်းပြန်လှန်စေပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ကာကွယ်ပေးသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုကို ခံနိုင်ရည်ရှိစေသည့် ယခင်ကမသိသော လမ်းကြောင်းများကို ဖော်ထုတ်ပြီး ရောဂါ၏ နှောင်းပိုင်းအဆင့်များတွင်ပင် အာရုံကြောပျက်စီးမှုကို ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်ကြောင်း ပြသသည်။
လူသား မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ရောဂါများနှင့် ဆက်စပ်နေသော ကျယ်ပြန့်သော အာရုံကြောဆိုင်ရာ ရောဂါလက္ခဏာများက အာရုံကြောဆဲလ် စွမ်းအင် ဇီဝြဖစ်ပျက်မှုကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ အဓိက အခန်းကဏ္ဍကို အလေးပေးဖော်ပြထားသည်။ ဤရောဂါအများစုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် မျိုးရိုးဗီဇ ဖော်ပြမှု (1, 2) သို့မဟုတ် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒိုင်းနမစ်နှင့် ဆက်စပ်သော မျိုးရိုးဗီဇ ပြောင်းလဲမှုများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် DNA (mtDNA) ၏ တည်ငြိမ်မှုကို သွယ်ဝိုက်သော သက်ရောက်မှုရှိစေသည် (3, 4)။ တိရစ္ဆာန်မော်ဒယ်များတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သော လုပ်ဆောင်ချက်က ပတ်ဝန်းကျင်တစ်ရှူးများတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှုကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် ရှေးရိုးစွဲ ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများ (5-7) ကို အသက်ဝင်စေနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် ဤရှုပ်ထွေးသော ရောဂါများ၏ ရောဂါဖြစ်စဉ်ကို နက်နက်ရှိုင်းရှိုင်း နားလည်ရန်အတွက် အရေးကြီးသော အချက်အလက်များကို ပေးပါသည်။ လုံးဝဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ ဦးနှောက် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အက်ဒီနိုစင်း ထရိုင်ဖော့စဖိတ် (ATP) ထုတ်လုပ်မှု ယေဘုယျပျက်ကွက်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော သီးခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့၏ နားလည်မှုသည် အခြေခံကျပါသည် (8)၊ ရောဂါကို ကာကွယ်ရန် သို့မဟုတ် ကာကွယ်ရန် အသုံးပြုနိုင်သည့် ကုထုံးဆိုင်ရာပစ်မှတ်များကို ဖော်ထုတ်ရန် လိုအပ်ကြောင်း အလေးပေးဖော်ပြသည်။ အာရုံကြောယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို ကာကွယ်ပါ (9)။ သတင်းအချက်အလက် မရှိခြင်းမှာ အာရုံကြောဆဲလ်များသည် ပတ်ဝန်းကျင်တစ်ရှူးများ၏ ဆဲလ်အမျိုးအစားများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဇီဝဖြစ်စဉ် ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ် အလွန်ကန့်သတ်ထားသည်ဟု ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ယူဆကြသောကြောင့်ဖြစ်သည် (10)။ ဤဆဲလ်များသည် synaptic transmission ကိုမြှင့်တင်ရန်နှင့် ဒဏ်ရာနှင့်ရောဂါအခြေအနေများကိုတုံ့ပြန်ရန် အာရုံကြောဆဲလ်များသို့ metabolites များထောက်ပံ့မှုကို ညှိနှိုင်းရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သောကြောင့် ဦးနှောက်တစ်သျှူးများ၏ စိန်ခေါ်မှုရှိသောအခြေအနေများအတွက် ဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းသည် glial ဆဲလ်များအတွက်သာ ကန့်သတ်ထားသည် (11-14)။ ထို့အပြင်၊ ဦးနှောက်တစ်သျှူး၏ မွေးရာပါဆဲလ်ကွဲပြားမှုသည် သတ်မှတ်ထားသော အာရုံကြောဆဲလ်မျိုးကွဲများတွင် ဖြစ်ပေါ်သော ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများကို လေ့လာခြင်းကို အဓိကအားဖြင့် အဟန့်အတားဖြစ်စေသည်။ ရလဒ်အနေဖြင့် အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယ ချို့ယွင်းမှု၏ ဆဲလ်နှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်အတိအကျအကြောင်း အနည်းငယ်သာ သိရှိရသည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှု၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အကျိုးဆက်များကို နားလည်နိုင်ရန်အတွက်၊ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အပြင်ဘက်အမြှေးပါးပေါင်းစပ်မှု (Mfn2) ပျက်စီးခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှု၏ အဆင့်အမျိုးမျိုးတွင် Purkinje အာရုံကြောဆဲလ်များ (PNs) ကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲထုတ်ခဲ့ပါသည်။ လူသားများတွင် Mfn2 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် Charcot-Marie-Tooth အမျိုးအစား 2A (15) အဖြစ်လူသိများသော မျိုးရိုးလိုက်မော်တာအာရုံခံအာရုံကြောရောဂါပုံစံတစ်ခုနှင့် ဆက်စပ်နေသော်လည်း၊ ကြွက်များတွင် Mfn2 ၏ အခြေအနေအလိုက် ပျက်စီးခြင်းသည် အောက်ဆီဒေးရှင်း​​​ဖော့စဖော်ရီလေရှင်း (OXPHOS) ချို့ယွင်းမှုနည်းလမ်းကို လူသိများသော လှုံ့ဆော်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။ အာရုံကြောဆဲလ်မျိုးကွဲအမျိုးမျိုး (16-19) နှင့် ရလဒ်အနေဖြင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှု phenotype များသည် ရွေ့လျားမှုဆိုင်ရာရောဂါများ (18, 19) သို့မဟုတ် cerebellar ataxia (16) ကဲ့သို့သော တိုးတက်သော အာရုံကြောဆိုင်ရာ ရောဂါလက္ခဏာများဖြင့် တွဲဖက်လျက်ရှိသည်။ label-free quantitative (LFQ) proteomics၊ metabolomics၊ imaging နှင့် virological နည်းလမ်းများပေါင်းစပ်အသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ တိုးတက်သော neurodegeneration သည် pyruvate carboxylase (PCx) နှင့် PNs in vivo arteriosclerosis တွင်ပါဝင်သော အခြားအချက်များကို ပြင်းထန်စွာလှုံ့ဆော်ပေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ပြသသည်။ ဤတွေ့ရှိချက်၏သက်ဆိုင်မှုကိုအတည်ပြုရန်အတွက်၊ Mfn2 ချို့တဲ့သော PNs များတွင် PCx ၏ expression ကိုကျွန်ုပ်တို့အထူးလျှော့ချခဲ့ပြီး၊ ဤခွဲစိတ်မှုသည် oxidative stress ကိုပိုမိုဆိုးရွားစေပြီး neurodegeneration ကိုအရှိန်မြှင့်စေကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့ပြီး azoospermia သည် ဆဲလ်သေဆုံးမှုကိုဇီဝဖြစ်စဉ်အလိုက်သင့်ပြောင်းလဲနိုင်မှုကိုသက်သေပြသည်။ MFN2 ၏ပြင်းထန်သော expression သည် OXPHOS ချို့တဲ့မှု၊ mitochondrial DNA ကိုအမြောက်အမြားသုံးစွဲမှုနှင့် mitochondrial network ပျက်စီးသွားသော terminal degeneration PN ကိုလုံးဝကယ်တင်နိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် ဤ neurodegeneration ပုံစံသည် ဆဲလ်သေဆုံးမှုမတိုင်မီရောဂါ၏အဆင့်မြင့်အဆင့်တွင်ပင်ပြန်လည်ကောင်းမွန်နိုင်ကြောင်းပိုမိုအလေးပေးဖော်ပြသည်။
Mfn2 knockout PNs ရှိ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကို မြင်ယောင်နိုင်ရန်အတွက်၊ Cre-dependent mitochondria အား အဝါရောင် fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre expression ကို ပစ်မှတ်ထားနိုင်စေသည့် mouse strain ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး in vivo မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology ကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။ PNs ရှိ Mfn2 gene ပျက်စီးခြင်းသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားကွန်ရက်၏ တဖြည်းဖြည်း ကွဲပြားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေမည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S1A)၊ အစောဆုံးပြောင်းလဲမှုကို အသက် ၃ ပတ်တွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ Calbindin immunostaining ဆုံးရှုံးမှုမှ သက်သေပြသည့်အတိုင်း PN ဆဲလ်အလွှာ၏ သိသိသာသာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုသည် အသက် ၁၂ ပတ်အထိ မစတင်ခဲ့ပါ (ပုံ ၁၊ A နှင့် B)။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology တွင် အစောဆုံးပြောင်းလဲမှုများနှင့် အာရုံကြောသေဆုံးမှု၏ မြင်သာသောစတင်မှုကြား အချိန်မကိုက်ညီမှုကြောင့် ဆဲလ်သေဆုံးမှုမတိုင်မီ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် ကျွန်ုပ်တို့အား တွန်းအားပေးခဲ့သည်။ YFP (YFP+)-ဖော်ပြသော PN (ပုံ 1C) နှင့် ထိန်းချုပ်ထားသော မောက်စ်များ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ကို ခွဲထုတ်ရန် fluorescence-activated cell sorting (FACS)-အခြေခံ ဗျူဟာတစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပြီး၊ နောက်ပိုင်းတွင် CTRL (ပုံ S1B) အဖြစ် ရည်ညွှန်းပါသည်။ YFP signal ၏ relative intensity ကို အခြေခံ၍ gating ဗျူဟာကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းသည် confocal microscope ဖြင့် အတည်ပြုထားသော non-PNs (YFPneg) (ပုံ S1B) သို့မဟုတ် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော fluorescent axon/dendritic fragments (YFPlow; ပုံ S1D၊ ဘယ်ဘက်) မှ YFP+ body (YFPhigh) PNs များကို သန့်စင်နိုင်စေပါသည် (ပုံ S1D၊ ညာဘက်)။ အမျိုးအစားခွဲခြားထားသော population ၏ identity ကို အတည်ပြုရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LFQ proteomics နှင့် ထို့နောက် principal component analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး YFPhigh နှင့် YFPneg ဆဲလ်များအကြား ရှင်းလင်းသော ခွဲခြားမှုရှိကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S1C)။ YFPhigh ဆဲလ်များသည် လူသိများသော PNs markers (ဆိုလိုသည်မှာ Calb1၊ Pcp2၊ Grid2 နှင့် Itpr3) (21၊ 22) ၏ အသားတင်ကြွယ်ဝမှုကို ပြသခဲ့သော်လည်း အာရုံကြောဆဲလ်များ သို့မဟုတ် အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများတွင် အဖြစ်များသော ပရိုတင်းများ ကြွယ်ဝမှုကို မပြသခဲ့ပါ (ပုံ 1D)။ လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက်များတွင် စုဆောင်းရရှိသော အမျိုးအစားခွဲခြားထားသော YFPhigh ဆဲလ်များရှိ နမူနာများကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်ရာတွင် correlation coefficient > 0.9 ကို ပြသခဲ့ပြီး ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပုံတူပွားများအကြား ကောင်းမွန်သော ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်မှုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ S1E)။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့် ဤဒေတာသည် ဖြစ်နိုင်သော PN ၏ စူးရှပြီး သီးခြားခွဲထုတ်မှုအတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏ အစီအစဉ်ကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ အသုံးပြုထားသော L7-cre driver system သည် မွေးဖွားပြီးနောက် ပထမအပတ်တွင် mosaic recombination ကို ဖြစ်ပေါ်စေသောကြောင့် (23)၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် CTRL နှင့် conditional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) မှ ကြွက်များကို သုတ်သင်ရှင်းလင်းခဲ့သည်။ recombination ပြီးဆုံးပြီးနောက် အသက် ၄ ပတ်တွင် Mfn2cKO ဟုခေါ်သည်။ အဆုံးအမှတ်အနေနဲ့ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား အပိုင်းအစများ ထင်ရှားနေသော်လည်း PN အလွှာ မပျက်စီးသေးသည့် အသက် ၈ ပတ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ရွေးချယ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 1B နှင့် ပုံ S1A)။ စုစုပေါင်းအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် စုစုပေါင်း ပရိုတင်း ၃၀၁၃ ခုကို တွက်ချက်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတို့အနက် ၂၂% ခန့်မှာ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပရိုတီယိုမ်ကို မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားအဖြစ် အခြေခံ၍ MitoCarta 2.0 မှတ်ချက်များကို အခြေခံထားသည် (ပုံ 1E) (ပုံ 1E) (24)။ ၈ ပတ်မြောက်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သော differential gene expression analysis အရ ပရိုတင်းအားလုံး၏ ၁၀.၅% သာ သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများ ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 1F နှင့် ပုံ S1F)၊ ၎င်းအနက် ပရိုတင်း ၁၉၅ ခုသည် down-regulated ဖြစ်ပြီး ၁၂၀ ခုသည် up-regulated ဖြစ်သည် (ပုံ 1F)။ ဤဒေတာအစုံ၏ “ဆန်းသစ်သောလမ်းကြောင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု” သည် differentially expressed gene များသည် အဓိကအားဖြင့် ကန့်သတ်ထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများ အစုအဝေးနှင့် သက်ဆိုင်ကြောင်း ပြသထားသည် (ပုံ 1G) သတိပြုသင့်သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက OXPHOS နဲ့ ကယ်လ်စီယမ် အချက်ပြမှုနဲ့ ဆက်စပ်နေတဲ့ လမ်းကြောင်းတွေကို လျော့ကျစေတာက fusion-deficient PNs တွေမှာ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှု ဖြစ်ပေါ်တာကို အတည်ပြုပေမယ့်၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ် ဇီဝဖြစ်စဉ်နဲ့ အဓိကသက်ဆိုင်တဲ့ တခြားအမျိုးအစားတွေကတော့ သိသိသာသာ မြင့်တက်လာပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား PNs တွေမှာ ဖြစ်ပေါ်တဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်နဲ့ ကိုက်ညီပါတယ်။ ပြန်လည်ချိတ်ဆက်မှုကတော့ တသမတ်တည်းပါပဲ။ ချို့ယွင်းမှုပါ။
(က) CTRL နှင့် Mfn2cKO ကြွက်များ၏ cerebellar အပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြု confocal ဓာတ်ပုံများသည် PNs (calbindin၊ မီးခိုးရောင်) ၏ တိုးတက်ဆုံးရှုံးမှုကို ပြသသည်။ နျူကလိယများကို DAPI ဖြင့် တန်ပြန်ခဲ့သည်။ (ခ) (က) ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ ***P<0.001; n = ကြွက်သုံးကောင်မှ စက်ဝိုင်း ၄ မှ ၆ အထိ)။ (ဂ) စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်။ (ဃ) Purkinje (အပေါ်) နှင့် အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများအတွက် သီးသန့် markers များ၏ အပူမြေပုံ ဖြန့်ဖြူးမှု (အလယ်)။ (င) အမျိုးအစားခွဲခြားထားသော PN တွင် ဖော်ထုတ်ထားသော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပရိုတိန်းအရေအတွက်ကို ပြသသည့် Venn ပုံကြမ်း။ (စ) ၈ ပတ်တွင် Mfn2cKO အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် ကွဲပြားစွာ ဖော်ပြထားသော ပရိုတိန်းများ၏ မီးတောင်ပုံ (အရေးပါမှု cut-off တန်ဖိုး 1.3)။ (ဆ) တီထွင်ဖန်တီးမှုလမ်းကြောင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ၈ ပတ်အဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားထားသော Mfn2cKO PN တွင် အရေးကြီးဆုံး up-regulation (အနီရောင်) နှင့် down-regulation (အပြာရောင်) လမ်းကြောင်းငါးခုကို ပြသသည်။ ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော ပရိုတိန်းတစ်ခုစီ၏ ပျမ်းမျှ expression အဆင့်ကို ပြသထားသည်။ မီးခိုးရောင်အပူမြေပုံ- ချိန်ညှိထားသော P တန်ဖိုး။ ns၊ အရေးမကြီးပါ။
Proteomics အချက်အလက်များက complex I၊ III နှင့် IV တို့၏ ပရိုတိန်းဖော်ပြမှုသည် တဖြည်းဖြည်း လျော့နည်းသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ Complex I၊ III နှင့် IV အားလုံးတွင် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော mtDNA-encoded subunits များ ပါဝင်ပြီး nuclear-coded သာရှိသော complex II မှာ အခြေခံအားဖြင့် ထိခိုက်မှုမရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 2A နှင့် ပုံ S2A)။ . Proteomics ရလဒ်များနှင့်အညီ cerebellar တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ immunohistochemistry က PN ရှိ complex IV ၏ MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit အဆင့်သည် တဖြည်းဖြည်း လျော့နည်းသွားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 2B)။ mtDNA-encoded subunit Mtatp8 သည် သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသော်လည်း (ပုံ S2A)၊ nuclear-encoded ATP synthase subunit ၏ steady-state အဆင့်မှာ မပြောင်းလဲဘဲ ရှိနေခဲ့ပြီး mtDNA ဖော်ပြမှု တည်ငြိမ်သောအခါတွင် လူသိများသော တည်ငြိမ်သော ATP synthase subassembly F1 complex နှင့် ကိုက်ညီသည်။ ဖွဲ့စည်းမှုသည် တသမတ်တည်းရှိသည်။ Interrupt (7)။ အချိန်နှင့်တပြေးညီ polymerase chain reaction (qPCR) ဖြင့် စီထားသော Mfn2cKO PNs များတွင် mtDNA အဆင့်ကို အကဲဖြတ်ခြင်းက mtDNA မိတ္တူအရေအတွက် တဖြည်းဖြည်းကျဆင်းမှုကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အသက် ၈ ပတ်တွင် mtDNA အဆင့်၏ ၂၀% ခန့်သာ ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည် (ပုံ ၂C)။ ဤရလဒ်များနှင့်အညီ၊ Mfn2cKO PNs များ၏ confocal microscopy staining ကို DNA ကို ထောက်လှမ်းရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား နျူကလီယိုတိုက်များ၏ အချိန်ပေါ်မူတည်သော သုံးစွဲမှုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၂D)။ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပရိုတိန်းပျက်စီးခြင်းနှင့် ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုတွင် ပါဝင်သော Lonp1၊ Afg3l2 နှင့် Clpx နှင့် OXPHOS complex assembly factors များအပါအဝင် အချို့သောကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကိုသာ မြှင့်တင်ထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ apoptosis တွင်ပါဝင်သော ပရိုတိန်းအဆင့်များတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ S2B)။ အလားတူပင်၊ ကယ်လ်စီယမ်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးတွင်ပါဝင်သော မိုက်တိုခွန်ဒရီးယားနှင့် endoplasmic reticulum channels များတွင် အနည်းငယ်သာပြောင်းလဲမှုများရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S2C)။ ထို့အပြင်၊ autophagy နှင့်ဆက်စပ်သောပရိုတိန်းများကို အကဲဖြတ်ရာတွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိခဲ့ဘဲ၊ ၎င်းသည် immunohistochemistry နှင့် electron microscopy မှ in vivo တွင်တွေ့ရှိရသော autophagosomes များ၏ မြင်သာသော induction နှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ S3)။ သို့သော်၊ PNs ရှိ တိုးတက်သော OXPHOS ချို့ယွင်းမှုသည် ထင်ရှားသော ultrastructural mitochondrial ပြောင်းလဲမှုများပါ ၀ င်သည်။ အသက် ၅ ပတ်နှင့် ၈ ပတ်ရှိသော Mfn2cKO PNs များ၏ ဆဲလ်ကိုယ်ထည်များနှင့် dendritic သစ်ပင်များတွင် Mitochondrial clusters များကိုတွေ့မြင်နိုင်ပြီး အတွင်းပိုင်းအမြှေးပါးဖွဲ့စည်းပုံသည် ကြီးမားသောပြောင်းလဲမှုများဖြစ်ပွားခဲ့သည် (ပုံ S4၊ A နှင့် B)။ ဤ ultrastructural ပြောင်းလဲမှုများနှင့် mtDNA တွင် သိသာထင်ရှားသောကျဆင်းမှုနှင့်အညီ၊ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ဖြင့် acute cerebral cerebellar slices များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းက Mfn2cKO PNs ရှိ mitochondrial membrane potential သည် သိသိသာသာလျော့နည်းသွားကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ S4C)။
(A) OXPHOS ရှုပ်ထွေးမှု၏ ဖော်ပြမှုအဆင့်၏ အချိန်ကာလ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ P<0.05 ရှိသော ပရိုတင်းများကိုသာ ၈ ပတ်တွင် ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါ (နှစ်လမ်းသွား ANOVA)။ အစက်ချမျဉ်း- CTRL နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ချိန်ညှိမှု မရှိပါ။ (B) ဘယ်ဘက်- anti-MTCO1 antibody ဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော cerebellar အပိုင်း၏ ဥပမာတစ်ခု (စကေးဘား၊ 20 μm)။ Purkinje ဆဲလ်ကိုယ်ထည်များ နေရာယူထားသော ဧရိယာကို အဝါရောင်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။ ညာဘက်- MTCO1 အဆင့်များ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ ကြွက်သုံးကောင်မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသော n = 7 မှ 20 ဆဲလ်)။ (C) စီစဉ်ထားသော PN ရှိ mtDNA မိတ္တူနံပါတ်၏ qPCR ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ n = 3 မှ 7 ဆဲလ်)။ (D) ဘယ်ဘက်- anti-DNA antibody ဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော cerebellar အချပ်၏ ဥပမာတစ်ခု (စကေးဘား၊ 20 μm)။ Purkinje ဆဲလ်ကိုယ်ထည်များ နေရာယူထားသော ဧရိယာကို အဝါရောင်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။ ညာဘက်- mtDNA အနာများ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ n = 5 မှ 9 ဆဲလ်)။ (E) ဆဲလ်တစ်ခုလုံး patch clamp မှတ်တမ်းတင်ခြင်းတွင် mitoYFP + Purkinje ဆဲလ်များ (မြှား) ကိုပြသသည့် acute cerebellar အပိုင်း၏ ဥပမာ။ (F) IV curve ၏ ပမာဏ။ (G) CTRL နှင့် Mfn2cKO Purkinje ဆဲလ်များတွင် depolarizing current injection ၏ ကိုယ်စားပြုမှတ်တမ်းများ။ အပေါ်ဆုံး trace: AP ကို ​​လှုံ့ဆော်ပေးသော ပထမဆုံး pulse။ အောက်ဆုံး trace: အမြင့်ဆုံး AP frequency။ (H) postsynaptic spontaneous inputs (sPSPs) များ၏ ပမာဏ။ ကိုယ်စားပြုမှတ်တမ်းတင် trace နှင့် ၎င်း၏ zoom ratio ကို (I) တွင် ပြသထားသည်။ variance ၏ တစ်လမ်းသွား analysis သည် ကြွက်သုံးကောင်မှ n = 5 မှ 20 ဆဲလ်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အချက်အလက်များကို mean ± SEM အဖြစ်ဖော်ပြထားသည်။ *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001။ (J) perforated patch clamp mode ကို အသုံးပြု၍ မှတ်တမ်းတင်ထားသော spontaneous AP ၏ ကိုယ်စားပြု traces။ အပေါ်ဆုံး trace: အမြင့်ဆုံး AP frequency။ အောက်ဆုံး trace: AP တစ်ခုတည်း၏ zoom။ (K) (J) အရ ပျမ်းမျှနှင့် အမြင့်ဆုံး AP frequency ကို ပမာဏသတ်မှတ်ပါ။ Mann-Whitney စမ်းသပ်မှု; n = 5 ဆဲလ်များကို ကြွက်လေးကောင်မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ဒေတာများကို ပျမ်းမျှ ± SEM အဖြစ် ဖော်ပြထားပြီး အရေးမကြီးပါ။
၈ ပတ်သား Mfn2cKO PN တွင် OXPHOS ပျက်စီးမှုကို ထင်ရှားစွာတွေ့ရှိခဲ့ပြီး အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ဇီဝကမ္မဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်သည် ပြင်းထန်စွာ မူမမှန်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် OXPHOS ချို့တဲ့သော အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ passive electrical ဝိသေသလက္ခဏာများကို ၄ ပတ်မှ ၅ ပတ်နှင့် ၇ ပတ်မှ ၈ ပတ်တွင် cerebellar slices များတွင် whole-cell patch clamp မှတ်တမ်းများကို ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (ပုံ ၂E)။ မမျှော်လင့်ဘဲ၊ Mfn2cKO အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ပျမ်းမျှ resistance membrane potential နှင့် input resistance တို့သည် control နှင့် ဆင်တူသော်လည်း ဆဲလ်များအကြား အနည်းငယ်သော ကွာခြားချက်များရှိပါသည် (ဇယား ၁)။ အလားတူပင်၊ ၄ ပတ်မှ ၅ ပတ်သားအရွယ်တွင် current-voltage relationship (IV curve) တွင် သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ ၂F)။ သို့သော်၊ ၇ ပတ်မှ ၈ ပတ်သားအရွယ် Mfn2cKO အာရုံကြောဆဲလ်များသည် IV regimen (hyperpolarization step) ကို မကျော်ဖြတ်နိုင်ခဲ့ပါ၊ ၎င်းသည် ဤနောက်ဆုံးအဆင့်တွင် hyperpolarization potential အပေါ် ရှင်းလင်းသော sensitivity ရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနဲ့၊ Mfn2cKO အာရုံကြောဆဲလ်တွေမှာ၊ ထပ်ခါတလဲလဲ လုပ်ဆောင်ချက်အလားအလာ (AP) ထုတ်ယူမှုတွေကို ဖြစ်စေတဲ့ depolarizing current တွေကို ကောင်းကောင်းသည်းခံနိုင်ပြီး၊ သူတို့ရဲ့ ಒಟ್ಟಾರೆ ထုတ်ယူမှုပုံစံတွေဟာ ၈ ပတ်သား ထိန်းချုပ်အာရုံကြောဆဲလ်တွေနဲ့ သိသိသာသာကွာခြားမှုမရှိကြောင်း ညွှန်ပြနေပါတယ် (ဇယား ၁ နဲ့ ပုံ ၂G)။ အလားတူပဲ၊ spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) ရဲ့ ကြိမ်နှုန်းနဲ့ amplitude ဟာ ထိန်းချုပ်အုပ်စုနဲ့ နှိုင်းယှဉ်နိုင်ပြီး၊ ဖြစ်ရပ်တွေရဲ့ ကြိမ်နှုန်းဟာ ၄ ပတ်ကနေ ၅ ပတ်အထိ ၇ ပတ်ကနေ ၈ ပတ်အထိ အလားတူတိုးလာခဲ့ပါတယ် (ပုံ ၂၊ H နဲ့ I)။ PNs မှာ synaptic ရင့်ကျက်မှုကာလ (၂၅)။ perforated PNs patches တွေလုပ်ပြီးနောက် အလားတူရလဒ်တွေ ရရှိခဲ့ပါတယ်။ ဒီ configuration က whole-cell patch clamp recording မှာဖြစ်နိုင်သလို cellular ATP ချို့ယွင်းချက်တွေရဲ့ ဖြစ်နိုင်ချေရှိတဲ့ compensation ကို ကာကွယ်ပေးပါတယ်။ အထူးသဖြင့်၊ Mfn2cKO အာရုံကြောဆဲလ်တွေရဲ့ resting membrane potential နဲ့ spontaneous firing frequency ကို ထိခိုက်မှုမရှိခဲ့ပါဘူး (ပုံ ၂၊ J နဲ့ K)။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့်၊ ဤရလဒ်များသည် OXPHOS လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှုထင်ရှားသော PN များသည် မြင့်မားသောကြိမ်နှုန်းထုတ်လွှတ်မှုပုံစံများကို ကောင်းစွာကိုင်တွယ်ဖြေရှင်းနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပြီး၊ ၎င်းတို့အား ပုံမှန်နီးပါး electrophysiological တုံ့ပြန်မှုများကို ထိန်းသိမ်းနိုင်စေသည့် လျော်ကြေးပေးသည့်ယန္တရားတစ်ခုရှိကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SEM (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ Holm-Sidak's multiple comparison test; *P<0.05) အဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။ ယူနစ်နံပါတ်ကို ကွင်းစကွင်းပိတ်ဖြင့် ဖော်ပြထားသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် proteomics dataset (ပုံ 1G) ရှိ မည်သည့်အမျိုးအစားတွင်မဆို ပြင်းထန်သော OXPHOS ချို့တဲ့မှုကို တန်ပြန်နိုင်သည့် လမ်းကြောင်းများ ပါဝင်ခြင်း ရှိမရှိကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် စတင်ခဲ့ပြီး၊ ထို့ကြောင့် ထိခိုက်ခံရသော PN သည် ပုံမှန်နီးပါး electrophysiology ကို အဘယ်ကြောင့် ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည်ကို ရှင်းပြသည် (ပုံ 2၊ E မှ K)။ Proteomics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ branched chain amino acids (BCAA) ၏ catabolism တွင် ပါဝင်သော အင်ဇိုင်းများသည် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3A နှင့် ပုံ S5A)၊ နောက်ဆုံးထုတ်ကုန် acetyl-CoA (CoA) သို့မဟုတ် succinyl CoA သည် arteriosclerosis Acid (TCA) cycle ရှိ tricarboxylates များကို ဖြည့်စွက်နိုင်သည်။ BCAA transaminase 1 (BCAT1) နှင့် BCAT2 နှစ်မျိုးလုံး၏ ပါဝင်မှု မြင့်တက်လာကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ၎င်းတို့သည် α-ketoglutarate (26) မှ glutamate ကို ထုတ်လုပ်ခြင်းဖြင့် BCAA catabolism ၏ ပထမအဆင့်ကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည်။ branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) complex ကို ဖွဲ့စည်းထားသော subunits အားလုံးသည် upregulated ဖြစ်သည် (complex သည် ရလဒ် BCAA carbon skeleton ၏ နောက်ဆက်တွဲနှင့် မပြောင်းလဲနိုင်သော decarboxylation ကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည်) (ပုံ 3A နှင့် ပုံ S5A)။ သို့သော်၊ စီထားသော PN တွင် BCAA ကိုယ်တိုင်တွင် သိသာထင်ရှားသော ပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိရပါ၊ ၎င်းသည် ဤမရှိမဖြစ် အမိုင်နိုအက်ဆစ်များကို ဆဲလ်များမှ စုပ်ယူမှု တိုးလာခြင်း သို့မဟုတ် TCA cycle ကို ဖြည့်စွက်ရန် အခြားအရင်းအမြစ်များ (ဂလူးကို့စ် သို့မဟုတ် လက်တစ်အက်ဆစ်) ကို အသုံးပြုခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည် (ပုံ S5B)။ OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များသည် အသက် ၈ ပတ်တွင် glutamine decomposition နှင့် transamination လုပ်ဆောင်ချက်များလည်း တိုးလာသည်ကို ပြသခဲ့ပြီး mitochondrial enzymes glutaminase (GLS) နှင့် glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) တို့၏ အရှိန်မြှင့်ခြင်းဖြင့် ထင်ဟပ်နိုင်သည် (ပုံ 3၊ A နှင့် C)။ GLS ၏ မြင့်တက်လာမှုသည် spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL ၏ ပြောင်းလဲမှုသည် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် ၄.၅ ဆ၊ P = 0.05) တွင်သာ ကန့်သတ်ထားကြောင်း သတိပြုသင့်ပြီး ကင်ဆာတစ်ရှူးများတွင် ၎င်း၏ သီးခြား မြင့်တက်လာမှုသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ဇီဝစွမ်းအင်ကို ပံ့ပိုးပေးနိုင်သည်။ (27)။
(က) အပူမြေပုံသည် သတ်မှတ်ထားသောလမ်းကြောင်းအတွက် ပရိုတင်းအဆင့်တွင် ခေါက်ပြောင်းလဲမှုကို ၈ ပတ်တွင် ပြသထားသည်။ (ခ) anti-PCx antibody ဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော cerebellar အစိတ်၏ ဥပမာ (စကေးဘား၊ 20 μm)။ အဝါရောင်မြှားသည် Purkinje ဆဲလ်ကိုယ်ထည်ကို ညွှန်ပြသည်။ (ဂ) atherosclerosis အတွက် အရေးကြီးသောကိုယ်စားလှယ်လောင်းအဖြစ် ဖော်ထုတ်ထားသော အချိန်ကာလပရိုတင်းဖော်ပြမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (multiple t-test၊ *FDR <5%; n = 3-5 ကြွက်)။ (ဃ) အပေါ်- [1-13C]pyruvate tracer (ဆိုလိုသည်မှာ၊ PDH သို့မဟုတ် trans-arterial route မှတစ်ဆင့်) တွင်ပါရှိသော အညွှန်းတပ်ထားသော ကာဗွန်ကို ဝင်ရောက်ရန် နည်းလမ်းအမျိုးမျိုးကို ပြသသည့် schematic diagram တစ်ခု။ အောက်ခြေ- တယောဇယားသည် acute cerebellar အစိတ်များကို [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01) ဖြင့် အညွှန်းတပ်ပြီးနောက် aspartic acid၊ citric acid နှင့် malic acid အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသွားသော single-labeled carbon (M1) ရာခိုင်နှုန်းကို ပြသထားသည်။ (င) ညွှန်ပြထားသောလမ်းကြောင်း၏ ပြည့်စုံသောအချိန်သမိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ၈ ပတ်တွင် P<0.05 ရှိသော ပရိုတင်းများကိုသာ ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါ။ အစက်ချမျဉ်း- ချိန်ညှိမှုတန်ဖိုးမရှိပါ (ကွဲလွဲမှု၏ နှစ်လမ်းသွားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု; * P <0.05; *** P <0.001)။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SEM အဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် BCAA ဇီဝဖြစ်စဉ်ပျက်ယွင်းမှုသည် အဓိက မြှင့်တင်ပေးသည့် လမ်းကြောင်းများထဲမှ တစ်ခု ဖြစ်လာခဲ့သည်။ ဤအချက်က TCA လည်ပတ်မှုထဲသို့ ဝင်ရောက်သော လေဝင်လေထွက်ပမာဏသည် OXPHOS ချို့တဲ့သော PN တွင် ပြောင်းလဲသွားနိုင်ကြောင်း အခိုင်အမာ အကြံပြုထားသည်။ ၎င်းသည် အာရုံကြောဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ် ပြန်လည်ချိတ်ဆက်မှု၏ အဓိကပုံစံတစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုနိုင်ပြီး၊ ပြင်းထန်သော OXPHOS ချို့ယွင်းမှုကို ထိန်းသိမ်းနေစဉ်အတွင်း အာရုံကြောဆဲလ်ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ရှင်သန်မှုအပေါ် တိုက်ရိုက်သက်ရောက်မှုရှိနိုင်သည်။ ဤယူဆချက်နှင့်အညီ၊ အဓိက anti-atherosclerotic အင်ဇိုင်း PCx သည် မြှင့်တင်နေသည် (Mfn2cKO/CTRL သည် ၁.၅ ဆခန့် ပြောင်းလဲသည်၊ ပုံ ၃A)၊ ၎င်းသည် pyruvate ကို oxaloacetate (28) အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခြင်းကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းသည် ဦးနှောက်တစ်သျှူးတွင်ရှိသည်ဟု ယုံကြည်ရသည်။ in ဖော်ပြချက်ကို astrocytes (29၊ 30) တွင်သာ ကန့်သတ်ထားသည်။ proteomics ရလဒ်များနှင့် ကိုက်ညီစွာ၊ confocal microscopy သည် PCx ဖော်ပြချက်သည် OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များတွင် တိကျစွာနှင့် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး PCx တုံ့ပြန်မှုကို အဓိကအားဖြင့် ထိန်းချုပ်မှု၏ အနီးနားရှိ Bergmann glial ဆဲလ်များတွင်သာ ကန့်သတ်ထားသည် (ပုံ ၃B)။ PCx ၏ တွေ့ရှိရသည့် မြင့်တက်လာမှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းအရ စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် acute cerebellar slices များကို [1-13C]pyruvate tracer ဖြင့် ကုသပေးခဲ့ပါသည်။ pyruvate ကို pyruvate dehydrogenase (PDH) ဖြင့် အောက်ဆီဒေးရှင်းလုပ်သောအခါ၊ ၎င်း၏ isotope label ပျောက်ကွယ်သွားသော်လည်း၊ vascular reactions များဖြင့် pyruvate ကို metabolized လုပ်သောအခါ TCA cycle intermediates များတွင် ထည့်သွင်းထားသည် (ပုံ 3D)။ ကျွန်ုပ်တို့၏ proteomics data ကို ထောက်ခံသည့်အနေဖြင့်၊ Mfn2cKO slices များ၏ aspartic acid တွင် ဤ tracer မှ markers အများအပြားကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး citric acid နှင့် malic acid တို့သည်လည်း သိသာထင်ရှားခြင်းမရှိသော်လည်း အသင့်အတင့် လမ်းကြောင်းရှိပါသည် (ပုံ 3D)။
မိုက်တိုပါ့ခ် ကြွက်များ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ကူးယူမှုအချက် A မျိုးဗီဇ (Tfam) ကို အထူးဖျက်ဆီးသော dopamine နျူရွန်များကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ချို့ယွင်းမှုရှိသော ဒိုပါမင်း နျူရွန်များတွင် (ပုံ S6B)၊ PCx ဖော်ပြမှုသည်လည်း သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည် (31)၊ ၎င်းသည် acetone အက်ဆစ် သွေးလွှတ်ကြောကျဉ်းရောဂါကို ညွှန်ပြသည်။ ရောဂါဖြစ်ပွားမှုကို ခန္ဓာကိုယ်ရှိ အာရုံကြောဆဲလ် OXPHOS ၏ ချို့ယွင်းမှုအတွင်း ထိန်းညှိပေးသည်။ သွေးလွှတ်ကြောကျဉ်းရောဂါနှင့် ဆက်စပ်နိုင်သည့် အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် ဖော်ပြနိုင်သည့် ထူးခြားသော အင်ဇိုင်းများ (32-34) သည် OXPHOS ချို့တဲ့နေသော PN များတွင် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည်ကို သတိပြုသင့်သည်၊ ဥပမာ propionyl-CoA carboxylase (PCC-A)၊ Malonyl-CoA သည် propionyl-CoA ကို succinyl-CoA နှင့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် malic enzyme 3 (ME3) အဖြစ် ပြောင်းလဲပေးပြီး၊ ၎င်း၏ အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှာ malate မှ pyruvate ကို ပြန်လည်ရယူရန်ဖြစ်သည် (ပုံ 3၊ A နှင့် C) (33၊ 35)။ ထို့အပြင်၊ ဖော့စဖောရီလေးစ်ဖြစ်ပြီး PDH (36) ကို ပိတ်ဆို့စေသော Pdk3 အင်ဇိုင်းတွင် သိသာထင်ရှားသော တိုးလာမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ PDH သို့မဟုတ် PDH အင်ဇိုင်းရှုပ်ထွေးမှုကို အသက်ဝင်စေသော Pdp1 အင်ဇိုင်းတွင် မည်သည့်ပြောင်းလဲမှုမျှ မတွေ့ရှိရပါ (ပုံ 3A)။ Mern2cKO PNs များတွင် Ser293 ရှိ PDH ရှုပ်ထွေးမှု၏ pyruvate dehydrogenase E1 အစိတ်အပိုင်း၏ α1 subunit α (PDHE1α) subunit ၏ ဖော့စဖောရီလေးရှင်း (PDH ၏ အင်ဇိုင်းလှုပ်ရှားမှုကို ဟန့်တားသည်ဟု လူသိများသည်) သည် အဆက်မပြတ် မြှင့်တင်ပေးခဲ့သည် (ပုံ S6C) (ပုံ S6C)။ Pyruvate တွင် သွေးကြောဝင်ရောက်ခွင့် မရှိပါ။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့၊ serine နဲ့ glycine ဇီဝပေါင်းစပ်မှုရဲ့ super pathway၊ ဆက်စပ် mitochondrial folate (1C) cycle နဲ့ proline ဇီဝပေါင်းစပ်မှု (ပုံ 1G နဲ့ ပုံ S5C) တို့ဟာ activation လုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း အစီရင်ခံစာတွေအရ သိသိသာသာ မြင့်တက်လာတာကို ကျွန်တော်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ ပတ်ဝန်းကျင်တစ်ရှူးတွေဟာ mitochondrial dysfunction (5-7) နဲ့ လှုပ်ရှားနေပါတယ်။ ဒီ proteomics data တွေကို ပံ့ပိုးပေးတဲ့ Confocal analysis က OXPHOS ပျောက်ဆုံးနေတဲ့ PN မှာ အသက် ၈ ပတ်အရွယ် ကြွက်တွေရဲ့ cerebellar slices တွေကို mitochondrial folate cycle ရဲ့ အဓိက enzyme ဖြစ်တဲ့ serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) ကို ခံယူစေခဲ့တယ်လို့ ပြသခဲ့ပါတယ်။ သိသာထင်ရှားတဲ့ immune response (ပုံ S5D)။ CU-glucose-incubated acute cerebellar slices ၁၃ ခုမှာ metabolic tracing experiments တွေက serine နဲ့ proline ဇီဝပေါင်းစပ်မှု မြင့်တက်လာတာကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး carbon isoforms တွေက serine နဲ့ proline အဖြစ် flux တိုးလာတယ်ဆိုတာကို ညွှန်ပြနေပါတယ် (ပုံ S5E)။ GLS နှင့် GPT2 မှ မြှင့်တင်ပေးသော ဓာတ်ပြုမှုများသည် glutamine မှ glutamate ပေါင်းစပ်မှုနှင့် glutamate နှင့် α-ketoglutarate အကြား transamination အတွက် တာဝန်ရှိသောကြောင့်၊ ၎င်းတို့၏ မြင့်တက်လာမှုက OXPHOS ချို့တဲ့သော အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် glutamate အတွက် ဝယ်လိုအား မြင့်တက်လာကြောင်း ညွှန်ပြသည်၊ ၎င်းသည် proline ၏ biosynthesis တိုးလာမှုကို ထိန်းသိမ်းရန် ရည်ရွယ်နိုင်သည် (ပုံ S5C)။ ဤပြောင်းလဲမှုများနှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ PN-specific Mfn2cKO ကြွက်များမှ cerebellar astrocytes များ၏ proteomic analysis တစ်ခုက ဤလမ်းကြောင်းများ (antiperoxidases အားလုံးအပါအဝင်) သည် ဖော်ပြမှုတွင် သိသိသာသာ မပြောင်းလဲကြောင်း ပြသခဲ့ပြီး၊ ထို့ကြောင့် ဤဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ပြန်ညွှန်းခြင်းသည် ပြိုကွဲနေသော PN အတွက် ရွေးချယ်ကြောင်း ပြသသည် (ပုံ S6၊ D မှ G)။
အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့်၊ ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများသည် PNs တွင် သီးခြားဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများ၏ ယာယီအသက်ဝင်မှုပုံစံများကို သိသိသာသာကွဲပြားစွာ ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ပုံမှန်မဟုတ်သော အာရုံကြောဆဲလ် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် လုပ်ဆောင်ချက်သည် အစောပိုင်း atherosclerosis နှင့် 1C ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်း (ပုံ 3E နှင့် ပုံ S5C) ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး I နှင့် IV complex များ၏ ဖော်ပြမှုတွင် ကြိုတင်ခန့်မှန်းနိုင်သော ပြောင်းလဲမှုများကိုပင် ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သော်လည်း၊ serine de novo ပေါင်းစပ်မှုတွင် ပြောင်းလဲမှုများသည် နောက်ပိုင်းအဆင့်များတွင်သာ ထင်ရှားလာခဲ့သည်။ OXPHOS ချို့ယွင်းမှု (ပုံ 3E နှင့် ပုံ S5C)။ ဤတွေ့ရှိချက်များသည် ဖိစီးမှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် (1C cycle) နှင့် cytoplasmic (serine biosynthesis) တို့သည် TCA cycle တွင် atherosclerosis တိုးလာမှုနှင့် အာရုံကြောဆဲလ်ဇီဝဖြစ်စဉ်ကို ပြန်လည်ပုံဖော်ရန် synergistically တုံ့ပြန်သည့် အစဉ်လိုက်လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုကို သတ်မှတ်ပေးသည်။
၈ ပတ်သား OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များသည် မြင့်မားသောကြိမ်နှုန်းလှုံ့ဆော်မှုလုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းသိမ်းနိုင်ပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုအတွက် ပြန်လည်ဖြည့်တင်းရန်အတွက် သိသာထင်ရှားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြန်လည်ချိတ်ဆက်မှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။ ဤတွေ့ရှိချက်သည် ယခုအချိန်တွင်ပင် ဤဆဲလ်များသည် အာရုံကြောဆိုင်ရာယိုယွင်းမှုကို နှောင့်နှေးစေရန် သို့မဟုတ် ကာကွယ်ရန် ကုထုံးဆိုင်ရာကြားဝင်ဆောင်ရွက်မှုကိုလည်း ရရှိနိုင်သည်ဟူသော စိတ်ဝင်စားဖွယ်ဖြစ်နိုင်ခြေကို ပေါ်ပေါက်စေသည်။ နောက်ကျသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤဖြစ်နိုင်ခြေကို သီးခြားကြားဝင်ဆောင်ရွက်မှုနှစ်ခုဖြင့် ဖြေရှင်းခဲ့သည်။ ပထမနည်းလမ်းတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ခဲ့ပါသည်၊ ထို့ကြောင့် MFN2 ကို OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များတွင် in vivo တွင် ရွေးချယ်ဖော်ပြနိုင်သည် (ပုံ S7A)။ MFN2 ကို encoding လုပ်သော AAV နှင့် fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) ကို in vitro တွင် primary neuron cultures တွင် အတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် MFN2 ကို Cre-dependent ပုံစံဖြင့် ဖော်ပြစေပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား morphology ကို ကယ်တင်ခဲ့ပြီး Mfn2cKO အာရုံကြောများတွင် neuromutation ကို ကာကွယ်ပေးသည် (ပုံ S7၊ B၊ D နှင့် E)။ ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ၈ ပတ်သား Mfn2-AAV ကို Mfn2cKO နှင့် ထိန်းချုပ်ကြွက်များ၏ cerebellar cortex သို့ stereotactic နည်းဖြင့် ပေးပို့ရန် in vivo စမ်းသပ်မှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ၁၂ ပတ်သားကြွက်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည် (ပုံ 4A)။ ကုသထားသော Mfn2cKO ကြွက်များသည် သေဆုံးသွားခဲ့သည် (ပုံ 1၊ A နှင့် B) (16)။ in vivo တွင် ဗိုင်းရပ်စ် transduction သည် cerebellar စက်ဝိုင်းအချို့တွင် PN ၏ ရွေးချယ်ဖော်ပြမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည် (ပုံ S7၊ G နှင့် H)။ mCherry ကိုသာ ဖော်ပြသော ထိန်းချုပ် AAV ထိုးသွင်းခြင်း (Ctrl-AAV) သည် Mfn2cKO တိရစ္ဆာန်များတွင် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုအတိုင်းအတာကို သိသာထင်ရှားသော အကျိုးသက်ရောက်မှု မရှိပါ။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ Mfn2-AAV ဖြင့် transduced လုပ်ထားသော Mfn2cKOs များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် PN ဆဲလ်အလွှာ၏ သိသာထင်ရှားသော အကာအကွယ်ပေးသည့် အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 4၊ B နှင့် C)။ အထူးသဖြင့်၊ အာရုံကြောဆဲလ်သိပ်သည်းဆသည် ထိန်းချုပ်တိရစ္ဆာန်များနှင့် ခွဲခြား၍မရနိုင်ပုံရသည် (ပုံ 4၊ B နှင့် C နှင့် ပုံ S7၊ H နှင့် I)။ MFN1 ၏ ဖော်ပြမှုမဟုတ်ဘဲ MFN2 ၏ ဖော်ပြမှုသည် အာရုံကြောဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ကယ်တင်ရာတွင် တူညီစွာထိရောက်မှုရှိသည် (ပုံ 4C နှင့် ပုံ S7၊ C နှင့် F)၊ ၎င်းသည် ectopic MFN1 ၏ ဖော်ပြမှုသည် MFN2 မရှိခြင်းကို ထိရောက်စွာ ဖြည့်စွက်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ PN အဆင့်တစ်ခုတည်းတွင် နောက်ထပ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ Mfn2-AAV သည် mitochondria ၏ ultrastructure ကို အများအားဖြင့် ကယ်တင်ခဲ့ပြီး mtDNA အဆင့်များကို ပုံမှန်ဖြစ်စေပြီး anti-angiogenesis marker PCx ​​၏ မြင့်မားသော ဖော်ပြမှုကို ပြောင်းပြန်လှန်ပစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 4၊ C မှ E)။ ကယ်တင်ထားသော Mfn2cKO ကြွက်များကို အနားယူနေသော အခြေအနေတွင် မြင်သာအောင် စစ်ဆေးကြည့်လျှင် ၎င်းတို့၏ ကိုယ်ဟန်အနေအထားနှင့် မော်တာလက္ခဏာများ (လှုပ်ရှားမှု S1 မှ S3) တိုးတက်ကောင်းမွန်လာကြောင်း ပြသသည်။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ ဤစမ်းသပ်မှုများက OXPHOS တွင် အလွန်အမင်း ချို့တဲ့နေသော PN များထဲသို့ MFN2 ကို နှောင့်နှေးစွာ ပြန်လည်ထည့်သွင်းခြင်းသည် mtDNA သုံးစွဲမှုကို ပြောင်းပြန်လှန်ရန်နှင့် atherosclerosis ကို ဖြစ်ပေါ်စေရန် လုံလောက်ပြီး ထို့ကြောင့် axon ယိုယွင်းပျက်စီးခြင်းနှင့် အာရုံကြောဆဲလ်သေဆုံးမှုကို in vivo တွင် ကာကွယ်ပေးသည်။
(က) ညွှန်ပြထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်း အသက်ဝင်သောအခါ MFN2 ကို အင်ကုဒ်လုပ်သည့် AAV ထိုးသွင်းရန် စမ်းသပ်မှုအချိန်ဇယားကို ပြသသည့် ပုံစံ။ (ခ) Mfn2cKO ကြွက်များတွင် ၈ ပတ်တွင် ပြောင်းလဲပြီး anti-Calbindin antibody ဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော ၁၂ ပတ်အရွယ် cerebellar အစိတ်များ၏ ကိုယ်စားပြု confocal ပုံများ။ ညာဘက်- axon fibers များ၏ ချိန်ညှိခြင်း။ axon zoom ၏ ချိန်ညှိမှုသည် 450 နှင့် 75 μm ဖြစ်သည်။ (ဂ) ဘယ်ဘက်- AAV transduction loop (AAV+) တွင် Purkinje ဆဲလ်သိပ်သည်းဆကို ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ n = ကြွက် ၃ ကောင်)။ ညာဘက်- ၁၂ ပတ်မြောက်တွင် transduced PN တွင် mtDNA အာရုံစူးစိုက်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (unpaired t-test; ကြွက်သုံးကောင်မှ n = ဆဲလ် ၆ လုံး)။ * P <0.05; ** P <0.01။ (ဃ) ညွှန်ပြထားသော ဗိုင်းရပ်စ် vectors များဖြင့် ပြောင်းလဲထားသော Mfn2cKO cerebellar အပိုင်းများ၏ PNs များ၏ ကိုယ်စားပြု transmission electron micrographs။ ပန်းရောင်မျက်နှာဖုံးသည် dendrites များနေရာယူထားသော ဧရိယာကိုပြသပြီး အဝါရောင်အစက်ချစတုရန်းသည် ညာဘက်တွင်ပေးထားသော zoom ကိုဖော်ပြသည်။ n သည် nucleus ကိုကိုယ်စားပြုသည်။ Scale bar၊ 1μm။ (E) သည် 12 ပတ်တွင် transduced PN တွင် PCx staining ၏ဥပမာတစ်ခုကိုပြသသည်။ Scale bar၊ 20μm။ OE၊ overexpression၊ FC၊ fold change။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့ OXPHOS လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းမှုရှိတဲ့ PN တွေမှာ peroxidase ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာတဲ့ ဆဲလ်ရှင်သန်မှုရဲ့ အရေးပါမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါတယ်။ မောက်စ် PCx mRNA (AAV-shPCx) ကို အထူးပစ်မှတ်ထားတဲ့ mCherry encoding AAV-shRNA (short hairpin RNA) ကို ကျွန်ုပ်တို့ ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး Mfn2cKO မောက်စ်တွေရဲ့ cerebellum ထဲကို ဗိုင်းရပ်စ် ဒါမှမဟုတ် ၎င်းရဲ့ scrambled control (AAV-scr) ကို ထိုးသွင်းခဲ့ပါတယ်။ PCx expression မြင့်တက်လာပြီး PN ဆဲလ်အလွှာ မပျက်စီးသေးတဲ့ကာလအတွင်း (ပုံ 1A) ထိရောက်တဲ့ PCx knockdown ရရှိစေဖို့အတွက် အသက်ရဲ့ စတုတ္ထပတ်မှာ ထိုးသွင်းခဲ့ပါတယ် (ပုံ 5A)။ PCx ကို ပြုတ်ကျစေတာ (ပုံ S8A) က ကူးစက်ခံရတဲ့ ring မှာပဲ ကန့်သတ်ထားတယ်ဆိုတာ သတိပြုသင့်ပါတယ် (ပုံ 5၊ B နဲ့ C)။ PCx မြင့်တက်လာခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အကျိုးသက်ရောက်မှုများ၏ ယန္တရားကို နားလည်ရန်အတွက်၊ PCx knockdown နှင့် AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 တို့ကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဖော်ပြပြီးနောက် PNs များ၏ redox status ကို ကျွန်ုပ်တို့ လေ့လာခဲ့သည် (ပုံ S8၊ B မှ D)။ peptide redox potential ၏ relative change (38)။ ထို့နောက်၊ FLIM အခြေအနေများကို အတည်ပြုပြီးနောက် cytoplasmic redox status တွင် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ပြောင်းလဲမှုများကို ထောက်လှမ်းရန် ၇ ပတ်သား Mfn2cKO သို့မဟုတ် control littermates များ၏ acute brain slices များတွင် two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ S8၊ E မှ G)။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် PCx expression မရှိသော single Mfn2cKO PNs များ၏ oxidation state တွင် သိသာထင်ရှားသော တိုးလာမှုကို ပြသခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် control neurons သို့မဟုတ် scrambled shRNA ကိုသာ ဖော်ပြသော Mfn2cKO PNs များနှင့် မတူပါ (ပုံ 5၊ D နှင့် E)။ PCx ဖော်ပြမှုကို လျှော့ချလိုက်သောအခါ၊ အောက်ဆီဒိုက်ဓာတ် မြင့်မားစွာပါဝင်သည့် အခြေအနေတွင် ပြသနေသော Mfn2cKO PN များ၏ ရာခိုင်နှုန်းသည် သုံးဆထက်ပို၍ တိုးလာသည် (ပုံ 5E)၊ ၎င်းသည် PCx မြှင့်တင်မှုသည် ယိုယွင်းနေသော အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ အောက်ဆီဒိုက်ဓာတ် လျော့ချနိုင်စွမ်းကို ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
(က) ညွှန်ပြထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်း အသက်ဝင်သောအခါ shPCx ကို အင်ကုဒ်လုပ်သည့် AAV ထိုးသွင်းရန် စမ်းသပ်မှုအချိန်ဇယားကို ပြသသည့် ပုံစံ။ (ခ) Mfn2cKO ကြွက်များတွင် အသက် ၈ ပတ်အရွယ် cerebellar အပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြု confocal ဓာတ်ပုံများကို ၄ ပတ်တွင် anti-calcineurin antibody ဖြင့် ပြောင်းလဲပြီး အညွှန်းတပ်ထားသည်။ Scale bar၊ 450μm။ (ဂ) AAV-transduced loops များတွင် Purkinje ဆဲလ်သိပ်သည်းဆကို ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ကွဲလွဲမှု၏ တစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ n = ကြွက် ၃ ကောင်မှ ၄ ကောင်)။ အချက်အလက်များကို mean ± SEM အဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။ ***P<0.001။ (ဃ) ကိုယ်စားပြု FLIM ပုံသည် သတ်မှတ်ထားသော စမ်းသပ်မှုအခြေအနေများအောက်တွင် အသက် ၇ ပတ်အရွယ် PN ကို ဖော်ပြသည့် glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 ၏ ပျမ်းမျှသက်တမ်းကို ပြသထားသည်။ LUT (ရှာဖွေဇယား) အချိုး: ရှင်သန်ချိန်ကြားကာလ (picoseconds ဖြင့်)။ Scale bar၊ 25μm။ (E) ဟစ်စတိုဂရမ်သည် (D) (အခြေအနေတစ်ခုစီအောက်တွင် ကြွက်နှစ်ကောင်တွင် n=158 မှ ဆဲလ် 368 အထိ) Grx1-roGFP2 သက်တမ်းတန်ဖိုးများ၏ ဖြန့်ဖြူးမှုကို ပြသထားသည်။ ဟစ်စတိုဂရမ်တစ်ခုစီအထက်ရှိ စက်ဝိုင်းဇယားသည် CTRL-AAV-scr တွင် ပျမ်းမျှသက်တမ်းတန်ဖိုး၏ 1 SD ထက်ကျော်လွန်သော သိသိသာသာရှည်သော (အနီရောင်၊ အောက်ဆီဒေးရှင်း) သို့မဟုတ် ပိုတိုသော (အပြာရောင်၊ လျော့နည်းသော) သက်တမ်းတန်ဖိုးများရှိသော ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ပြသထားသည်။ (F) အဆိုပြုထားသော မော်ဒယ်သည် အာရုံကြောဆဲလ် PCx မြင့်တက်လာခြင်း၏ အကာအကွယ်ပေးသည့် အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပြသထားသည်။
အားလုံးကို ခြုံငုံကြည့်လျှင် ကျွန်ုပ်တို့ ဤနေရာတွင် ပေးထားသော အချက်အလက်များအရ MFN2 ၏ ပြန်လည်ဖော်ပြမှုသည် ပြင်းထန်သော OXPHOS ချို့တဲ့မှု၊ ပြင်းထန်သော mtDNA ယိုယွင်းမှုနှင့် အလွန်ပုံမှန်မဟုတ်သော ista-like morphology ရှိသော အဆင့်မြင့် PN ကို လုံးဝကယ်တင်နိုင်ကြောင်း ပြသထားပြီး၊ ထို့ကြောင့် အဆင့်မြင့်ရောဂါများတွင်ပင် စဉ်ဆက်မပြတ်တိုးတက်မှုကို ပေးစွမ်းသည်။ အာရုံကြောယိုယွင်းပျက်စီးမှုသည် ဆဲလ်သေဆုံးမှုမတိုင်မီအဆင့်၏ ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်သော အထောက်အထားကို ပေးစွမ်းသည်။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိမှု၏ ဤအတိုင်းအတာကို အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ atherosclerosis (TCA cycle ၏ ပြန်လည်ချိတ်ဆက်ခြင်း) ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်စွမ်းဖြင့် ပိုမိုအလေးပေးဖော်ပြထားပြီး ၎င်းသည် OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များတွင် PCx ဖော်ပြမှုကို ဟန့်တားပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို မြှင့်တင်ပေးပြီး အကာအကွယ်ပေးသည့် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည် (ပုံ 5F)။
ဤလေ့လာမှုတွင်၊ OXPHOS ကမောက်ကမဖြစ်မှုအပေါ် PN များ၏တုံ့ပြန်မှုသည် ဇီဝဖြစ်စဉ်အစီအစဉ်များမှ အသက်ဝင်သော differential activation pathway မှတစ်ဆင့် TCA cycle atherosclerosis သို့ တဖြည်းဖြည်းပေါင်းစည်းသွားကြောင်း သက်သေအထောက်အထားများကို ကျွန်ုပ်တို့ပေးခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဖြည့်စွက်နည်းလမ်းများစွာဖြင့် proteomic analysis ကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး ပြင်းထန်သော mitochondrial ကမောက်ကမဖြစ်မှုဖြင့် စိန်ခေါ်ခံရသောအခါ၊ အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် ယခင်ကမသိသော ဇီဝဖြစ်စဉ် elasticity ပုံစံရှိကြောင်း ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ အံ့အားသင့်စရာကောင်းသည်မှာ၊ ပြန်လည်ချိတ်ဆက်မှုလုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုလုံးသည် အာရုံကြောပျက်စီးမှုနှင့်အတူ တဖြည်းဖြည်းနှင့် မပြောင်းလဲနိုင်သော နောက်ဆုံးဇီဝဖြစ်စဉ်အခြေအနေကို မှတ်သားထားခြင်းမဟုတ်သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာက ဆဲလ်သေဆုံးမှုမတိုင်မီအဆင့်တွင်ပင် ၎င်းသည် ထိန်းသိမ်းမှုအာရုံကြောဆဲလ်တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ Functional compensation mechanism။ ဤတွေ့ရှိချက်က အာရုံကြောဆဲလ်များတွင် ခန္ဓာကိုယ်တွင် ဇီဝဖြစ်စဉ် plasticity သိသိသာသာရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဤအချက်သည် MFN2 ကို နောက်ပိုင်းတွင် ပြန်လည်မိတ်ဆက်ခြင်းသည် အဓိကဇီဝဖြစ်စဉ်အမှတ်အသားများ၏ ဖော်ပြမှုကို ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်ပြီး PN ယိုယွင်းမှုကို ကာကွယ်ပေးနိုင်ကြောင်း သက်သေပြသည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ ၎င်းသည် atherosclerosis ကို တားဆီးပေးပြီး အာရုံကြောများကို အရှိန်မြှင့်ပေးသည်။ transsexual။
ကျွန်ုပ်တို့၏ သုတေသနတွင် အစိတ်ဝင်စားဖွယ်အကောင်းဆုံး တွေ့ရှိချက်တစ်ခုမှာ OXPHOS ချို့တဲ့သော PN များသည် သွေးလွှတ်ကြောကျဉ်းရောဂါကို အထူးလှုံ့ဆော်ပေးသည့် အင်ဇိုင်းများကို မြှင့်တင်ခြင်းဖြင့် TCA သံသရာဇီဝြဖစ်ပျက်မှုကို ပြုပြင်နိုင်သည်။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြန်လည်စီစဉ်ခြင်းသည် ကင်ဆာဆဲလ်များ၏ အဖြစ်များသော အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့အချို့သည် လျှော့ချပေးသော equivalent များထုတ်လုပ်ရန် TCA သံသရာအလယ်အလတ်များကို ဖြည့်စွက်ရန် glutamine ကို အားကိုးနေရပြီး အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ကွင်းဆက်ကို မောင်းနှင်ပြီး lipid နှင့် nucleotide biosynthesis precursors များထုတ်လုပ်မှုကို ထိန်းသိမ်းပေးသည် (39၊ 40)။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုတစ်ခုအရ OXPHOS ကမောက်ကမဖြစ်မှုကို ကြုံတွေ့နေရသော peripheral တစ်ရှူးများတွင် glutamine/glutamate ဇီဝြဖစ်ပျက်မှု ပြန်လည်ချိတ်ဆက်ခြင်းသည်လည်း ထင်ရှားသော အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (5၊ 41)။ TCA သံသရာထဲသို့ glutamine ဝင်ရောက်မှု ဦးတည်ချက်သည် OXPHOS ဒဏ်ရာ၏ ပြင်းထန်မှုကြောင့် မူတည်သည် (41)။ သို့သော် ခန္ဓာကိုယ်ရှိ neuronal metabolic plasticity ၏ ဆင်တူမှုနှင့် ရောဂါအခြေအနေတွင် ၎င်း၏ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ဆက်စပ်မှုအပေါ် ရှင်းလင်းသော အထောက်အထားများ မရှိပါ။ မကြာသေးမီက in vitro လေ့လာမှုတစ်ခုတွင် primary cortical neurons များသည် neurotransmission အတွက် glutamate pool များကို လှုံ့ဆော်ပေးကြောင်း ပြသထားပြီး ထို့ကြောင့် metabolic stress အခြေအနေများအောက်တွင် oxidative metabolism နှင့် atherosclerosis ကို မြှင့်တင်ပေးသည် (42)။ TCA cycle enzyme succinate dehydrogenase ၏ ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ တားဆီးမှုအောက်တွင်၊ pyruvate carboxylation သည် cultured cerebellar granule neurons (34) တွင် oxaloacetate ၏ ပေါင်းစပ်မှုကို ထိန်းသိမ်းပေးသည်ဟု ယုံကြည်ရကြောင်း သတိပြုသင့်သည် ()။ သို့သော်၊ ဤယန္တရားများ၏ ဦးနှောက်တစ်သျှူးနှင့် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ဆက်စပ်မှု (atherosclerosis သည် အဓိကအားဖြင့် astrocytes များတွင်သာ ကန့်သတ်ထားသည်ဟု ယုံကြည်ရသည့်နေရာ) သည် အရေးကြီးသော ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ အရေးပါမှု ရှိနေဆဲဖြစ်သည် (43)။ ဤကိစ္စတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ အချက်အလက်များက ခန္ဓာကိုယ်တွင် OXPHOS ကြောင့် ပျက်စီးသွားသော PN များကို BCAA degradation နှင့် pyruvate carboxylation သို့ ပြောင်းလဲနိုင်ကြောင်း ပြသထားပြီး၊ ၎င်းတို့သည် TCA pool intermediates များကို ဖြည့်စွက်ခြင်း၏ အဓိကရင်းမြစ်နှစ်ခုဖြစ်သည်။ BCAA catabolism ၏ neurotransmission အတွက် glutamate နှင့် GABA ၏ အခန်းကဏ္ဍအပြင်၊ in vivo တွင် ဤယန္တရားများအတွက် အထောက်အထား မရှိသေးပါ။ ထို့ကြောင့်၊ atherosclerosis တိုးပွားလာခြင်းဖြင့် assimilation လုပ်ငန်းစဉ်ကြောင့် မောင်းနှင်သော TCA intermediates များ စားသုံးမှုအတွက် အလိုအလျောက် ပြန်လည်ဖြည့်တင်းပေးနိုင်သည်ဟု ယူဆရန် လွယ်ကူပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ aspartic acid အတွက် চাহিদာ မြင့်တက်လာမှုကို ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် PCx မြှင့်တင်ရန် လိုအပ်နိုင်ပြီး၊ ၎င်းကို mitochondrial dysfunction ရှိသော proliferating cells (45) တွင် အကြံပြုထားသည်။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ metabolimomics analysis တွင် Mfn2cKO PNs ရှိ aspartic acid ၏ steady-state level တွင် သိသာထင်ရှားသောပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ S6A)၊ ၎င်းသည် proliferating cells များနှင့် post-mitotic neurons များအကြား aspartic acid ၏ metabolic အသုံးချမှုကွဲပြားမှုကို ထင်ဟပ်စေသည်ဟု ယူဆရသည်။ in vivo တွင် dysfunctional neurons များတွင် PCx မြှင့်တင်ခြင်း၏ တိကျသောယန္တရားကို ဖော်ထုတ်ရန် ကျန်ရှိနေသေးသော်လည်း၊ ဤစောစီးစွာတုံ့ပြန်မှုသည် neurons များ၏ redox state ကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသခဲ့ပြီး၊ ၎င်းကို cerebellar slices များအပေါ် FLIM စမ်းသပ်ချက်များတွင် သရုပ်ပြခဲ့သည်။ အထူးသဖြင့်၊ PNs များသည် PCx မြှင့်တင်ခြင်းမှ ကာကွယ်ခြင်းသည် ပိုမို oxidized state ကို ဖြစ်စေပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို အရှိန်မြှင့်နိုင်သည်။ BCAA degradation ကို အသက်ဝင်စေခြင်းနှင့် pyruvate ၏ carboxylation သည် mitochondrial dysfunction ၏ peripheral tissue များကို ဖော်ထုတ်ရန် နည်းလမ်းများမဟုတ်ပါ (7)။ ထို့ကြောင့်၊ ၎င်းတို့သည် OXPHOS ချို့တဲ့သော အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ဦးစားပေးအင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ပုံရပြီး၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုအတွက် အရေးကြီးသော တစ်ခုတည်းသော အင်္ဂါရပ်မဟုတ်လျှင်ပင်။
Cerebellar ရောဂါသည် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုရောဂါ အမျိုးအစား တစ်မျိုးဖြစ်ပြီး ataxia အဖြစ် ပေါ်လာလေ့ရှိပြီး PN များကို မကြာခဏ ပျက်စီးစေလေ့ရှိသည် (46)။ ဤအာရုံကြောဆဲလ်လူဦးရေသည် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုအတွက် အထူးထိခိုက်လွယ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ကြွက်များတွင် ၎င်းတို့၏ ရွေးချယ်ထားသော ယိုယွင်းမှုသည် လူသား spinocerebellar ataxia ကို လက္ခဏာရပ်ပြသော မော်တာလက္ခဏာများစွာကို ပြန်လည်ဖြစ်ပေါ်စေရန် လုံလောက်သောကြောင့်ဖြစ်သည် (16၊ 47၊ 48)။ အစီရင်ခံစာများအရ မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုရှိသော transgenic မောက်စ်မော်ဒယ်သည် လူသား spinocerebellar ataxia နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုရှိသည် (49၊ 50)၊ PNPH တွင် OXPHOS ချို့တဲ့မှု၏ အကျိုးဆက်များကို လေ့လာခြင်း၏ အရေးပါမှုကို အလေးပေးဖော်ပြသည်။ ထို့ကြောင့် ဤထူးခြားသော အာရုံကြောဆဲလ်လူဦးရေကို ထိထိရောက်ရောက် ခွဲထုတ်လေ့လာရန် အထူးသင့်လျော်ပါသည်။ သို့သော် PN များသည် ဖိအားကို အလွန်ထိခိုက်လွယ်ပြီး cerebellar ဆဲလ်လူဦးရေတစ်ခုလုံး၏ အချိုးအစားနည်းပါးသောကြောင့် omics-based လေ့လာမှုများစွာအတွက် ၎င်းတို့ကို ဆဲလ်တစ်ခုလုံးအဖြစ် ရွေးချယ်ခွဲထုတ်ခြင်းသည် စိန်ခေါ်မှုတစ်ရပ်အဖြစ် ရှိနေဆဲဖြစ်သည်။ အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများ (အထူးသဖြင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူတစ်ရှူးများ) ညစ်ညမ်းမှု လုံးဝကင်းစင်ရန် မဖြစ်နိုင်သလောက်ဖြစ်သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် downstream proteomics analysis အတွက် လုံလောက်သော အသက်ရှင်နိုင်သော neurons အရေအတွက်ရရှိရန် FACS နှင့် ထိရောက်သော dissociation အဆင့်ကို ပေါင်းစပ်ထားပြီး cerebellum တစ်ခုလုံး၏ လက်ရှိဒေတာအစုံ (51) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပရိုတင်းလွှမ်းခြုံမှု အလွန်မြင့်မားသည် (ပရိုတင်း ၃၀၀၀ ခန့်)။ ဆဲလ်တစ်ခုလုံး၏ အသက်ရှင်နိုင်မှုကို ထိန်းသိမ်းခြင်းဖြင့်၊ ဤနေရာတွင် ကျွန်ုပ်တို့ပေးသောနည်းလမ်းသည် mitochondria ရှိ ဇီဝဖြစ်စဉ်လမ်းကြောင်းများတွင် ပြောင်းလဲမှုများကို စစ်ဆေးရုံသာမက ၎င်း၏ cytoplasmic counterparts များတွင် ပြောင်းလဲမှုများကိုပါ စစ်ဆေးနိုင်စေပြီး၊ ၎င်းသည် ဆဲလ်အမျိုးအစားကို ကြွယ်ဝစေရန် mitochondrial membrane tags များအသုံးပြုမှုကို ဖြည့်စွက်ပေးသည်။ ရှုပ်ထွေးသောတစ်ရှူးများတွင် mitochondrial အရေအတွက်အတွက် နည်းလမ်းအသစ် (52၊ 53)။ ကျွန်ုပ်တို့ဖော်ပြသောနည်းလမ်းသည် Purkinje ဆဲလ်များကို လေ့လာခြင်းနှင့်သာ သက်ဆိုင်သည်မဟုတ်ဘဲ၊ mitochondrial dysfunction ၏ အခြားမော်ဒယ်များအပါအဝင် ရောဂါရှိသော ဦးနှောက်တွင် ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုများကို ဖြေရှင်းရန် မည်သည့်ဆဲလ်အမျိုးအစားတွင်မဆို အလွယ်တကူအသုံးချနိုင်သည်။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့၊ ဆဲလ်ဖိစီးမှုရဲ့ အဓိကလက္ခဏာတွေကို လုံးဝပြောင်းပြန်လှန်ပြီး အာရုံကြောဆဲလ်ယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို ကာကွယ်ပေးနိုင်တဲ့ ဒီဇီဝဖြစ်စဉ်ပြန်လည်စီစဉ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း ကုထုံးဆိုင်ရာပြတင်းပေါက်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပါတယ်။ ဒါကြောင့် ဒီမှာဖော်ပြထားတဲ့ ပြန်လည်ဝါယာကြိုးချိတ်ဆက်မှုရဲ့ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ သက်ရောက်မှုတွေကို နားလည်ခြင်းက မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ချို့ယွင်းမှုကာလအတွင်း အာရုံကြောဆဲလ်များ အသက်ရှင်နိုင်မှုကို ထိန်းသိမ်းဖို့အတွက် ဖြစ်နိုင်ချေရှိတဲ့ ကုသမှုတွေအတွက် အခြေခံကျကျ ထိုးထွင်းသိမြင်မှုတွေကို ပေးစွမ်းနိုင်ပါတယ်။ ဒီမူဟာ တခြားအာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါတွေမှာ အသုံးချနိုင်မှုကို အပြည့်အဝဖော်ထုတ်ဖို့အတွက် တခြားဦးနှောက်ဆဲလ်အမျိုးအစားတွေမှာ စွမ်းအင်ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲမှုတွေကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာဖို့ ရည်ရွယ်တဲ့ အနာဂတ်သုတေသန လိုအပ်နေပါတယ်။
MitoPark ကြွက်များကို ယခင်က ဖော်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည် (31)။ loxP နှင့် Mfn2 မျိုးဗီဇများကို ဘေးချင်းယှဉ်ထားသော C57BL/6N ကြွက်များကို ယခင်က ဖော်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်သည် (18) နှင့် L7-Cre ကြွက်များနှင့် ရောနှောခဲ့သည် (23)။ ရလဒ်အနေဖြင့် double heterozygous မျိုးဆက်များကို homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP ကြွက်များနှင့် ရောနှောခဲ့ပြီး Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) အတွက် Purkinje-specific gene knockouts များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ မိတ်လိုက်ခြင်း၏ အစုအဖွဲ့တစ်ခုတွင်၊ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) ကို နောက်ထပ် ရောနှောမှုများမှတစ်ဆင့် မိတ်ဆက်ခဲ့သည် (20)။ တိရစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို ဥရောပ၊ အမျိုးသားနှင့် အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာ လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး ဂျာမနီနိုင်ငံ၊ မြောက် Rhine-Westphalia၊ Umwelt နှင့် Verbraucherschutz မှ LandesamtfürNatur မှ အတည်ပြုခဲ့သည်။ တိရစ္ဆာန်လုပ်ငန်းသည် ဥရောပ ဓာတ်ခွဲခန်း တိရစ္ဆာန်သိပ္ပံအသင်းအဖွဲ့များ၏ လမ်းညွှန်ချက်ကိုလည်း လိုက်နာသည်။
ကိုယ်ဝန်ဆောင်အမျိုးသမီး၏ သားအိမ်ခေါင်းနေရာလွဲသွားခြင်းကို မေ့ဆေးပေးပြီးနောက်၊ မောက်စ်သန္ဓေသားကို ခွဲထုတ်လိုက်သည် (E13)။ သားအိမ်ခေါင်းကို Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ဖြင့် ခွဲစိတ်ပြီး papain (20 U/ml) နှင့် cysteine ​​(1μg/ml) ပါဝင်သော Dulbecco's Modified Eagle's Medium သို့ ပေးပို့ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးကို DMEM) တွင် မွေးမြူပြီး အင်ဇိုင်းဖြင့် အစာချေဖျက်ခြင်းဖြင့် ခွဲထုတ်လိုက်သည်။ Ml) ကို ၃၇°C တွင် မိနစ် ၂၀ ကြာအောင် ထားပြီးနောက် ၁၀% fetal bovine serum ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော DMEM တွင် စက်ဖြင့် ကြိတ်ခွဲခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို polylysine ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော ဖန်အဖုံးများပေါ်တွင် 6 cm ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်လျှင် 2×106 သိပ်သည်းဆ သို့မဟုတ် 0.5×105 cells/cm2 သိပ်သည်းဆဖြင့် ပုံရိပ်ဖော်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် စိုက်ခဲ့သည်။ ၄ နာရီအကြာတွင်၊ သားအိမ်ခေါင်းကို 1% B27 ဖြည့်စွက်စာနှင့် 0.5 mM GlutaMax ပါဝင်သော Neurobasal serum-free medium ဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ ထို့နောက် စမ်းသပ်မှုတစ်လျှောက်လုံး အာရုံကြောဆဲလ်များကို ၃၇°C နှင့် ၅% CO2 တွင်ထိန်းသိမ်းထားပြီး တစ်ပတ်လျှင်တစ်ကြိမ်ကျွေးမွေးခဲ့သည်။ in vitro တွင် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်မှုကိုဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက်၊ in vitro တွင်ဒုတိယနေ့တွင် အောက်ပါ AAV9 ဗိုင်းရပ်စ်ဗက်တာ၏ ၃μl (၂၄-well culture dish) သို့မဟုတ် ၀.၅μl (၂၄-well plate) ကို အာရုံကြောဆဲလ်များကိုကုသရန်အသုံးပြုခဲ့သည်- AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, catalog number 105530-AAV9) နှင့် AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catalog number 105545-AAV9)။
မောက်စ် Mfn1 နှင့် Mfn2 ဖြည့်စွက် DNA (Addgene plasmid #23212 နှင့် #23213 အသီးသီးမှရရှိသည်) ကို C-terminus တွင် V5 sequence (GKPIPNPLLGLDST) ဖြင့်မှတ်သားထားပြီး T2A sequence မှတစ်ဆင့် frame တွင် mCherry နှင့်ပေါင်းစပ်ထားသည်။ Grx1-roGFP2 သည် Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) မှလက်ဆောင်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ရိုးရာ cloning နည်းလမ်းများကိုအသုံးပြု၍ tdTomato cassette ကိုအစားထိုးခြင်းဖြင့်၊ cassette ကို pAAV-CAG-FLEX-tdTomato backbone (Addgene reference number 28306) ထဲသို့ subcloned လုပ်ကာ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5၊ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 နှင့် pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vectors များကိုထုတ်လုပ်သည်။ control vector pAAV-CAG-FLEX-mCherry ကိုထုတ်လုပ်ရန် အလားတူဗျူဟာကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ AAV-shPCx တည်ဆောက်မှုကိုထုတ်လုပ်ရန်အတွက် plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) လိုအပ်ပြီး၊ ၎င်းတွင် shRNA ကိုပစ်မှတ်ထားသော mouse PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ကို encoding လုပ်သည့် DNA sequence ပါရှိသည်။ U6 promoter ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် mCherry ကို CMV promoter ၏ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင်အသုံးပြုသည်။ အရန် AAV vectors များထုတ်လုပ်ခြင်းကို ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်များ (Cell Biolabs) အရဆောင်ရွက်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)၊ mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) တို့ကို ယာယီသယ်ဆောင်သည့် transfer plasmid ကိုသုံးပါ။ 293AAV ဆဲလ်များ-T2A-MFN1-V5)၊ mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) သို့မဟုတ် Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) coding gene များကို transfection လုပ်ခြင်းအပြင် AAV1 capsid protein နှင့် accessory protein Packaging plasmid plasmid ကို calcium phosphate နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ coding လုပ်ပါသည်။ crude virus supernatant ကို dry ice/ethanol bath တွင် freeze-thaw cycles ဖြင့်ရရှိခဲ့ပြီး phosphate buffered saline (PBS) တွင် lysed cells များဖြင့်ရရှိခဲ့သည်။ AAV vector ကို discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (32,000 rpm နှင့် 4°C တွင် 24 နာရီ) ဖြင့် သန့်စင်ပြီး Amicon ultra-15 centrifugal filter ကို အသုံးပြု၍ စုစည်းခဲ့သည်။ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genome copy (GC)/ml]၊ AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)၊ AAV1-CAG-FLEX တို့၏ Genome titer ကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း (54)၊ real-time quantitative PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) နှင့် AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။
အဓိက အာရုံကြောဆဲလ်များကို ရေခဲအေး 1x PBS တွင် ခြစ်ထုတ်ပြီး အမှုန်အမွှားများဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ကာ phosphatase နှင့် protease inhibitor (Roche) ပါဝင်သော 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer တွင် homogenized လုပ်ခဲ့သည်။ bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ ပရိုတင်းပမာဏကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ပရိုတင်းများကို SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီးနောက် polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare) ပေါ်တွင် blot လုပ်ခဲ့သည်။ တိကျမှုမရှိသောနေရာများကို ပိတ်ဆို့ပြီး TBST (Tris-buffered saline with Tween) ရှိ 5% နို့တွင် primary antibody (အသေးစိတ်အတွက် ဇယား S1 ကိုကြည့်ပါ)၊ ဆေးကြောခြင်းအဆင့်များနှင့် TBST Incubate ရှိ secondary antibody တွင် incubate လုပ်ပါ။ primary antibody ဖြင့် +4°C တွင် တစ်ညလုံး incubate လုပ်ပါ။ ဆေးကြောပြီးနောက်၊ အခန်းအပူချိန်တွင် secondary antibody ကို 2 နာရီကြာ လိမ်းပါ။ ထို့နောက် anti-β-actin antibody ဖြင့် တူညီသော blot ကို incubate လုပ်ခြင်းဖြင့် တူညီသော loading ကို အတည်ပြုခဲ့သည်။ ဓာတုအလင်းဖြာထွက်မှုအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခြင်းနှင့် ဓာတုအလင်းဖြာထွက်မှုကို မြှင့်တင်ခြင်းဖြင့် ထောက်လှမ်းခြင်း (GE Healthcare)။
ဖန်အဖုံးများပေါ်တွင် ယခင်က ကြဲချထားသော အာရုံကြောဆဲလ်များကို အခန်းအပူချိန်တွင် သတ်မှတ်ထားသော အချိန်အမှတ်တွင် 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ ပြုပြင်ထားသည်။ အဖုံးများကို အခန်းအပူချိန်တွင် 0.1% Triton X-100/PBS ဖြင့် 5 မိနစ်ခန့် ဦးစွာ စိမ့်ဝင်စေပြီး ထို့နောက် blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS] တွင် ထည့်ပါ။ ဒုတိယနေ့တွင် အဖုံးများကို blocking buffer ဖြင့် ဆေးကြောပြီး သင့်လျော်သော fluorophore-conjugated secondary antibody ဖြင့် အခန်းအပူချိန်တွင် 2 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင် နမူနာများကို 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ဖြင့် PBS တွင် သေချာစွာဆေးကြောပြီးနောက် counterstain လုပ်ပြီးနောက် Aqua-Poly/Mount ဖြင့် မိုက်ခရိုစကုပ်ဆလိုက်ပေါ်တွင် ပြုပြင်ထားသည်။
ကြွက်များ (အထီးနှင့်အမ) ကို ketamine (130 mg/kg) နှင့် xylazine (10 mg/kg) ကို ဝမ်းဗိုက်အတွင်းထိုးခြင်းဖြင့် မေ့ဆေးပေးခဲ့ပြီး carprofen analgesic (5 mg/kg) ဖြင့် အရေပြားအောက်သို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ထို့နောက် နွေးသောအခင်းတပ်ဆင်ထားသော stereotactic instrument (Kopf) တွင် ထားခဲ့သည်။ ဦးခေါင်းခွံကို ဖွင့်ပြီး mis အရိုးနှင့် ကိုက်ညီသော cerebellar cortex ၏ အစိတ်အပိုင်းကို ပါးလွှာစေရန် သွားထိုးကိရိယာကို အသုံးပြုခဲ့သည် (lambda မှ: အမြီး 1.8၊ ဘေးတိုက် 1၊ IV နှင့် V lobules များနှင့် ကိုက်ညီသည်)။ အောက်ရှိ သွေးကြောများကို မနှောင့်ယှက်စေရန် ကွေးညွှတ်နေသော ဆေးထိုးအပ်ကို အသုံးပြု၍ ဦးခေါင်းခွံတွင် အပေါက်ငယ်တစ်ခု ဂရုတစိုက် ဖန်တီးခဲ့သည်။ ထို့နောက် ပါးလွှာသော ဆွဲထားသော ဖန် capillary ကို micro-hole (dura mater ၏ ventral ဘက်ခြမ်းတွင် -1.3 မှ -1) ထဲသို့ ဖြည်းဖြည်းချင်းထည့်သွင်းပြီး 200 မှ 300 nl AAV ကို manual syringes (Narishige) ဖြင့် micro-injector (Narishige) ထဲသို့ မိနစ် 10 မှ 20 အတွင်း ဖိအားနည်းသော အကြိမ်များစွာ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ထိုးသွင်းပြီးနောက်၊ ဗိုင်းရပ်စ် လုံးဝပျံ့နှံ့သွားစေရန် ဆံချည်မျှင်သွေးကြောကို နောက်ထပ် ၁၀ မိနစ်ခန့်ထားပါ။ ဆံချည်မျှင်သွေးကြောများကို ထုတ်ယူပြီးနောက်၊ ဒဏ်ရာရောင်ရမ်းမှုကို လျှော့ချရန်နှင့် တိရစ္ဆာန် ပြန်လည်ကောင်းမွန်လာစေရန် အရေပြားကို ဂရုတစိုက်ချုပ်ပေးသည်။ တိရစ္ဆာန်များကို ခွဲစိတ်ပြီးနောက် ရက်အတော်ကြာအောင် အကိုက်အခဲပျောက်ဆေး (caspofen) ဖြင့် ကုသပေးခဲ့ပြီး ထိုအချိန်အတွင်း ၎င်းတို့၏ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ အခြေအနေကို ဂရုတစိုက် စောင့်ကြည့်ပြီးနောက် သတ်မှတ်ထားသောအချိန်တွင် သတ်ပစ်ခဲ့သည်။ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို ဥရောပ၊ အမျိုးသားနှင့် အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာ လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ ဆောင်ရွက်ခဲ့ပြီး ဂျာမနီနိုင်ငံ၊ မြောက်ရိုင်း-ဝက်စ်ဖာလီယာ၊ Umwelt နှင့် Verbraucherschutz မှ LandesamtfürNatur မှ အတည်ပြုခဲ့သည်။
တိရစ္ဆာန်များကို ketamine (100 mg/kg) နှင့် xylazine (10 mg/kg) ဖြင့် မေ့ဆေးပေးခဲ့ပြီး နှလုံးကို 0.1 M PBS ဖြင့် ဦးစွာဖြန်းပြီးနောက် PBS တွင် 4% PFA ဖြင့် ဖြန်းပေးခဲ့သည်။ တစ်ရှူးကို ခွဲစိတ်ပြီး 4°C တွင် တစ်ညလုံး 4% PFA/PBS တွင် ပြုပြင်ခဲ့သည်။ PBS တွင် ပြုပြင်ထားသော ဦးနှောက်မှ sagittal အပိုင်းများ (50 μm အထူ) ကို ပြင်ဆင်ရန် vibrating knife (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ အခြားနည်းဖြင့် သတ်မှတ်ထားခြင်းမရှိပါက၊ free-floating အပိုင်းများကို အရောင်ခြယ်ခြင်းကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း (13) အခန်းအပူချိန်တွင် မွှေပြီး လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ပထမဦးစွာ ရရှိလာသော အပိုင်းများကို အခန်းအပူချိန်တွင် 0.5% Triton X-100/PBS ဖြင့် 15 မိနစ်ခန့် စိမ့်ဝင်စေခဲ့သည်။ အချို့ epitopes (Pcx နှင့် Shmt2) အတွက်၊ 80°C (PH 9) ရှိ tris-EDTA buffer တွင် ဤအဆင့်အစား 25 မိနစ်ခန့် အပူပေးခဲ့သည်။ ထို့နောက် အပိုင်းများကို primary antibody (ဇယား S1 ကိုကြည့်ပါ) ဖြင့် blocking buffer (3% BSA/PBS) တွင် 4°C တွင် တစ်ညလုံးမွှေပြီး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ နောက်တစ်နေ့တွင် အပိုင်းများကို blocking buffer ဖြင့်ဆေးကြောပြီး သင့်လျော်သော fluorophore-conjugated secondary antibody ဖြင့် အခန်းအပူချိန်တွင် 2 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင် အပိုင်းများကို PBS တွင် သေချာစွာဆေးကြောပြီး DAPI ဖြင့် counter-stained လုပ်ကာ မိုက်ခရိုစကုပ် slide ပေါ်တွင် AquaPolymount ဖြင့် ပြုပြင်ခဲ့သည်။
အဖြူရောင်အလင်းလေဆာနှင့် 405 diode ultraviolet laser တပ်ဆင်ထားသော laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X သို့မဟုတ် TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ကို နမူနာပုံရိပ်ဖော်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ fluorophore ကိုလှုံ့ဆော်ပြီး Hybrid Detector (HyDs) ဖြင့် signal ကိုစုဆောင်းခြင်းဖြင့်၊ LAS-X software ကို Nyquist sampling နှင့်ကိုက်ညီသော stacked images များကို sequential mode တွင်စုဆောင်းရန်အသုံးပြုခဲ့သည်- ပမာဏမဟုတ်သော panel များအတွက်၊ ၎င်းသည် အလွန်အမင်းပြောင်းလဲနေသော signal များ (ဥပမာ၊ somatic cells နှင့် dendrites များတွင်) mtYFP) ဖြစ်သည်။ BrightR mode တွင် PNs အရေအတွက်ကို ထောက်လှမ်းရန် HyD ကိုသုံးပါ။ နောက်ခံကိုလျှော့ချရန် 0.3 မှ 6 ns အထိ Gating ကိုအသုံးပြုသည်။
စီထားသောဆဲလ်များ၏ အချိန်နှင့်တပြေးညီပုံရိပ်ဖော်ခြင်း။ 1% B27 ဖြည့်စွက်စာနှင့် 0.5 mM GlutaMax ပါဝင်သော Neurobasal-A medium တွင် စီပြီးနောက်၊ ဆဲလ်များကို poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) ပေါ်တွင် ချက်ချင်းထည့်သွင်းခဲ့ပြီး၊ ဆဲလ်များ အနည်ထိုင်စေရန် 37°C နှင့် 5% CO2 တွင် 1 နာရီကြာ သိမ်းဆည်းထားခဲ့သည်။ အဖြူရောင်လေဆာ၊ HyD၊ 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens နှင့် အပူပေးစင်တို့ တပ်ဆင်ထားသော Leica SP8 laser scanning confocal microscope တွင် အချိန်နှင့်တပြေးညီပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
ကြွက်ကို ကာဗွန်ဒိုင်အောက်ဆိုဒ်ဖြင့် လျင်မြန်စွာ မေ့ဆေးပေးပြီး ခေါင်းဖြတ်ခဲ့ပြီး ဦးနှောက်ကို ဦးခေါင်းခွံမှ လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားကာ အောက်ပါပစ္စည်းများဖြင့် ပြည့်နေသော 200μm အထူ (13C တံဆိပ်ကပ်ခြင်း စမ်းသပ်ချက်အတွက်) သို့မဟုတ် 275μm အထူ (ဖိုတွန် စမ်းသပ်ချက် နှစ်ခုအတွက်) sagittal အပိုင်းအဖြစ် ဖြတ်တောက်ခဲ့သည်။ ရေခဲမုန့် (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ကို အောက်ပါပစ္စည်းများဖြင့် ပြည့်နှက်ထားသည်- 125 mM ရေခဲအေး၊ ကာဗွန်ပြည့်ဝသော (95% O2 နှင့် 5% CO2) low Ca2 + artificial cerebrospinal fluid (ACSF) NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25 mM NaHCO3၊ 25 mM ဂလူးကို့စ်၊ 0.5 mM CaCl2 နှင့် 3.5 mM MgCl2 (osmotic pressure 310 မှ 330 mmol)။ ရရှိလာသော ဦးနှောက်အစိတ်များကို Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25.0 mM NaHCO3၊ 25.0 mM d-ဂလူးကို့စ်၊ 1.0 mM CaCl2 နှင့် 2.0 mM MgCl2) အလတ်စား) pH 7.4 နှင့် 310 မှ 320 mmol) ပိုမိုမြင့်မားစွာပါဝင်သော pre-incubation chamber သို့ လွှဲပြောင်းပါ။
ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း၊ အပိုင်းအစများကို သီးသန့်ပုံရိပ်ဖော်ခန်းထဲသို့ ရွှေ့ပြောင်းခဲ့ပြီး၊ ၃၂° မှ ၃၃°C အပူချိန်တွင် စဉ်ဆက်မပြတ် ACSF သွေးလည်ပတ်မှုအောက်တွင် စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Leica 25x အရာဝတ္ထုမှန်ဘီလူး (NA 0.95၊ ရေ) တပ်ဆင်ထားသော multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems)၊ Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ကို slice imaging အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ FLIM module (PicoHarp300, PicoQuant)။
Grx1-roGFP2 ၏ FLIM။ PN များ၏ ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရီဒေါ့စ်အခြေအနေတွင် ပြောင်းလဲမှုများကို sagittal ဦးနှောက်အပိုင်းအစများတွင် two-photon FLIM ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့ပြီး Grx1-roGFP2 biosensor သည် PN များကို ပစ်မှတ်ထားသည်။ PN အလွှာတွင်၊ acquisition field ကို slice မျက်နှာပြင်အောက် 50 မှ 80 μm ခန့်တွင် ရွေးချယ်ထားပြီး၊ အသက်ရှင်နိုင်သော PN (ဆိုလိုသည်မှာ၊ dendrites တစ်လျှောက်တွင် beaded structure သို့မဟုတ် neuronal morphological changes မရှိခြင်း) နှင့် double positive roGFP2 sensor နှင့် AAV encoding shRNA PCx သို့မဟုတ် ၎င်း၏ control sequence (တစ်ခုစီသည် co-expressing mCherry) ရှိကြောင်း သေချာစေရန် ရွေးချယ်သည်။ 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 pixels] ဖြင့် single-stack images များကို စုဆောင်းပါ။ ထောက်လှမ်းခြင်း- internal HyD၊ fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] နှင့် curve fitting အတွက် လုံလောက်သော photons များ စုဆောင်းကြောင်း သေချာစေရန် 2 မိနစ်မှ 3 မိနစ်အတွင်း image averaging ကို အသုံးပြုသည်။ Grx1-roGFP2 probe ၏ အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် FLIM အခြေအနေများကို အတည်ပြုခြင်းကို perfusion ACSF သို့ exogenous 10 mM H2O2 ထည့်သောအခါ (ဓာတ်တိုးခြင်းကို အများဆုံးဖြစ်စေပြီး သက်တမ်းတိုးစေသည်) roGFP2 ၏ သက်တမ်းတန်ဖိုးကို စောင့်ကြည့်ခြင်းဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး 2 mM dithiothreitol ထည့်သောအခါ (လျှော့ချမှုအဆင့်ကို အနည်းဆုံးဖြစ်စေပြီး သက်တမ်းလျော့ကျစေသည်) (ပုံ S8၊ D မှ G) ရရှိလာသော ရလဒ်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်၊ ပုံရိပ်တစ်ခုလုံး၏ single exponential decay curve ကို တိုင်းတာထားသော IRF (instrument response function) နှင့် fit လုပ်ရန်၊ χ2 သည် 1 ခန့်ဖြစ်သည်။ single PN ၏ သက်တမ်းကို တွက်ချက်ရန်အတွက် အာရုံကြောကိုယ်ထည်ပတ်လည်ရှိ mask ကို လက်ဖြင့်ဆွဲခဲ့ပြီး mask တစ်ခုစီရှိ ပျမ်းမျှသက်တမ်းကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အလားအလာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ စူးရှသော အပိုင်းကို perfused ACSF ထဲသို့ တိုက်ရိုက်ထည့်သွင်းထားသော 100 nM TMRM ဖြင့် မိနစ် ၃၀ ကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက်၊ PN များ၏ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အလားအလာ ပြောင်းလဲမှုများကို two-photon microscope ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ TMRM ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို 920 nm တွင် probe ကို excitation လုပ်ခြင်းဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး internal HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ကို အသုံးပြု၍ အချက်ပြမှုများကို စုဆောင်းခြင်းဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ mtYFP ကို ​​ပုံရိပ်ဖော်ရန် တူညီသော excitation wavelength ကို အသုံးပြုသော်လည်း မတူညီသော internal HyD (FITC :525/50) ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ single cell level တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် အလားအလာကို အကဲဖြတ်ရန် ImageJ ၏ Image Calculator plug-in ကို အသုံးပြုပါ။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် plug-in equation: signal = min (mtYFP, TMRM) ကို သက်ဆိုင်ရာ channel ၏ single-stack confocal image တွင် Purkinje Somali ရှိ TMRM အချက်ပြမှုကို ပြသသည့် မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဒေသကို ဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုသည်။ ထို့နောက် ရလဒ် mask ရှိ pixel ဧရိယာကို ပမာဏသတ်မှတ်ပြီးနောက် mitochondrial potential ကိုပြသသည့် mitochondrial fraction ကိုရရှိရန် mtYFP channel ၏ သက်ဆိုင်ရာ threshold single-stack image တွင် normalized လုပ်သည်။
ပုံကို Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) ဆော့ဖ်ဝဲလ်ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသည်။ စကင်ဖတ်ထားသော tile ပုံများအတွက်၊ တစ်ခုတည်းသော tile ၏ montage ကို LAS-X ဆော့ဖ်ဝဲလ်မှ ပံ့ပိုးပေးသော အလိုအလျောက် ချုပ်လုပ်ခြင်း algorithm ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်သည်။ ရုပ်ပုံချိန်ညှိပြီးနောက်၊ ရုပ်ပုံကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ရန်နှင့် တောက်ပမှုနှင့် contrast ကို ညီညာစွာ ချိန်ညှိရန် ImageJ နှင့် Adobe Photoshop ကို အသုံးပြုပါ။ ဂရပ်ဖစ်ပြင်ဆင်မှုအတွက် Adobe Illustrator ကို အသုံးပြုပါ။
mtDNA အာရုံစူးစိုက်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ mtDNA အနာအဆာအရေအတွက်ကို confocal မိုက်ခရိုစကုပ်ဖြင့် DNA ကို ဆန့်ကျင်သော ပဋိပစ္စည်းများဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော cerebellar အပိုင်းများတွင် တွက်ချက်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်ကိုယ်ထည်နှင့် ဆဲလ်တစ်ခုစီ၏ နျူကလိယအတွက် ပစ်မှတ်ဧရိယာတစ်ခုစီကို ဖန်တီးခဲ့ပြီး သက်ဆိုင်ရာဧရိယာကို Multi Measure plug-in (ImageJ software) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ ဆိုက်တိုပလာစမစ်ဧရိယာရရှိရန် ဆဲလ်ကိုယ်ထည်ဧရိယာမှ နျူကလီးယားဧရိယာကို နုတ်ပါ။ နောက်ဆုံးတွင်၊ threshold image တွင် mtDNA ကိုညွှန်ပြသော ဆိုက်တိုပလာစမစ် DNA အမှတ်များကို အလိုအလျောက် တွက်ချက်ရန် Analyze Particles plug-in (ImageJ software) ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး ရရှိလာသောရလဒ်များကို CTRL မောက်စ်များ၏ PN ပျမ်းမျှအဖြစ် ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ရလဒ်များကို ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် နျူကလိယများ ပျမ်းမျှအရေအတွက်အဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။
ပရိုတင်းဖော်ပြမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ ဆဲလ်တစ်ခုတည်းအဆင့်တွင် PN ရှိ ပရိုတင်းဖော်ပြမှုကို အကဲဖြတ်ရန် ImageJ ၏ Image Calculator plug-in ကို အသုံးပြုပါ။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် သက်ဆိုင်ရာ channel ၏ single-layer confocal image တွင်၊ signal = min (mtYFP, antibody) ညီမျှခြင်းမှတစ်ဆင့်၊ Purkina ရှိ အချို့သော antibody တစ်ခုအပေါ် immunoreactivity ပြသသော mitochondrial ဒေသကို ဖော်ထုတ်သည်။ ထို့နောက် ရလဒ် mask ရှိ pixel ဧရိယာကို ပမာဏသတ်မှတ်ပြီးနောက် mtYFP channel ၏ သက်ဆိုင်ရာ threshold single-stack image တွင် ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီး ပြသထားသော ပရိုတင်း၏ mitochondrial fraction ကို ရရှိရန် ပြုလုပ်သည်။
Purkinje ဆဲလ်သိပ်သည်းဆ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ ImageJ ၏ Cell Counter plug-in ကို ရေတွက်ထားသော Purkinje ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ရေတွက်ထားသောဆဲလ်များ နေရာယူထားသော cerebellar ring ၏အရှည်ဖြင့် စားခြင်းဖြင့် Purkinje သိပ်သည်းဆကို အကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။
နမူနာပြင်ဆင်ခြင်းနှင့် စုဆောင်းခြင်း။ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် Mfn2cKO ကြွက်များမှ ဦးနှောက်များကို 0.1 M phosphate buffer (PB) တွင် 2% PFA/2.5% glutaraldehyde တွင် ထည့်ပြီး coronal အပိုင်းများကို ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (အထူ 50 မှ 60 μm) ကို အသုံးပြု၍ ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် အခန်းအပူချိန်တွင် 1% os tetraoxide နှင့် 1.5% potassium ferrocyanide တွင် PB buffer တွင် 1 နာရီကြာ ထည့်ပါ။ အပိုင်းများကို distilled water ဖြင့် သုံးကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက် 1% uranyl acetate ပါဝင်သော 70% ethanol ဖြင့် 20 မိနစ်ကြာ ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ ထို့နောက် အပိုင်းများကို graded alcohol တွင် ရေခြောက်စေပြီး Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) တွင် silicon-coated glass slides များကြားတွင် ထည့်သွင်းကာ နောက်ဆုံးတွင် 60°C တွင် မီးဖို၌ 48 နာရီကြာ polymerize လုပ်ခဲ့သည်။ cerebellar cortex ဧရိယာကို ရွေးချယ်ပြီး 50 nm အလွန်ပါးလွှာသော အပိုင်းများကို Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ဖြင့် ဖြတ်တောက်ကာ polystyrene film ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော 2×1 mm ကြေးနီ slit grid ပေါ်တွင် ခူးဆွတ်ခဲ့သည်။ အပိုင်းများကို ရေထဲတွင် 4% uranyl acetate ပျော်ရည်ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ ဆေးဆိုးခဲ့ပြီး ရေဖြင့် အကြိမ်ပေါင်းများစွာ ဆေးကြောပြီးနောက် Reynolds lead citrate ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ ဆေးသုတ်ပြီးနောက် ရေဖြင့် အကြိမ်ပေါင်းများစွာ ဆေးကြောခဲ့သည်။ ရုပ်သေးရုပ်သေးရုပ်များကို transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ဖြင့် TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ဖြင့် ဂျာမနီနိုင်ငံထုတ် TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ဖြင့် transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ဖြင့် အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် ရိုက်ကူးခဲ့သည်။
AAV ကူးစက်ခံရသော ကြွက်များအတွက် ဦးနှောက်ကို ခွဲထုတ်ပြီး ၁ မီလီမီတာအထူ sagittal အပိုင်းအဖြစ် လှီးဖြတ်ခဲ့ပြီး cerebellum ကို fluorescence microscope ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့ပြီး AAV ကူးစက်ခံရသော ring (ဆိုလိုသည်မှာ mCherry expressing) ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ AAV ထိုးသွင်းခြင်းသည် Purkinje ဆဲလ်အလွှာ (ဆိုလိုသည်မှာ အလွှာတစ်ခုလုံးနီးပါး) ၏ transduction စွမ်းဆောင်ရည် အလွန်မြင့်မားစေသည့် စမ်းသပ်ချက်များကိုသာ အသုံးပြုသည်။ AAV-transduced loop ကို တစ်ညလုံး post-fixation (0.1 M cocoate buffer တွင် 4% PFA နှင့် 2.5% glutaraldehyde) အတွက် microdissected လုပ်ခဲ့ပြီး ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ EPON ထည့်သွင်းခြင်းအတွက် fixed တစ်ရှူးကို 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) ဖြင့်ဆေးကြောပြီး 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) တွင် 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ဖြင့် ၄ နာရီကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက် ၂ နာရီကြာ ဆေးကြောသည်။ 0.1 M cocamide buffer ဖြင့် ၃ ကြိမ်ပြန်လုပ်ပါ။ ထို့နောက်တွင်၊ အီသနော၏ ascending series ကို အသုံးပြု၍ အီသနောအရည်တစ်ခုစီကို ၄°C တွင် ၁၅ မိနစ်ခန့် incubation လုပ်ကာ တစ်ရှူးများကို ရေဓာတ်ခန်းခြောက်စေခဲ့သည်။ တစ်ရှူးကို propylene oxide သို့ လွှဲပြောင်းပြီး ၄°C တွင် EPON (Sigma-Aldrich) တွင် တစ်ညလုံး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးကို အခန်းအပူချိန်တွင် ၂ နာရီကြာ အသစ် EPON ထဲတွင်ထည့်ပြီး ၆၂°C တွင် ၇၂ နာရီကြာ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) နှင့် diamond knife (Diatome, Biel, Switzerland) ကိုအသုံးပြု၍ 70 nm ultrathin အပိုင်းများကို ဖြတ်တောက်ကာ 1.5% uranyl acetate ဖြင့် ၃၇°C တွင် ၁၅ မိနစ်ခန့် ဆေးဆိုးပြီး lead citrate အရည်ဖြင့် ၄ မိနစ်ခန့် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။ Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) နှင့် DigitalMicrograph software (Gatan) တပ်ဆင်ထားသော JEM-2100 Plus transmission electron microscope (JEOL) ကို အသုံးပြု၍ electron micrograph များကို ရိုက်ကူးခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အီလက်ထရွန် အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးများကို 5000× သို့မဟုတ် 10,000× ဒစ်ဂျစ်တယ် ဇူးမ်ဖြင့် ရယူခဲ့သည်။
မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ ရုပ်သွင်ပြင်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးအတွက်၊ တစ်ဦးချင်း မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ မျဉ်းကြောင်းများကို ImageJ ဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြု၍ ဒစ်ဂျစ်တယ်ပုံများတွင် ကိုယ်တိုင်ရေးဆွဲထားသည်။ မတူညီသော ရုပ်သွင်ပြင်ဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် သိပ်သည်းဆကို ဆဲလ်တစ်ခုစီ၏ စုစုပေါင်း မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ် ဧရိယာကို ဆိုက်တိုပလာဇမ် ဧရိယာ (ဆိုက်တိုပလာဇမ် ဧရိယာ = ဆဲလ်ဧရိယာ-ဆဲလ်နျူကလိယ ဧရိယာ) × 100 ဖြင့် စားခြင်းဖြင့် ရရှိသော ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ် ဖော်ပြပါသည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ လုံးဝန်းမှုကို [4π∙(ဧရိယာ/ပတ်လည်အတိုင်းအတာ 2)] ဖော်မြူလာဖြင့် တွက်ချက်သည်။ မိုက်တိုခွန်ဒရီယယ်၏ ista မော်ဖိုလော်ဂျီကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး ၎င်းတို့၏ အဓိကပုံသဏ္ဍာန်များအရ အမျိုးအစားနှစ်ခု (“tubular” နှင့် “blister”) ခွဲခြားထားသည်။
Autophagosome/lysosome အရေအတွက်နှင့် သိပ်သည်းဆ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ ဒစ်ဂျစ်တယ်ပုံတွင် autophagosome/lysosome တစ်ခုစီ၏ မျဉ်းကြောင်းများကို ကိုယ်တိုင်ရေးဆွဲရန် ImageJ ဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြုပါ။ Autophagosome/lysosome ဧရိယာကို ဆဲလ်တစ်ခုစီ၏ စုစုပေါင်း autophagosome/lysosome ဖွဲ့စည်းပုံဧရိယာကို cytoplasm ဧရိယာ (cytoplasm ဧရိယာ=ဆဲလ်ဧရိယာ-နျူကလိယဧရိယာ) ×100 ဖြင့် စားခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ထားသော ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။ autophagosomes/lysosomes ၏ သိပ်သည်းဆကို စုစုပေါင်းအရေအတွက်ကို ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် autophagosome/lysosome ဖွဲ့စည်းပုံအရေအတွက် (cytoplasmic ဧရိယာအရ) ဖြင့် စားခြင်းဖြင့် တွက်ချက်သည် (cytoplasmic ဧရိယာ = ဆဲလ်ဧရိယာ-နျူကလီးယားဧရိယာ)။
အရေးပေါ်ဖြတ်တောက်ခြင်းနှင့် နမူနာပြင်ဆင်ခြင်းအတွက် တံဆိပ်ကပ်ခြင်း။ ဂလူးကို့စ် တံဆိပ်ကပ်ရန် လိုအပ်သော စမ်းသပ်ချက်များအတွက်၊ အရေးပေါ်ဦးနှောက်အစိတ်များကို saturated carbon (95% O2 နှင့် 5% CO2)၊ မြင့်မားသော Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25.0 mM NaHCO 3၊ 25.0 mM d-glucose၊ 1.0 mM CaCl 2 နှင့် 2.0 mM MgCl 2 တို့ပါဝင်သော pre-incubation chamber သို့ လွှဲပြောင်းပါ၊ ၎င်းတွင် ဂလူးကို့စ်သည် 13 C 6- Glucose substitution (Eurisotop၊ catalog number CLM-1396) ဖြစ်သည်။ pyruvate အညွှန်းကပ်ရန် လိုအပ်သော စမ်းသပ်ချက်များအတွက်၊ ဦးနှောက်အစိတ်များကို Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25.0 mM NaHCO3၊ 25.0 mM d-ဂလူးကို့စ်၊ 1.0 mM CaCl2 နှင့် 2.0mM MgCl2 ကိုထည့်ပါ၊ pH 7.4 နှင့် 310 မှ 320mOsm အထိ ချိန်ညှိပါ) သို့ လွှဲပြောင်းပါ၊ ထို့နောက် 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop၊ ကတ်တလောက်နံပါတ် CLM-1082) ကိုထည့်ပါ။ အပိုင်းများကို ၃၇°C တွင် မိနစ် ၉၀ ကြာ ပေါင်းထည့်ပါ။ စမ်းသပ်မှုအဆုံးတွင် အပိုင်းများကို 75 mM အမိုးနီယမ်ကာဗွန်နိတ်ပါဝင်သော ရေအရည် (pH 7.4) ဖြင့် အမြန်ဆေးကြောပြီးနောက် 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: water တွင် homogenized ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အပိုင်းအစများကို ရေခဲပေါ်တွင် မိနစ် ၃၀ ကြာ ထားပြီးနောက်၊ နမူနာများကို 21,000 g တွင် ၄°C တွင် ၁၀ မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့ပြီး၊ ကြည်လင်သော supernatant ကို SpeedVac concentrator တွင် အခြောက်ခံခဲ့သည်။ ရရှိလာသော ခြောက်သွေ့ထားသော metabolite pellet ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမပြုမီအထိ -80°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
C-တံဆိပ်ကပ်ထားသော အမိုင်နိုအက်ဆစ် ၁၃ မျိုး၏ အရည် chromatography-mass spectrometry ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ အရည် chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ metabolite pellet ကို LC-MS အဆင့်ရေ 75μl (Honeywell) တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်။ 4°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ 21,000 g တွင် centrifugation လုပ်ပြီးနောက်၊ ကြည်လင်သော supernatant 20 μl ကို အမိုင်နိုအက်ဆစ် flux ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ကျန်ထုတ်ယူမှုကို anion ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ချက်ချင်းအသုံးပြုခဲ့သည် (အောက်တွင်ကြည့်ပါ)။ အမိုင်နိုအက်ဆစ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သော benzoyl chloride derivatization protocol (55, 56) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ပထမအဆင့်တွင်၊ 100 mM ဆိုဒီယမ်ကာဗွန်နိတ် (Sigma-Aldrich) 10μl ကို metabolite extract 20μl ထဲသို့ထည့်ပြီးနောက် 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) 10μl ကို LC အဆင့် ACN ထဲသို့ထည့်ခဲ့သည်။ နမူနာကို ခဏတာ vortex လုပ်ပြီးနောက် 20°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ 21,000 g ဖြင့် centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ ကြည်လင်သော supernatant ကို conical glass insert (200 μl volume) ပါသည့် 2 ml autosampler vial ထဲသို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ နမူနာများကို Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက်၊ derivatized နမူနာ 2μl ကို 1.8μm particles ပါရှိသော 100×1.0 mm high-strength silica T3 column (Waters) ထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ flow rate မှာ 100μl/min ဖြစ်ပြီး buffer system တွင် buffer A (10 mM ammonium formate နှင့် 0.15% formic acid in water) နှင့် buffer B (ACN) တို့ ပါဝင်ပါသည်။ gradient မှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်- 0 မိနစ်တွင် 0%B; 0%B။ ၀ မှ ၀.၁ မိနစ်တွင် ၀ မှ ၁၅% B၊ ၀.၁ မှ ၀.၅ မိနစ်တွင် ၁၅ မှ ၁၇% B၊ ၀.၅ မှ ၁၄ မိနစ်တွင် ၁၇ မှ ၅၅% B၊ ၁၄ မှ ၁၄.၅ မိနစ်တွင် ၅၅ မှ ၇၀% B၊ ၁၈ မိနစ်တွင် ၁၄.၅ မှ ၇၀ မှ ၁၀၀% B၊ ၁၈ မှ ၁၉ မိနစ်တွင် ၁၀၀% B၊ ၁၉ မှ ၁၉.၁ မိနစ်တွင် ၁၀၀ မှ ၀% B၊ ၁၉.၁ မှ ၂၈ မိနစ်တွင် ၀% B (၅၅၊ ၅၆)။ QE-HF mass spectrometer သည် m/z (mass/charge ratio) 50 မှ 750 mass range ဖြင့် positive ionization mode ဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။ အသုံးပြုထားသော resolution မှာ 60,000 ဖြစ်ပြီး ရရှိသော gain control (AGC) ion target မှာ 3×106 ဖြစ်ပြီး အများဆုံး ion အချိန်မှာ 100 milliseconds ဖြစ်သည်။ အပူပေးထားသော electrospray ionization (ESI) source သည် spray voltage 3.5 kV၊ capillary အပူချိန် 250°C၊ sheath airflow 60 AU (arbitrary units) နှင့် auxiliary airflow 20 AU တွင် လုပ်ဆောင်သည်။ 250°C။ S lens ကို 60 AU တွင် သတ်မှတ်ထားသည်။
13C အညွှန်းတပ်ထားသော အော်ဂဲနစ်အက်ဆစ်များ၏ အန်အိုင်းယွန်းခရိုမာတိုဂရပ်ဖီ-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ကျန်ရှိနေသော ဇီဝဖြစ်စဉ်အနည်အနှစ် (55μl) ကို QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Dionex ion chromatography system (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ယူမှု 5μl ကို HPLC (2 mm×250 mm, အမှုန်အရွယ်အစား 4μm, Thermo Fisher Scientific) တပ်ဆင်ထားသော Dionex IonPac AS11-HC ကော်လံထဲသို့ 1 ၏ ဖြည့်သွင်းအချိုးဖြင့် push-in partial loop mode ဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။) Dionex IonPac AG11-HC guard ကော်လံ (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific)။ ကော်လံအပူချိန်ကို 30°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး၊ autosampler ကို 6°C တွင် သတ်မှတ်ထားသည်။ eluent generator မှတစ်ဆင့် ပိုတက်ဆီယမ်ဟိုက်ဒရောက်ဆိုဒ် gradient ကို ထုတ်လုပ်ရန် deionized water ပါရှိသော ပိုတက်ဆီယမ်ဟိုက်ဒရောက်ဆိုဒ် cartridge ကို အသုံးပြုပါ။ ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲသော အရာများကို 380μl/min စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး၊ အောက်ပါ gradient ကို အသုံးပြုသည်- 0 မှ 3 မိနစ်၊ 10 mM KOH; 3 မှ 12 မိနစ်၊ 10 မှ 50 mM KOH; 12 မှ 19 မိနစ်၊ 50 မှ 100 mM KOH; 19 မှ 21 မိနစ်၊ 100 mM KOH; 21 မှ 21.5 မိနစ်၊ 100 မှ 10 mM KOH။ ကော်လံကို 10 mM KOH အောက်တွင် 8.5 မိနစ်ကြာ ပြန်လည်ချိန်ညှိခဲ့သည်။
eluted metabolites များကို column ပြီးနောက် 150μl/min isopropanol supplement stream နှင့် ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် negative ionization mode တွင် လည်ပတ်နေသော high-resolution mass spectrometer သို့ ညွှန်ကြားသည်။ MS သည် m/z 50 မှ 750 အထိ mass range ကို 60,000 resolution ဖြင့် စောင့်ကြည့်နေသည်။ AGC ကို 1×106 ဟု သတ်မှတ်ထားပြီး အများဆုံး ion time ကို 100 ms တွင် ထားရှိထားသည်။ အပူပေးထားသော ESI source ကို 3.5 kV spray voltage ဖြင့် လည်ပတ်သည်။ ion source ၏ အခြား setting များမှာ အောက်ပါအတိုင်းဖြစ်သည်- capillary temperature 275°C; sheath gas flow, 60 AU; auxiliary gas flow, 300°C တွင် 20 AU နှင့် S lens ကို 60 AU ဟု သတ်မှတ်ထားသည်။
13C အညွှန်းတပ်ထားသော ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်များ၏ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ အိုင်ဆိုတုပ်အချိုး၏ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် TraceFinder ဆော့ဖ်ဝဲ (ဗားရှင်း 4.2၊ Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြုပါ။ ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုစီ၏ အမှတ်အသားကို ယုံကြည်စိတ်ချရသော ရည်ညွှန်းဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုဖြင့် အတည်ပြုပြီး သီးခြားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အိုင်ဆိုတုပ်ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ရန်အတွက်၊ 13C အိုင်ဆိုတုပ် (Mn) တစ်ခုစီ၏ ထုတ်ယူထားသော အိုင်းယွန်းခရိုမာတိုဂရမ် (XIC) ၏ ဧရိယာကို [M + H] + မှ ထုတ်ယူခဲ့ပြီး၊ n သည် ပစ်မှတ်ဒြပ်ပေါင်း၏ ကာဗွန်နံပါတ်ဖြစ်ပြီး၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အသုံးပြုသည် သို့မဟုတ် [MH] + ကို အန်အိုင်းယွန်းများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အသုံးပြုသည်။ XIC ၏ ဒြပ်ထုတိကျမှုသည် တစ်သန်းလျှင် အပိုင်းငါးပိုင်းထက်နည်းပြီး RT ၏ တိကျမှုသည် 0.05 မိနစ်ဖြစ်သည်။ ကြွယ်ဝမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော အိုင်ဆိုတုပ်တစ်ခုစီနှင့် သက်ဆိုင်ရာဒြပ်ပေါင်း၏ အိုင်ဆိုတုပ်အားလုံး၏ ပေါင်းလဒ်အချိုးကို တွက်ချက်ခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။ ဤအချိုးများကို အိုင်ဆိုတုပ်တစ်ခုစီအတွက် ရာခိုင်နှုန်းတန်ဖိုးများအဖြစ် ပေးထားပြီး၊ ရလဒ်များကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း (42) မိုလာရာခိုင်နှုန်းကြွယ်ဝမှု (MPE) အဖြစ် ဖော်ပြထားပါသည်။
အေးခဲထားသော neuron pellet ကို ရေခဲအေး 80% မီသနော (v/v) တွင် homogenized လုပ်ကာ vortex လုပ်ကာ -20°C တွင် 30 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ပါ။ နမူနာကို ထပ်မံ vortex လုပ်ပြီး +4°C တွင် 30 မိနစ်ကြာ မွှေပါ။ နမူနာကို 21,000 g တွင် 4°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ပြီးနောက် ရရှိလာသော supernatant ကို စုဆောင်းပြီး နောက်ဆက်တွဲ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် 25°C တွင် SpeedVac concentrator ကို အသုံးပြု၍ အခြောက်ခံခဲ့သည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ စီထားသောဆဲလ်များ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ်များတွင် LC-MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ TraceFinder (ဗားရှင်း 4.2၊ Thermo Fisher Scientific) ကို အသုံးပြု၍ ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုစီ၏ monoisotopic mass ကို အသုံးပြု၍ data analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ metabolite data ၏ Quantile normalization ကို preprocessCore software package (57) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
အစိတ်စိတ်ပြင်ဆင်ခြင်း။ ကြွက်ကို ကာဗွန်ဒိုင်အောက်ဆိုဒ်ဖြင့် လျင်မြန်စွာ မေ့ဆေးပေးပြီး ခေါင်းဖြတ်ခဲ့ပြီး ဦးနှောက်ကို ဦးခေါင်းခွံမှ လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားခဲ့ပြီး ရေခဲဖြည့်ထားသော တုန်ခါဓား (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ကို အသုံးပြု၍ 300 မှ 375 μm sagittal အပိုင်းများအဖြစ် ဖြတ်တောက်ခဲ့သည်။ အအေးကာဗွန်ဓာတ်ငွေ့ထုတ်လုပ်မှု (95% O2 နှင့် 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25.0 mM NaHCO3၊ 25.0 mM d-ဂလူးကို့စ်၊ 1.0 mM CaCl2 နှင့် 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 နှင့် 310 မှ 330 mOsm) အထိ ချိန်ညှိခဲ့သည်။ ရရှိလာသော ဦးနှောက်အစိတ်များကို Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ဘာဖာ၊ 25.0 mM NaHCO3၊ 25.0 mM d-ဂလူးကို့စ်၊ 4.0 mM CaCl2 နှင့် mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 နှင့် 310 မှ 320 mOsm မြင့်မားစွာပါဝင်သော အခန်းထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ မှတ်တမ်းတင်ခြင်းမပြုမီ ပြန်လည်အသုံးပြုနိုင်စေရန်အတွက် အစိတ်များကို မိနစ် ၂၀ မှ ၃၀ အထိ သိမ်းဆည်းပါ။
မှတ်တမ်းတင်ခြင်း။ ပုံသေမှတ်တမ်းတင်ခန်းနှင့် 20x ရေစိမ်ခံမှန်ဘီလူး (Scientifica) တပ်ဆင်ထားသော မိုက်ခရိုစကုပ်စင်မြင့်ကို မှတ်တမ်းတင်မှုအားလုံးအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Purkinje ဆဲလ်များကို (i) ခန္ဓာကိုယ်အရွယ်အစား၊ (ii) ဦးနှောက်ငယ်၏ ခန္ဓာဗေဒတည်နေရာနှင့် (iii) fluorescent mtYFP သတင်းထောက်ဂျင်း၏ ဖော်ပြမှုတို့ဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ 5 မှ 11 megohms ၏ အဖျားခုခံမှုရှိသော patch pipette ကို borosilicate glass capillary (GB150-10၊ 0.86 mm×1.5 mm×100 mm၊ Science Products၊ Hofheim၊ ဂျာမနီ) နှင့် အလျားလိုက် pipette Instruments (P-1000၊ Sutter)၊ Novato၊ CA တို့မှ ဆွဲထုတ်ခဲ့သည်။ မှတ်တမ်းတင်မှုအားလုံးကို software Signal (version 6.0၊ Cambridge Electronic၊ Cambridge၊ UK) မှ ထိန်းချုပ်ထားသော ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH၊ Tam၊ ဂျာမနီ) မှ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှုကို 12.5 kHz ၏ sampling rate ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ အချက်ပြမှုကို 1.3 kHz နှင့် 10 kHz အသီးသီး cutoff ကြိမ်နှုန်းများရှိသော short-pass Bessel filter နှစ်ခုဖြင့် filter လုပ်သည်။ membrane နှင့် pipette ၏ capacitance ကို amplifier ကိုအသုံးပြု၍ compensation circuit ဖြင့် compensate လုပ်သည်။ စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို Orca-Flash 4.0 ကင်မရာ (Hamamatsu, Gerden, Germany) ၏ ထိန်းချုပ်မှုအောက်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ Hokawo software (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany) မှ ထိန်းချုပ်ထားသည်။
ပုံမှန် ဆဲလ်တစ်ခုလုံးဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ မှတ်တမ်းတင်ခြင်းမပြုမီတွင်၊ အောက်ပါပစ္စည်းများပါဝင်သော အတွင်းပိုင်းပျော်ရည်ဖြင့် pipette ကိုဖြည့်ပါ- 4.0 mM KCl၊ 2.0 mM NaCl၊ 0.2 mM EGTA၊ 135.0 mM ပိုတက်စီယမ် ဂလူးကိုနိတ်၊ 10.0 mM Hepes၊ 4.0 mM ATP (Mg)၊ 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) နှင့် 10.0 mM creatinine phosphate တို့ကို pH 7.25 သို့ ချိန်ညှိခဲ့ပြီး osmotic pressure သည် 290 mOsm (sucrose) ဖြစ်သည်။ အမြှေးပါးကို ကွဲစေရန် 0 pA အားအသုံးပြုပြီးသည်နှင့် resisting membrane potential ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ input resistance ကို -40၊ -30၊ -20 နှင့် -10 pA hyperpolarized currents များကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာသည်။ voltage response ၏ ပမာဏကို တိုင်းတာပြီး input resistance ကို တွက်ချက်ရန် Ohm's law ကို အသုံးပြုပါ။ ဗို့အားညှပ်ကိရိယာတွင် ၅ မိနစ်ကြာ အလိုအလျောက်လုပ်ဆောင်မှုကို မှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပြီး sPSC ကို Igor Pro (ဗားရှင်း 32 7.01၊ WaveMetrics၊ Lake Oswego၊ Oregon၊ USA) တွင် semi-automatic recognition script ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြားသတ်မှတ်ပြီး တိုင်းတာခဲ့သည်။ IV curve နှင့် steady-state current ကို ဘက်ထရီကို မတူညီသော potentials များတွင် (-110 mV မှစတင်၍) clamping လုပ်ခြင်းနှင့် ဗို့အားကို 5 mV steps ဖြင့် တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ AP ထုတ်လုပ်မှုကို depolarizing current ကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ depolarizing current pulse ကို အသုံးပြုနေစဉ် cell ကို -70 mV တွင် clamp လုပ်ပါ။ မှတ်တမ်းတင်ယူနစ်တစ်ခုစီ၏ step size ကို သီးခြားစီ ချိန်ညှိပါ (10 မှ 60 pA)။ အမြင့်ဆုံး AP frequency ကို ဖြစ်စေသော pulse spikes များကို ကိုယ်တိုင်ရေတွက်ခြင်းဖြင့် အမြင့်ဆုံး AP frequency ကို တွက်ချက်ပါ။ AP threshold ကို AP တစ်ခု သို့မဟုတ် တစ်ခုထက်ပိုသော AP များကို ဦးစွာ trigger လုပ်သည့် depolarization pulse ၏ second derivative ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။
အပေါက်ဖောက်ထားသော patch ပုံစံဖွဲ့စည်းမှုနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ စံပရိုတိုကောများကို အသုံးပြု၍ အပေါက်ဖောက်ထားသော patch မှတ်တမ်းတင်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်ပါ။ အောက်ပါပါဝင်ပစ္စည်းများ မပါဝင်သော ATP- နှင့် GTP-ကင်းစင်သော pipette ကို အသုံးပြုပါ- 128 mM gluconate K၊ 10 mM KCl၊ 10 mM Hepes၊ 0.1 mM EGTA နှင့် 2 mM MgCl2၊ pH 7.2 သို့ ချိန်ညှိပါ (KOH ကို အသုံးပြု၍)။ ဆဲလ်အမြှေးပါး၏ မထိန်းချုပ်နိုင်သော စိမ့်ဝင်မှုကို ကာကွယ်ရန်အတွက် intracellular solution မှ ATP နှင့် GTP ကို ​​ချန်လှပ်ထားသည်။ punched patch မှတ်တမ်းရရှိရန် patch pipette ကို amphotericin ပါဝင်သော internal solution (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 200 မှ 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ဖြင့် ဖြည့်ထားသည်။ Amphotericin ကို dimethyl sulfoxide တွင် ပျော်ဝင်စေသည် (နောက်ဆုံးပါဝင်မှု- 0.1 မှ 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich)။ အသုံးပြုထားသော DMSO ၏ ပါဝင်မှုသည် လေ့လာထားသော အာရုံကြောဆဲလ်များအပေါ် သိသာထင်ရှားသော အကျိုးသက်ရောက်မှု မရှိပါ။ ထိုးဖောက်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း channel resistance (Ra) ကို အဆက်မပြတ်စောင့်ကြည့်ခဲ့ပြီး Ra ၏ amplitude နှင့် AP တည်ငြိမ်ပြီးနောက် (မိနစ် ၂၀-၄၀) စမ်းသပ်မှုကို စတင်ခဲ့သည်။ voltage နှင့်/သို့မဟုတ် current clamp တွင် ၂ မိနစ်မှ ၅ မိနစ်အထိ spontaneous activity ကို တိုင်းတာသည်။ Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) နှင့် GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)။ United States တို့ကို အသုံးပြု၍ data analysis ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ spontaneous AP များကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် IgorPro ၏ NeuroMatic v3.0c plug-in ကို အသုံးပြုသည်။ ပေးထားသော threshold ကို အသုံးပြု၍ AP များကို အလိုအလျောက် ဖော်ထုတ်ပြီး ၎င်းကို record တစ်ခုစီအတွက် တစ်ခုချင်းစီ ချိန်ညှိသည်။ spike interval ကို အသုံးပြု၍ အမြင့်ဆုံး instantaneous spike frequency နှင့် ပျမ်းမျှ spike frequency ရှိသော spike frequency ကို ဆုံးဖြတ်ပါ။
PN ခွဲထုတ်ခြင်း။ ယခင်ကထုတ်ဝေခဲ့သော protocol ကိုလိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် PN များကို မောက်စ် cerebellum မှ သတ်မှတ်ထားသောအဆင့်တွင် သန့်စင်ခဲ့သည် (58)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် cerebellum ကို ခွဲစိတ်ပြီး ရေခဲအေးသော ပြိုကွဲခြင်းအလတ်စား [HBSS Ca2+ နှင့် Mg2+ မပါဘဲ၊ 20 mM ဂလူးကို့စ်၊ ပင်နီဆီလင် (50 U/ml) နှင့် streptomycin (0.05 mg/ ml) ဖြင့်ဖြည့်စွက်ထားသည်] တွင် ကြိတ်ခွဲပြီးနောက် papain [HBSS၊ 1-cysteine·HCl (1 mg/ ml)၊ papain (16 U / ml) နှင့် deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml) ဖြင့်ဖြည့်စွက်ထားသည်] တွင် အလတ်စားကို ချေဖျက်သည်။ ပထမဦးစွာ ကြက်ဥအချွဲ (10 mg/ml)၊ BSA (10 mg/ml) နှင့် DNase (0.1 mg/ml) ပါဝင်သော HBSS အလတ်စားတွင် တစ်ရှူးများကို အခန်းအပူချိန်တွင် ဆေးကြောပြီး အင်ဇိုင်းများ အစာချေဖျက်ခြင်းကို ကာကွယ်ပါ။ ထို့နောက် 20 mM ဂလူးကို့စ်ပါဝင်သော HBSS အလတ်စားတွင် HBSS၊ ပင်နီဆီလင် (50 U/ml)၊ စထရပ်တိုမိုင်စင် (0.05 mg/ml) နှင့် DNase (0.1 mg/ml) တို့ကို ညင်သာစွာကြိတ်ခွဲခြင်းဖြင့် ဆဲလ်တစ်ခုတည်းကို ထုတ်လွှတ်ပါသည်။ ရရှိလာသော ဆဲလ်ဆိုင်းငံ့မှုကို 70μm ဆဲလ်စစ်စက်မှတစ်ဆင့် စစ်ထုတ်ပြီးနောက် ဆဲလ်များကို ဗဟိုခွာခြင်း (1110 rpm၊ ၅ မိနစ်၊ ၄°C) ဖြင့် အမှုန်အမွှားများဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ပြီး sorting medium [HBSS၊ 20 mM ဂလူးကို့စ်၊ 20% fetal bovine ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော HBSS) Serum၊ ပင်နီဆီလင် (50 U/ml) နှင့် စထရပ်တိုမိုင်စင် (0.05 mg/ml) ဖြင့် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး] sorting medium တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပါ။ propidium iodide ဖြင့် ဆဲလ်ရှင်သန်နိုင်မှုကို အကဲဖြတ်ပြီး ဆဲလ်သိပ်သည်းဆကို 1×106 မှ 2×106 ဆဲလ်/ml အထိ ချိန်ညှိပါ။ flow cytometry မတိုင်မီတွင်၊ suspension ကို 50 μm ဆဲလ်စိမ်ကိရိယာမှတစ်ဆင့် စစ်ထုတ်ခဲ့သည်။
Flow cytometer။ FACSAria III စက် (BD Biosciences) နှင့် FACSDiva software (BD Biosciences၊ version 8.0.1) ကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ်ခွဲခြားခြင်းကို ၄°C တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းစနစ်ကို 20 psi ဖိအားအောက်တွင် ~2800 events/sec နှုန်းဖြင့် 100 μm nozzle ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြားခဲ့သည်။ ရိုးရာ gating စံနှုန်းများ (ဆဲလ်အရွယ်အစား၊ bimodal discrimination နှင့် scattering ဝိသေသလက္ခဏာများ) သည် အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများမှ PN ကို မှန်ကန်စွာ ခွဲထုတ်နိုင်ခြင်းမရှိသောကြောင့်၊ gating ဗျူဟာကို mitoYFP+ ​​နှင့် control mitoYFP − ကြွက်များတွင် YFP ပြင်းထန်မှုနှင့် autofluorescence ကို တိုက်ရိုက်နှိုင်းယှဉ်ခြင်းအပေါ် အခြေခံ၍ သတ်မှတ်ထားသည်။ YFP သည် 488 nm laser line ဖြင့် နမူနာကို ဓါတ်ရောင်ခြည်ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပြီး signal ကို 530/30 nm band pass filter ကို အသုံးပြု၍ ထောက်လှမ်းသည်။ mitoYFP+ ​​ကြွက်များတွင် Rosa26-mitoYFP reporter gene ၏ relative strength ကို neuronal body နှင့် axon fragments များကို ခွဲခြားရန်လည်း အသုံးပြုသည်။ 7-AAD ကို 561 nm အဝါရောင်လေဆာဖြင့် လှုံ့ဆော်ပြီး ဆဲလ်သေများကို ဖယ်ထုတ်ရန် 675/20 nm bandpass filter ဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိသည်။ တစ်ချိန်တည်းတွင် astrocytes များကို ခွဲထုတ်ရန်အတွက် ဆဲလ်ဆိုင်းထိန်းစနစ်ကို ACSA-2-APC ဖြင့် ဆေးဆိုးပြီးနောက် နမူနာကို 640 nm လေဆာလိုင်းဖြင့် ဓါတ်ရောင်ခြည်ဖြင့် ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး အချက်ပြမှုကို ထောက်လှမ်းရန် 660/20 nm bandpass filter ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။
စုဆောင်းထားသောဆဲလ်များကို ဗဟိုခွာစက်ဖြင့် အမှုန်အမွှားများဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ပြီး (၁၁၁၀ rpm၊ ၅ မိနစ်၊ ၄°C) တွင် အသုံးမပြုမီ -၈၀°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ Mfn2cKO ကြွက်များနှင့် ၎င်းတို့၏ အသိုက်အမြုံပေါက်စများကို လုပ်ထုံးလုပ်နည်းဆိုင်ရာ ကွဲလွဲမှုကို လျှော့ချရန်အတွက် တစ်ရက်တည်းတွင် အမျိုးအစားခွဲခြားသည်။ FACS အချက်အလက်တင်ပြမှုနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို FlowJo ဆော့ဖ်ဝဲ (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
(59) အထက်တွင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ နောက်ဆက်တွဲ mtDNA ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းအတွက် စီထားသော နျူရွန်များမှ DNA ကို ခွဲထုတ်ရန် real-time PCR ကိုအသုံးပြုသည်။ linearity နှင့် threshold sensitivity ကို ဆဲလ်အရေအတွက်အမျိုးမျိုးတွင် qPCR ကို လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် ကနဦးစမ်းသပ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် 50 mM tris-HCl (pH 8.5)၊ 1 mM EDTA၊ 0.5% Tween 20 နှင့် proteinase K (200 ng/ml) တို့ပါဝင်သော lysis buffer တွင် PN ၃၀၀ ကိုစုဆောင်းပြီး 55°C တွင် ၁၂၀ မိနစ် incubate လုပ်ခဲ့သည်။ proteinase K ကို လုံးဝရပ်တန့်သွားစေရန် ဆဲလ်များကို 95°C တွင် ၁၀ မိနစ် ထပ်မံ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ mt-Nd1 အတွက် သီးသန့် TaqMan probe (Thermo Fisher) ကို အသုံးပြု၍ mtDNA ကို 7900HT Real-Time PCR စနစ် (Thermo Fisher Scientific) တွင် semi-quantitative PCR ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ သိပ္ပံ၊ ကတ်တလောက်နံပါတ် Mm04225274_s1)၊ mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific၊ ကတ်တလောက်နံပါတ် AIVI3E8) နှင့် 18S (Thermo Fisher Scientific၊ ကတ်တလောက်နံပါတ် Hs99999901_s1) မျိုးဗီဇများ။
ပရိုတီယိုမ်နမူနာပြင်ဆင်ခြင်း။ အရည်ကို ၉၅°C တွင် ၁၀ မိနစ်အပူပေးပြီး lysis buffer [6 M guanidine chloride၊ 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride၊ 10 mM chloroacetamide နှင့် 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets in HCl] တွင် sonicating လုပ်ခြင်းဖြင့်။ Bioruptor (Diagenode) တွင် ၁၀ မိနစ် (၃၀ စက္ကန့် pulse / ၃၀ စက္ကန့် pause period) ကြာအောင်ထားပါ။ နမူနာကို 20 mM tris-HCl (pH 8.0) တွင် ၁:၁၀ ရောစပ်ပြီး 300 ng trypsin gold (Promega) နှင့်ရောစပ်ကာ အစာခြေစနစ်အပြည့်အဝရရှိစေရန် 37°C တွင် တစ်ညလုံးထားခဲ့သည်။ ဒုတိယနေ့တွင် နမူနာကို 20,000 g တွင် ၂၀ မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခဲ့သည်။ supernatant ကို 0.1% formic acid ဖြင့်ရောစပ်ပြီး အရည်ကို ကိုယ်တိုင်ပြုလုပ်ထားသော StageTips ဖြင့် ဆားငန်ဓာတ်လျှော့ချခဲ့သည်။ နမူနာကို SpeedVac ကိရိယာ (Eppendorf concentrator plus 5305) တွင် ၄၅°C တွင် အခြောက်ခံပြီးနောက် peptide ကို 0.1% formic acid တွင် ဆိုင်းငံ့ထားသည်။ နမူနာအားလုံးကို လူတစ်ဦးတည်းက တစ်ပြိုင်နက်တည်း ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ astrocyte နမူနာများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် 4 μg desalted peptides များကို peptide နှင့် TMT reagent အချိုး 1:20 ဖြင့် tandem mass tag (TMT10plex၊ catalog number 90110၊ Thermo Fisher Scientific) ဖြင့် label လုပ်ထားသည်။ TMT labeling အတွက် TMT reagent 0.8 mg ကို anhydrous ACN 70 μl တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး အခြောက်ခံထားသော peptide ကို 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) 9 μl အဖြစ် ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းခဲ့ပြီး ACN တွင် TMT reagent 7 μl ကို ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ပါဝင်မှုမှာ 43.75% ဖြစ်သည်။ incubation မိနစ် ၆၀ ပြီးနောက် 5% hydroxylamine 2 μl ဖြင့် ဓာတ်ပြုမှုကို ငြိမ်းသတ်ခဲ့သည်။ အညွှန်းတပ်ထားသော peptide များကို စုဆောင်း၊ အခြောက်ခံ၊ 0.1% formic acid (FA) 200μl တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ပြီး နှစ်ပိုင်းခွဲကာ ကိုယ်တိုင်ပြုလုပ်ထားသော StageTips ကို အသုံးပြု၍ ဆားငန်ခြင်းကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) ကို အသုံးပြု၍ တစ်ဝက်စီအနက် တစ်ခုကို 130Å1.7μm C18 အမှုန်များဖြင့် ပြည့်နေသော 1mm x 150mm Acquity chromatographic column တွင် အပိုင်းခွဲခဲ့သည် (Waters၊ catalog No. SKU: 186006935)။ Thermo Fisher Scientific)။ peptide များကို 30μl/min စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် ခွဲထုတ်ပါ၊ 1% မှ 50% buffer B မှ 96 မိနစ်၏ stepwise gradient ဖြင့် 85 မိနစ်၊ 50% မှ 95% buffer B မှ 3 မိနစ်၊ ထို့နောက် 95% Buffer B အတွက် 8 မိနစ်။ ဘာဖာ A သည် 5% ACN နှင့် 10 mM အမိုးနီယမ် ဘိုင်ကာဗွန်နိတ် (ABC) ဖြစ်ပြီး ဘာဖာ B သည် 80% ACN နှင့် 10 mM ABC ဖြစ်သည်။ အပိုင်းအစများကို ၃ မိနစ်တိုင်း စုဆောင်းပြီး အုပ်စုနှစ်စု (1 + 17၊ 2 + 18 စသည်) ခွဲခြားကာ ဖုန်စုပ်စက်ဖြင့် အခြောက်ခံပါ။
LC-MS/MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ mass spectrometry အတွက်၊ peptides (နံပါတ် r119.aq) များကို 25 cm၊ 75 μm အတွင်းအချင်းရှိသော PicoFrit ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကော်လံ (new objective lens၊ အပိုင်းနံပါတ် PF7508250) တွင် ခွဲထုတ်ထားပြီး 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat)၊ Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germany) တပ်ဆင်ထားသည်။ ကော်လံကို 50°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ Buffers A နှင့် B များသည် ရေတွင် 0.1% formic acid နှင့် 80% ACN တွင် 0.1% formic acid အသီးသီးဖြစ်သည်။ Peptides များကို 6% မှ 31% buffer B မှ 65 မိနစ်နှင့် 31% မှ 50% buffer B မှ 200 nl/min ၏ gradient ဖြင့် 5 မိနစ် ခွဲထုတ်ထားသည်။ eluted peptides များကို Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ Peptide precursor m/z တိုင်းတာမှုကို 350 မှ 1500 m/z အတိုင်းအတာအတွင်း 120,000 resolution ဖြင့် လုပ်ဆောင်သည်။ 27% normalized collision energy ကိုအသုံးပြု၍ 2 မှ 6 charge state ရှိသော အခိုင်မာဆုံး precursor ကို high energy C trap dissociation (HCD) cleavage အတွက် ရွေးချယ်သည်။ cycle time ကို 1 s ဟု သတ်မှတ်ထားသည်။ peptide fragment ၏ m/z တန်ဖိုးကို ion trap တွင် 5×104 ၏ အသေးငယ်ဆုံး AGC target နှင့် အများဆုံး injection time 86 ms ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ fragmentation ပြုလုပ်ပြီးနောက် precursor ကို dynamic exclusion list တွင် 45 s ထားရှိခဲ့သည်။ TMT-တံဆိပ်ကပ်ထားသော peptides များကို 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap column (Thermo Fisher Scientific, catalog number 164942) တွင် ခွဲထုတ်ခဲ့ပြီး migration spectra များကို high-field asymmetric waveform ions (FAIMS) equipment (Thermo Fisher Scientific) တပ်ဆင်ထားသော Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး −50 နှင့် −70 V compensation voltages နှစ်ခုတွင် လည်ပတ်ပါသည်။ synchronization precursor ကိုအခြေခံ၍ ရွေးချယ်ထားသော MS3 ကို TMT report ion signal တိုင်းတာမှုအတွက် အသုံးပြုပါသည်။ peptide ခွဲထုတ်ခြင်းကို EASY-nLC 1200 တွင် 90% linear gradient elution ကို အသုံးပြု၍ 6% မှ 31% အထိ buffer concentration ရှိသည်။ buffer A သည် 0.1% FA ဖြစ်ပြီး buffer B သည် 0.1% FA နှင့် 80% ACN ရှိသည်။ analytical column ကို 50°C တွင် လည်ပတ်သည်။ FAIMS compensation voltage အရ မူရင်းဖိုင်ကို ပိုင်းခြားရန် FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) ကိုအသုံးပြုပါ။
ပရိုတင်း ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း။ ပေါင်းစပ်ထားသော Andromeda ရှာဖွေရေးအင်ဂျင်ကို အသုံးပြု၍ မူရင်းဒေတာကို MaxQuant ဗားရှင်း 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ Aequorea victoria မှရရှိသော Cre recombinase နှင့် YFP sequences များအပြင်၊ peptide fragment spectra များကို mouse reference proteome ၏ canonical sequence နှင့် isoform sequence အတွက် ရှာဖွေခဲ့သည် (Proteome ID UP000000589၊ ၂၀၁၇ ခုနှစ် မေလတွင် UniProt မှ ဒေါင်းလုဒ်လုပ်ခဲ့သည်)။ Methionine oxidation နှင့် protein N-terminal acetylation ကို variable modifications အဖြစ် သတ်မှတ်ထားသည်။ cysteine ​​​​carbamoyl methylation ကို fixed modifications အဖြစ် သတ်မှတ်ထားသည်။ digestion parameters များကို "specificity" နှင့် "trypsin/P" အဖြစ် သတ်မှတ်ထားသည်။ ပရိုတင်းခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုသော peptides နှင့် razor peptides အနည်းဆုံးအရေအတွက်မှာ 1 ဖြစ်သည်။ unique peptides အနည်းဆုံးအရေအတွက်မှာ 0 ဖြစ်သည်။ peptide map matching ၏အခြေအနေများတွင်၊ ပရိုတင်းခွဲခြားသတ်မှတ်မှုနှုန်းမှာ 0.01 ဖြစ်သည်။ "Second Peptide" option ကို enable လုပ်ထားသည်။ မတူညီသော မူရင်းဖိုင်များအကြား အောင်မြင်သော ခွဲခြားသတ်မှတ်မှုများကို လွှဲပြောင်းရန် “match between runs” ရွေးချယ်မှုကို အသုံးပြုပါ။ label-free quantification (LFQ) (60) အတွက် LFQ minimum ratio count 1 ကို အသုံးပြုပါ။ LFQ intensity ကို အနည်းဆုံး genotype အုပ်စုတစ်ခုတွင် အချိန်တိုင်းတွင် အနည်းဆုံး တရားဝင်တန်ဖိုးနှစ်ခုအတွက် စစ်ထုတ်ပြီး အကျယ် 0.3 ရှိသော normal distribution မှ extrapolated လုပ်ကာ 1.8 အောက်သို့ ရွှေ့သည်။ LFQ ရလဒ်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) နှင့် R (https://r-project.org/) ကိုအသုံးပြုပါ။ differential expression analysis အတွက် limma software package မှ two-way moderate t test ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (61)။ Exploratory data analysis ကို ggplot၊ FactoMineR၊ factoextra၊ GGally နှင့် pheatmap တို့ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်သည်။ TMT-based proteomics data ကို MaxQuant version 1.6.10.43 ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ၂၀၁၈ ခုနှစ် စက်တင်ဘာလတွင် ဒေါင်းလုဒ်လုပ်ခဲ့သော UniProt ၏ human proteomics database မှ ကုန်ကြမ်း proteomics data များကို ရှာဖွေပါ။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် ထုတ်လုပ်သူမှ ပံ့ပိုးပေးသော isotope purity correction factor ပါဝင်သည်။ differential expression analysis အတွက် R တွင် limma ကို အသုံးပြုပါ။ မူရင်းဒေတာ၊ database search results များနှင့် data analysis workflow နှင့် ရလဒ်များအားလုံးကို PRIDE partner repository မှတစ်ဆင့် data set identifier PXD019690 ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသည်။
လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ မှတ်ချက်များသည် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ကြွယ်ဝစေသည်။ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ကိရိယာကို ၈ ပတ်တွင် ဒေတာအစုံ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ မှတ်ချက်သတ်မှတ်ချက်များ၏ ကြွယ်ဝမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ ၁)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ ရရှိသော ပမာဏဆိုင်ရာ ပရိုတင်းစာရင်းကို အောက်ပါ filter criteria များဖြင့် အသုံးပြုသည်- Mus musculus ကို မျိုးစိတ်နှင့် နောက်ခံအဖြစ် ရွေးချယ်ပြီး အမျိုးအစားတွင် Benjamini မှ enrichment 0.05 သို့မဟုတ် ထို့ထက်နိမ့်သော ပမာဏအတွက် ချိန်ညှိထားသော P တန်ဖိုးကို သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆကြောင်း ပြသထားသည်။ ဤဂရပ်အတွက်၊ ချိန်ညှိထားသော P တန်ဖိုးအပေါ် အခြေခံ၍ cluster တစ်ခုစီရှိ ထိပ်တန်း အပိုအမျိုးအစားငါးမျိုးကို ပြသထားသည်။ Benjamini၊ Krieger နှင့် Yekutieli (Q = 5%) တို့၏ two-stage linear boost program ကိုအသုံးပြု၍ multiple t-test ကို အသုံးပြု၍ အမျိုးအစားတစ်ခုစီတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော အရေးကြီးသော candidates များအပေါ် time-course protein expression analysis ကို ပြုလုပ်ပြီး row တစ်ခုစီကို သီးခြားစီ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသည်။ တသမတ်တည်း SD ကို လက်ခံရန် မလိုအပ်ပါ။
ဤလေ့လာမှု၏ရလဒ်များကို ထုတ်ဝေထားသောဒေတာဘေ့စ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြီး ပုံ ၁ ရှိ Venn diagram ကိုထုတ်လုပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပမာဏဆိုင်ရာပရိုတင်းစာရင်းကို MitoCarta 2.0 annotations (24) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားပါသည်။ diagram ကိုထုတ်လုပ်ရန် online tool Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ကို အသုံးပြုပါ။
ပရိုတီအိုမစ်စ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အသုံးပြုသော စာရင်းအင်းလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအကြောင်း အသေးစိတ်အချက်အလက်များအတွက်၊ ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ၏ သက်ဆိုင်ရာ အပိုင်းကို ကြည့်ပါ။ အခြားစမ်းသပ်မှုအားလုံးအတွက်၊ အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို သက်ဆိုင်ရာ ဒဏ္ဍာရီတွင် ရှာဖွေနိုင်ပါသည်။ အခြားနည်းဖြင့် သတ်မှတ်ထားခြင်းမရှိပါက၊ အချက်အလက်အားလုံးကို ပျမ်းမျှ ± SEM အဖြစ် ဖော်ပြထားပြီး စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးကို GraphPad Prism 8.1.2 ဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ဤဆောင်းပါးအတွက် ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများအတွက် http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ကိုကြည့်ပါ။
ဤသည်မှာ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ၏ စည်းကမ်းချက်များအောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသော အခမဲ့ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုနိုင်သော ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ဖြစ်ပြီး မူရင်းလက်ရာသည် မှန်ကန်ကြောင်း အခြေခံအားဖြင့် နောက်ဆုံးအသုံးပြုမှုသည် စီးပွားဖြစ်အကျိုးအမြတ်အတွက် မဟုတ်သရွေ့ မည်သည့်မီဒီယာဖြင့်မဆို အသုံးပြုခြင်း၊ ဖြန့်ဖြူးခြင်းနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခြင်းကို ခွင့်ပြုထားသည်။ ကိုးကားချက်။
မှတ်ချက်- စာမျက်နှာသို့ သင်အကြံပြုထားသော ပုဂ္ဂိုလ်သည် သင်သည် အီးမေးလ်ကို မြင်စေလိုကြောင်းနှင့် ၎င်းသည် spam မဟုတ်ကြောင်း သိရှိစေရန်အတွက် သင့်အီးမေးလ်လိပ်စာကို ပေးရန်သာ ကျွန်ုပ်တို့ တောင်းဆိုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မည်သည့်အီးမေးလ်လိပ်စာကိုမျှ မရယူပါ။
ဒီမေးခွန်းကို သင်ဟာ လာရောက်လည်ပတ်သူ ဟုတ်မဟုတ် စမ်းသပ်ဖို့နဲ့ အလိုအလျောက် spam တင်သွင်းမှုကို ကာကွယ်ဖို့ အသုံးပြုပါတယ်။
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းသော အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ပရိုတီယိုမစ်စ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အစီအစဉ်များဟာ အာရုံကြောယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို တန်ပြန်ဖို့ အသက်ဝင်နေကြောင်း ဖော်ပြခဲ့ပါတယ်။
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
လုပ်ဆောင်ချက်ချို့ယွင်းသော အာရုံကြောဆဲလ်များ၏ ပရိုတီယိုမစ်စ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အစီအစဉ်များဟာ အာရုံကြောယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို တန်ပြန်ဖို့ အသက်ဝင်နေကြောင်း ဖော်ပြခဲ့ပါတယ်။
© 2020 သိပ္ပံတိုးတက်မှုအတွက် အမေရိကန်အသင်း။ မူပိုင်ခွင့်ကိုလက်ဝယ်ထားသည်။ AAAS သည် HINARI၊ AGORA၊ OARE၊ CHORUS၊ CLOCKSS၊ CrossRef နှင့် COUNTER ၏ ပါတနာဖြစ်သည်။ ScienceAdvances ISSN 2375-2548။