လက်ရှိ†လက်ရှိလိပ်စာ- OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
reaction center light-harvesting complex 1 (RC-LH1) သည် ခရမ်းရောင် phototrophic ဘက်တီးရီးယားများ၏ အဓိက photosynthetic အစိတ်အပိုင်းဖြစ်သည်။ Rhodopseudomonas palustris မှ RC-LH1 complex ၏ cryo-electron microscopy structures နှစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ မိတ်ဆက်ပေးခဲ့ပါသည်။ RC-LH114-W complex ၏ 2.65-Å resolution structure တွင် RC ကို ဝန်းရံထားသော subunit LH1 loops ၁၄ ခုပါဝင်ပြီး protein W မှ အနှောင့်အယှက်ပေးထားပြီး protein-W မပါဝင်သော complex မှာ RC မှ ဝန်းရံထားသော RC ဖွဲ့စည်းမှု အပြည့်အဝဖြစ်သည်။ closed 16 subunit LH1 loop။ ဤဖွဲ့စည်းပုံများကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် RC-LH1 complex ရှိ quinone ၏ ဒိုင်းနမစ်များ၊ RC QB site တွင် quinone ကို ချည်နှောင်သည့်အခါ ယခင်က မဆုံးဖြတ်ရသေးသော conformational ပြောင်းလဲမှုများနှင့် auxiliary quinone ချည်နှောင်သည့် sites များ၏ တည်နေရာအပါအဝင် ထိုးထွင်းသိမြင်မှုများကို ပေးစွမ်းသည်။ W protein ၏ ထူးခြားသောဖွဲ့စည်းပုံသည် LH1 loop ပိတ်ခြင်းကို ကာကွယ်ပေးပြီး quinone/quinolone ဖလှယ်မှုကို အရှိန်မြှင့်ရန် channel တစ်ခုကို ဖန်တီးပေးသည်။
အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဓာတ်ပြုခြင်းမှ ထောက်ပံ့ပေးသော စွမ်းအင်သည် ကမ္ဘာပေါ်ရှိ သက်ရှိအားလုံးနီးပါးကို ထောက်ပံ့ပေးနိုင်ပြီး နေရောင်ခြည် ဇီဝနည်းပညာအတွက် အလားအလာကောင်းများ ရှိပါသည်။ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဓာတ်ပြုခြင်းကို မြှင့်တင်ပေးနေစဉ်တွင် ခရမ်းရောင် အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဘက်တီးရီးယားများသည် စွမ်းအင်ပုံစံအမျိုးမျိုးနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်စွမ်းရည်များကိုလည်း ပြသကြသည်။ ၎င်းတို့သည် အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဓာတ်ပြုခြင်းကို ရှောင်ရှားနိုင်ပြီး မှောင်မိုက်ထဲတွင် heterotrophic ဘက်တီးရီးယားများအဖြစ် ကြီးထွားနိုင်သည်၊ နိုက်ထရိုဂျင်နှင့် ကာဗွန်ဒိုင်အောက်ဆိုဒ်ကို ပြုပြင်နိုင်သည်၊ ဟိုက်ဒရိုဂျင်ကို ထုတ်လုပ်နိုင်ပြီး အမွှေးနံ့သာဒြပ်ပေါင်းများကို ပြိုကွဲစေနိုင်သည် (1-3)။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်များအတွက် စွမ်းအင်ပေးစွမ်းနိုင်ရန်အတွက် အလင်းကို ဓာတုစွမ်းအင်အဖြစ် မြန်ဆန်ထိရောက်စွာ ပြောင်းလဲပေးရမည်။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် အလင်းထောင်ချောက် အင်တင်နာ ရှုပ်ထွေးမှုသည် အလင်းကို စုပ်ယူပြီး ပိတ်မိနေသော စွမ်းအင်ကို ဓာတ်ပြုမှုစင်တာ (RC) သို့ လွှဲပြောင်းပေးသောအခါ စတင်ပြီး အားသွင်းခွဲထုတ်ခြင်း (4 – 7) ကို စတင်သည်။ ခရမ်းရောင် အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဘက်တီးရီးယားများတွင် အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဓာတ်ပြုခြင်း၏ အခြေခံယူနစ်သည် အမျိုးအစား 2 RC ဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားပြီး အလင်းစုဆောင်းရေး ရှုပ်ထွေးမှု 1 (LH1) ဖြင့် ဝန်းရံထားပြီး RC-LH1 core ရှုပ်ထွေးမှုကို ဖွဲ့စည်းသည်။ LH1 ကို ကွေးညွှတ်နေသော αβ heterodimers အစုအဝေးဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားပြီး တစ်ခုချင်းစီသည် ဘက်တီးရီးယား ကလိုရိုဖီးလ် (BChl) a မော်လီကျူးနှစ်ခုနှင့် ကာရိုတီနွိုက် တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခု (8-12) ကို ချည်နှောင်ထားသည်။ အရိုးရှင်းဆုံး LH1 အင်တင်နာတွင် RC (9-13) ကို ဝိုင်းရံထားသော αβ heterodimers ၁၆ ခု သို့မဟုတ် ၁၇ ခုဖြင့် ပိတ်ထားသော ကွင်းဆက်တစ်ခုဖြင့် ပါဝင်သော်လည်း အခြား core complex များတွင် transmembrane peptides များသည် ပတ်ဝန်းကျင် LH1 ၏ ဖြစ်စဉ်ကို အနှောင့်အယှက်ပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် RC နှင့် cytochrome bc1 complex (11၊ 13-15) အကြား quinol/quinone ပျံ့နှံ့မှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်။ ခရမ်းရောင် phototrophic အပင် Rhodopseudomonas (Rps.) သည် photosynthesis ကို ပံ့ပိုးပေးသော စွမ်းအင်နှင့် အီလက်ထရွန်လွှဲပြောင်းမှုကို နားလည်နိုင်သော မော်ဒယ်သက်ရှိတစ်ခုဖြစ်သည်။ Rps ၏ ပထမဆုံး crystal structure။ palustris RC-LH1 complex ၏ မော်ဒယ်မှာ RC ဖြစ်ပြီး heterodimeric LH1 loops ၁၅ ခုဖြင့် ဝန်းရံထားပြီး “Protein W” (14) ဟုခေါ်သော အမည်မသိပရိုတိန်းတစ်ခုက အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ Protein-W ကို နောက်ပိုင်းတွင် RPA4402 အဖြစ် ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့ပြီး ၎င်းသည် ခန့်မှန်း transmembrane helices (TMH) သုံးခုပါရှိသော ထူးခြားမှုမရှိသော 10.5kDa ပရိုတိန်းတစ်ခုဖြစ်သည် (16)။ RC-L၊ M (pufL၊ pufM) နှင့် LH1α၊ β (pufA၊ pufB) မျိုးဗီဇခွဲယူနစ်များကို ကုဒ်သွင်းသည့် မျိုးဗီဇများအတွက် အသုံးပြုသည့် nomenclature နှင့် ကိုက်ညီစေရန် rpa4402 gene encoding protein W ကို pufW ဟု အမည်ပြောင်းရန် ကျွန်ုပ်တို့ အဆိုပြုပါသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ protein-W သည် RC-LH1 ၏ ၁၀% ခန့်တွင်သာ ရှိနေပြီး Rps. palustris သည် RC-LH1 complex နှစ်ခုကို ထုတ်လုပ်ကြောင်း ဖော်ပြပါသည်။ ဤနေရာတွင်၊ core complex နှစ်ခု၏ high-resolution cryo-EM (cryo-EM) ဖွဲ့စည်းပုံများကို ကျွန်ုပ်တို့ တင်ပြထားပါသည်။ တစ်ခုမှာ protein W နှင့် αβ heterodimers ၁၄ ခုပါရှိပြီး နောက်တစ်ခုမှာ protein W မပါဘဲ နှင့် closed 16 Heterodimer LH1 loop ပါရှိသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဖွဲ့စည်းပုံသည် Rps. palustris ၏ RC-LH1 complex ကို နားလည်မှုတွင် အဆင့်ဆင့်ပြောင်းလဲမှုကို ကိုယ်စားပြုသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ကျွန်ုပ်တို့သည် variant တစ်ခုစီ၏ homogeneous population ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားပြီး peptide နှင့် bound pigments များ၊ ဆက်စပ် lipids နှင့် quinones တစ်ခုချင်းစီကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း သတ်မှတ်ရန် လုံလောက်သော resolution ရှိသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ဤဖွဲ့စည်းပုံများကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်ခြင်းအားဖြင့် အခြား RC-LH1 complex တွင် ယခုအချိန်အထိ မတွေ့ရှိရသေးသော TMH proteins-W သုံးမျိုးသည် quinone/quinolone ဖလှယ်မှုကို အရှိန်မြှင့်ရန် quinone channel တစ်ခုကို ထုတ်ပေးသည်ကို ပြသသည်။ ထိန်းသိမ်းထားသော lipid နှင့် quinone ချည်နှောင်သည့်နေရာ အများအပြားကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပြီး quinone နှင့် RC ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် conformational change အသစ်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့ပြီး ၎င်းသည် oxygenated phototrophic organisms များ၏ photosystem II (PSII) RC အတွက် သင့်လျော်နိုင်ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များသည် purple phototrophic bacteria များ၏ RC-LH1 core complex တွင် quinone/quinolone ချည်နှောင်မှုနှင့် ဖလှယ်မှု၏ kinetics အတွက် အသိအမြင်အသစ်များကို ပေးစွမ်းသည်။
Rps. palustris တွင်တွေ့ရှိရသော complex နှစ်ခု၏ အသေးစိတ်လေ့လာမှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် RC-LH1 တစ်ခုချင်းစီကို ဇီဝဓာတုဗေဒနည်းလမ်းများဖြင့် ခွဲထုတ်ထားပါသည်။ ပရိုတင်း W-ချို့တဲ့သော complex (ယခုမှစ၍ ΔpufW ဟုရည်ညွှန်းသည်) ကို pufW မျိုးဗီဇမရှိသော strain မှ သန့်စင်ခဲ့သည် (16)၊ RC-LH1 complex တစ်ခုတည်းကိုသာ ထုတ်လုပ်နိုင်ပါသည်။ ပရိုတင်း W ပါဝင်သော complex ကို strain တစ်ခုမှ ထုတ်လုပ်သည်။ ဤ strain ၏ ပရိုတင်း W ကို ၎င်း၏ C-terminus တွင် 10x His tag ဖြင့် ပြုပြင်ထားသောကြောင့် ပရိုတင်း W ပါဝင်သော complex ကို သတ္တုကို မလှုပ်ရှားစေခြင်းဖြင့် ချို့တဲ့နေသော protein W အများစုနှင့် ထိရောက်စွာ ပေါင်းစပ်နိုင်သည်။ complex ကို ထိရောက်စွာ ခွဲထုတ်ထားသည် (16) Affinity Chromatography (IMAC).
ပုံ ၁ တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ complex နှစ်ခုလုံးတွင် LH1 အင်တင်နာဖြင့် ဝန်းရံထားသော sub-unit RC သုံးခု (RC-L၊ RC-M နှင့် RC-H) ပါရှိသည်။ protein-W ချို့တဲ့နေသော complex ၏ 2.80-A ဖွဲ့စည်းပုံတွင် αβ heterodimers ၁၆ ခုသည် RC ကို ဝန်းရံထားသော ပိတ်ထားသော LH1 loop တစ်ခုကို ဖွဲ့စည်းထားသည်ကို ပြသထားပြီး၊ ဤနေရာမှ RC-LH116 complex ဟုရည်ညွှန်းပါသည်။ protein-W ပါဝင်သော complex ၏ 2.65Å ဖွဲ့စည်းပုံတွင် protein-W မှ အနှောင့်အယှက်ပေးထားသော 14-heterodimer LH1 ရှိပြီး၊ ဤနေရာမှ RC-LH114-W ဟုရည်ညွှန်းပါသည်။
(A နှင့် B) ဒြပ်ပေါင်း၏ မျက်နှာပြင်ကိုယ်စားပြုမှု။ (C နှင့် D) ချောင်းများဖြင့် ဖော်ပြထားသော ချည်နှောင်ထားသော ရောင်ခြယ်ပစ္စည်းများ။ (E နှင့် F) ဆိုက်တိုပလာစမစ်မျက်နှာပြင်မှ တွေ့ရှိရသည့် ဒြပ်ပေါင်းများတွင် ကာတွန်းများတွင် ကိုယ်စားပြုထားသော peptides နှင့် LH1 subunits များရှိပြီး protein-W gap မှ နာရီလက်တံလည်ပတ်အတိုင်း နံပါတ်တပ်ထားသည် [Rba နံပါတ်နှင့် ကိုက်ညီသည်။ sphaeroides complex (13)]။ LH1-α အတွက်၊ ပရိုတင်း subunit ၏ အရောင်မှာ အဝါရောင်ဖြစ်သည်။ LH1-β အတွက်၊ ပရိုတင်း subunit ၏ အရောင်မှာ အပြာရောင်ဖြစ်သည်။ protein-W အတွက်၊ ပရိုတင်းသည် အနီရောင်ဖြစ်သည်။ RC-H အတွက်၊ ၎င်းသည် cyan ဖြစ်သည်။ RC-L အတွက်၊ ၎င်းသည် Orange ဖြစ်သည်။ RC-M အတွက်၊ magenta ဖြစ်သည်။ Cofactors များကို ချောင်းများဖြင့် ကိုယ်စားပြုပြီး အစိမ်းရောင်သည် BChl နှင့် BPh a မော်လီကျူးများကို ကိုယ်စားပြုပြီး ခရမ်းရောင်သည် carotenoids ကို ကိုယ်စားပြုပြီး အဝါရောင်သည် UQ10 မော်လီကျူးများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (G နှင့် H) RC-LH114-W complex (G) နှင့် RC-LH116 complex (H) ၏ ညီမျှသောဧရိယာရှိ protein-W gap ၏ ချဲ့ထားသောမြင်ကွင်း။ Cofactors များကို space filling ပုံစံဖြင့် ပြသထားပြီး၊ chelated quinone ကို အပြာရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။ protein-W gap ကို (G) ရှိ အပြာရောင် အစက်ချမျဉ်းဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားပြီး၊ LH116 ring ပေါ်ရှိ quinone/quinolol ပျံ့နှံ့သွားသည့် အပေါက်ငယ်များကို (H) ရှိ အနက်ရောင် အစက်ချမျဉ်းဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။
ပုံ ၁ (A နှင့် B) သည် LH1αβ heterodimers များ၏ ပွင့်လင်းသော သို့မဟုတ် ပိတ်ထားသော array များဖြင့် ဝန်းရံထားသော RC ကို ပြသထားပြီး၊ တစ်ခုချင်းစီသည် BChl နှစ်ခုနှင့် carotenoid တစ်ခုကို ချည်နှောင်ထားသည် (ပုံ ၁၊ C နှင့် D)။ ယခင်လေ့လာမှုများအရ Rps သည် LH1 complex ဖြစ်ကြောင်း ပြသထားသည်။ spirulina xanthin ၏ ဇီဝပေါင်းစပ်လမ်းကြောင်းတွင်၊ ဤမျိုးစိတ်များတွင် carotenoids ရောနှောနေသော လူဦးရေများ ပါဝင်သည် (17)။ သို့သော်၊ spiropyrroxanthin သည် အဓိက carotenoid ဖြစ်ပြီး ၎င်း၏သိပ်သည်းဆသည် ကျေနပ်ဖွယ်ကောင်းသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LH1 ချည်နှောင်သည့်နေရာအားလုံးတွင် spiroxanthin ကို ပုံစံပြုရန် ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ alpha နှင့် beta polypeptides များသည် အမြှေးပါးအပြင်ဘက်ဒေသတိုများပါရှိသော single TMHs များဖြစ်သည် (ပုံ ၁၊ A၊ B၊ E နှင့် F)။ C-terminus တွင် 17 residues ၏သိပ်သည်းဆကို မတွေ့ရှိရသော်လည်း၊ alpha polypeptide ကို complex နှစ်ခုလုံးတွင် Met1 မှ Ala46 သို့ ဖြတ်တောက်ခဲ့သည်။ β polypeptide ကို RC-LH116 တွင် Gly4 မှ Tyr52 သို့လည်းကောင်း၊ RC-LH114-W တွင် Ser5 မှ Tyr52 သို့လည်းကောင်း လျှော့ချခဲ့သည်။ N-terminal ၃ ခု သို့မဟုတ် ၄ ခု သို့မဟုတ် C-terminal residues ၁၃ ခု၏ သိပ်သည်းဆကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (ပုံ S1)။ wild-type strain မှ ပြင်ဆင်ထားသော ရောနှောထားသော RC-LH1 complex ၏ Mass spectrometry analysis အရ ပျောက်ဆုံးနေသော ဒေသသည် ဤ peptides များ၏ heterologous cleavage ၏ ရလဒ်ဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ S1 နှင့် S2)။ α-Met1 ၏ N-terminal formylation ကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (f)။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ α-peptide တွင် fMet1 မှ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 အထိ အကြွင်းအကျန်များ ပါဝင်ပြီး၊ β-peptide တွင် Ser2 မှ Ala53 အထိ အကြွင်းအကျန်များ ပါဝင်ကြောင်း၊ ၎င်းသည် အပူချိန်နိမ့် EM သိပ်သည်းဆမြေပုံနှင့် ကောင်းမွန်စွာ ကိုက်ညီပါသည်။
α-His29 နှင့် β-His36 တို့၏ ညှိနှိုင်းဆောင်ရွက်မှုသည် BChls များကို မျက်နှာချင်းဆိုင်ဖြစ်စေသည်။ αβ heterodimer တစ်ခုစီသည် ၎င်း၏အိမ်နီးချင်းများနှင့် စုစည်းပြီး RC The exciton coupled pigment array (ပုံ ၁၊ C နှင့် D) ပတ်လည်တွင် open loop (RC-LH114-W) သို့မဟုတ် closed loop (RC-LH116) ဖွဲ့စည်းသည်။ RC-LH114-W ၏ 877 nm band နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက RC-LH116 ၏ 880 nm absorption red shift သည် 3 nm (ပုံ ၂A) ဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ circular dichroism spectrum သည် အတူတူပင်ဖြစ်သည် (ပုံ ၂B)၊ open နှင့် closed loop များအကြား ရှင်းလင်းသော ကွာခြားချက်ရှိသော်လည်း BChls ၏ local environment သည် အလွန်ဆင်တူကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ absorption redshift သည် closed loop တွင် thermal motion လျော့နည်းခြင်းနှင့် တည်ငြိမ်မှုတိုးလာခြင်း (၁၈၊ ၁၉)၊ closed loop (၂၀၊ ၂၁) ကြောင့် pigment coupling ပြောင်းလဲမှု သို့မဟုတ် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုနှစ်ခုပေါင်းစပ်ခြင်း (၁၁) တို့၏ရလဒ်ဖြစ်နိုင်သည်။
(က) ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်/မြင်နိုင်သော/အနီအောက်ရောင်ခြည်အနီး စုပ်ယူမှုရောင်စဉ်၊ ၎င်းတို့၏ အထွတ်အထိပ်များကို ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ ရောင်ခြယ်ပစ္စည်းများဖြင့် အမှတ်အသားပြုပြီး 775 nm ရှိ BPh အထွတ်အထိပ်သို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ (ခ) 805 nm တွင် BChl စုပ်ယူမှုသို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသော စက်ဝိုင်း dichroism ရောင်စဉ်။ (ဂ နှင့် ဃ) RC-LH114-W ဒြပ်ပေါင်း (ဂ) နှင့် RC-LH116 ဒြပ်ပေါင်း (ဂ) ၏ အချိန်ဖြင့် ဖြေရှင်းထားသော စုပ်ယူမှုရောင်စဉ်မှ ရွေးချယ်ထားသော ΔA ရောင်စဉ်များ။ ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ နှိုင်းယှဉ်နိုင်စေရန်အတွက်၊ ရောင်စဉ်အားလုံးကို 0.2 ps တွင် −A ၏ ∆A သို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ (င) UQ2 ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုအမျိုးမျိုးရှိနေချိန်တွင် ဓါတ်ရောင်ခြည်ဖြင့် ထိတွေ့ပြီးနောက် cytochrome c2 အောက်ဆီဒေးရှင်းနှုန်း (ကုန်ကြမ်းဒေတာအတွက် ပုံ S8 ကိုကြည့်ပါ)။ (စ) အလင်းနည်း၊ အလတ်စား သို့မဟုတ် မြင့်မားသော အလင်းအောက်တွင် ကြီးထွားလာသောဆဲလ်များတွင်၊ ပရိုတင်း W နှင့် RC-L အောက်ယူနစ်များသည် သန့်စင်ထားသော ဒြပ်ပေါင်းနှင့် ခွဲထားသော အမြှေးပါးအချိုးတွင် ရှိသည်။ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis နှင့် immunoassay ဖြင့် ပရိုတင်းအဆင့်ကို ဆုံးဖြတ်ပါ (ကုန်ကြမ်းဒေတာအတွက် ပုံ S9 ကိုကြည့်ပါ)။ သန့်စင်ထားသော RC-LH114-W complex နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည့်အချိုးကို ဆုံးဖြတ်ပါ။ complex ၏ RC-L နှင့် protein-W ၏ stoichiometric အချိုးမှာ 1:1 ဖြစ်သည်။
RC-LH114-W ၏ ပုံပျက်နေသော αβ14 ကွင်းဆက်တွင် အနေအထား 1 ရှိ BChls (ပုံ 1၊ A၊ C နှင့် E) သည် RC-LH116 ရှိ ညီမျှသော BChls များထက် RC primary donor (P) နှင့် 6.8Å ပိုမိုနီးကပ်သည် (ပုံ 1၊ B၊ D နှင့် F နှင့် ပုံ S3)။ သို့သော်၊ complex နှစ်ခု၏ transient absorption kinetics က RC-LH114-W နှင့် RC-LH116 အတွက်၊ LH1 မှ RC သို့ excitation energy transfer time constants များသည် 40 ±4 နှင့် 44±3 ps ဖြစ်သည် (ပုံ 2)။ RC အတွင်း electronic transfer တွင်လည်း သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်မရှိပါ (ပုံ S5 နှင့် ဆက်စပ်သော ဖြည့်စွက်စာသား)။ LH1 နှင့် RC-P အကြား energy transfer time ၏ အနီးကပ်ဆက်စပ်မှုသည် LH1 ကွင်းဆက်နှစ်ခုရှိ BChl အများစု၏ အကွာအဝေး၊ ထောင့်နှင့် potential energy အလားတူကြောင့်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ သံသယရှိသည်။ အနိမ့်ဆုံးအကွာအဝေးသို့ရောက်ရှိရန် LH1 စွမ်းအင်ပုံစံကို စူးစမ်းလေ့လာခြင်းသည် အကောင်းဆုံးမဟုတ်သောနေရာများမှ RC သို့ တိုက်ရိုက်စွမ်းအင်လွှဲပြောင်းခြင်းထက် မမြန်ဟုထင်ရသည်။ RC-LH114-W ရှိ open-loop LH1 loop သည် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အပူချိန်နိမ့်အခြေအနေများအောက်တွင်လည်း အပူလှုပ်ရှားမှုအနည်းငယ်သာ ကြုံတွေ့ရနိုင်ပြီး RC 1 ၏နေရာရှိ βBChls ၏ pigmentation အကွာအဝေးမှ အခန်းအပူချိန်တွင် αβ14 ring ပုံသဏ္ဍာန် ပိုရှည်သည်။
RC-LH116 ကွန်ပလက်စ်တွင် BChls ၃၂ ခုနှင့် carotenoids ၁၆ ခုပါဝင်ပြီး ၎င်း၏ အလုံးစုံအစီအစဉ်သည် Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) နှင့် အစိမ်းရောင်ရေညှိ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) မှရရှိသော အစီအစဉ်နှင့် အတူတူပင်ဖြစ်သည်။ ချိန်ညှိပြီးနောက်၊ αβ heterodimers များ၏ နေရာများတွင် အထူးသဖြင့် 1-5၊ 15 နှင့် 16 (ပုံ S6) တွင် အနည်းငယ်သာ သွေဖည်မှုများကို တွေ့ရှိရသည်။ ပရိုတင်း-W ရှိနေခြင်းသည် LH1 ၏ဖွဲ့စည်းပုံအပေါ် သိသာထင်ရှားသော သက်ရောက်မှုရှိသည်။ ၎င်း၏ TMH သုံးခုကို ကွင်းတိုများဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး ကွန်ပလက်စ်၏ lumen ဘက်တွင် N-terminal နှင့် cytoplasmic ဘက်တွင် C-terminal ရှိသည် (ပုံ 1A နှင့် 3၊ A မှ D)။ ပရိုတင်း-W သည် အများအားဖြင့် hydrophobic ဖြစ်သည် (ပုံ 3B)၊ TMH2 နှင့် TMH3 တို့သည် LH1αβ-14 နှင့် ဓာတ်ပြုပြီး transmembrane မျက်နှာပြင်ကို ဖွဲ့စည်းသည် (ပုံ 3၊ B နှင့် E မှ G)။ interface သည် transmembrane ဒေသရှိ Phe၊ Leu နှင့် Val residues များဖြင့် အဓိကဖွဲ့စည်းထားသည်။ ဤ residues များကို hydrophobic amino acids နှင့် αβ-14 pigment များဖြင့် စီထားသည်။ အချို့သော polar residues များသည်လည်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုတွင် ပါဝင်ပြီး၊ complex cavity ၏ မျက်နှာပြင်ပေါ်ရှိ W-Thr68 နှင့် β-Trp42 အကြား hydrogen bond အပါအဝင် (ပုံ 3၊ F နှင့် G)။ cytoplasm ၏ မျက်နှာပြင်တွင် Gln34 သည် αβ-14 carotenoids ၏ keto အုပ်စုနှင့် ကပ်လျက်ရှိသည်။ ထို့အပြင်၊ n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) မော်လီကျူးကို ပျော်ဝင်စေပြီး ၎င်း၏ hydrophobic အမြီးသည် protein-W နှင့် αβ-14 အကြား မျက်နှာပြင်သို့ ဆန့်ထွက်သွားပြီး lipid အမြီးသည် ခန္ဓာကိုယ်တွင် ရှိနိုင်သည်။ ပရိုတင်း W နှင့် RCH ၏ C-terminal resolution ဒေသများသည် အလွန်နီးကပ်သော်လည်း သီးခြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများ ဖွဲ့စည်းနိုင်သည့် အတိုင်းအတာအတွင်း မရှိကြောင်းကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ သတိပြုမိပါသည် (ပုံ ၁၊ A နှင့် E)။ သို့သော် ဤပရိုတင်းနှစ်ခု၏ မဖြေရှင်းရသေးသော C-terminal အမိုင်နိုအက်ဆစ်များတွင် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများရှိနိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် RC-LH114-W complex စုစည်းစဉ်အတွင်း ပရိုတင်း-W စုဆောင်းမှုအတွက် ယန္တရားတစ်ခုကို ပံ့ပိုးပေးနိုင်ပါသည်။
(က) ကာတွန်းပုံစံဖြင့် LH1αβ14 နှင့် မျက်နှာပြင်ကို မျက်နှာမူထားသော ပရိုတင်း-W တွင် တုတ်ပုံသဏ္ဍာန် ဘေးတိုက်ကွင်းဆက် (အနီရောင်) ရှိပြီး electrostatic potential ပုံကြမ်း၏ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုတွင် ပြသထားသည် (contour level 0.13 ရှိသော ပွင့်လင်းမြင်သာသော မီးခိုးရောင်မျက်နှာပြင်)။ (ခ) hydrophobic အရောင်မျက်နှာပြင်ဖြင့် ကိုယ်စားပြုသော ပရိုတင်း-W။ ဝင်ရိုးစွန်းနှင့် အားသွင်းထားသော ဧရိယာများကို စိမ်းပြာရောင်ဖြင့် ပြသထားပြီး hydrophobic ဧရိယာများကို အဖြူရောင်ဖြင့် ပြသထားပြီး hydrophobic ဧရိယာများကို လိမ္မော်ရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။ (ဂ နှင့် ဃ) ကာတွန်းတွင် ကိုယ်စားပြုထားသော ပရိုတင်း-W သည် ၎င်း၏ ဦးတည်ချက်သည် (က) (ဂ) တွင်နှင့် အတူတူပင်ဖြစ်ပြီး 180° ဖြင့် လှည့်ထားသည် (ဃ)။ အစီအစဉ်တွင် အနေအထားအရ၊ ခွဲခြားနိုင်သော အကြွင်းအကျန်များသည် သက်တံ့ရောင်ပုံစံကို လက်ခံကျင့်သုံးပြီး N-terminal သည် အပြာရောင်ဖြစ်ပြီး C-terminal သည် အနီရောင်ဖြစ်သည်။ (င) (ဂ) တွင်ကဲ့သို့ တူညီသောမြင်ကွင်းတွင် ပရိုတင်း-W နှင့် protein-W:LH1 ၏ မျက်နှာပြင်ရှိ အကြွင်းအကျန်များကို ပူးတွဲအမှတ်အသားများပါသော တုတ်များဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်။ (F) ကာတွန်းပုံတွင် (E) နှင့် LH1αβ14 နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် 90° လှည့်ထားပြီး၊ ဘားပုံတွင် interface residues များနှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင်လည်း လှည့်ထားသည်။ beta polypeptide မှ အပြင်ဘက်သို့ ဖုံးအုပ်ထားသော residues များကို label လုပ်ထားသည်။ cofactor ကို ပုံ 1 ၏ အရောင်နှင့် ကိုက်ညီသော bar အဖြစ် ပြသထားပြီး၊ ပြိုကွဲသွားသော β-DDM ကို မီးခိုးရောင်ဖြင့် ပြသထားပြီး၊ အောက်ဆီဂျင်ကို အနီရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။ (G) (F) ရှိ မြင်ကွင်းကို label လုပ်ထားသော alpha polypeptide ၏ ထင်ရှားသော residues များနှင့်အတူ 180° လှည့်ထားသည်။
Protein-W သည် αβ heterodimer (ပုံ ၁F ရှိ ၁၅ ခုမြောက်) ကို အစားထိုးပြီး loop ပိတ်ခြင်းကို ကာကွယ်ပေးကာ ပထမဆုံး αβ heterodimer သုံးခုကို စောင်းစေပါသည်။ film normal နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပထမဆုံး αβ-1 heterodimer ၏ အမြင့်ဆုံး စောင်းထောင့်မှာ ၂၅° မှ ၂၉° (ပုံ ၁၊ A နှင့် E) ဖြစ်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းကို RC A ထက်မြက်သော contrast-LH116 (ပုံ ၁၊ B နှင့် F) ရှိ αβ-1 ၏ ၂° မှ ၈° စောင်းခြင်းဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်ကို တွေ့ရှိရပါသည်။ ဒုတိယနှင့် တတိယ heterodimer များသည် အသီးသီး ၁၂° မှ ၂၂° နှင့် ၅° မှ ၁၀° စောင်းနေပါသည်။ RC ၏ steric hindrance ကြောင့် αβ-1 ၏ စောင်းတွင် αβ ၏ ဒုတိယအတွဲ မပါဝင်ပါ (ပုံ ၁F ရှိ ၁၆ ခုမြောက် αβ နှင့် ကိုက်ညီပါသည်)၊ ထို့ကြောင့် LH1 ring တွင် ရှင်းလင်းသော ကွာဟချက်တစ်ခု ဖန်တီးပေးသည် (ပုံ ၁၊ A နှင့် E)။ αβ heterodimers နှစ်ခုမရှိခြင်း၊ BChl လေးခုနှင့် carotenoids နှစ်ခုဆုံးရှုံးမှုကြောင့် carotenoids များသည် လိမ်ကောက်နေသော αβ-1 subunit နှင့် မချိတ်ဆက်ဘဲ Vegetarian carotenoids ၁၃ ခုနှင့် BChls ၂၈ ခုပါရှိသော LH114-W ring ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ αβ1 မှ 7 ဒေသများရှိ complex နှစ်ခု၏ local resolution ခန့်မှန်းချက်များသည် LH1 loop ၏ ကျန်ဒေသများထက် နိမ့်ကျနေပြီး ၎င်းသည် RC QB site နှင့် ကပ်လျက် LH1 subunit ၏ inherent plasticity ကို ထင်ဟပ်စေနိုင်ပါသည် (ပုံ ၄)။
RC-LH114-W (A နှင့် B) နှင့် RC-LH116 (C နှင့် D) တို့၏ ပုံများကို အပေါ်စီး/ဘေးတိုက် မြင်ကွင်း (A နှင့် B) (A နှင့် C) နှင့် ပုံ ၁ (B နှင့် D) ရှိ အခေါင်းပေါက် မျက်နှာပြင် တစ်ခုတည်းမှ ပြသထားသည်။ အရောင်ခလုတ်များကို ညာဘက်တွင် ပြသထားသည်။
1:14 အချိုးရှိသော တစ်ခုတည်းသော stoichiometric အချိုးရှိသော အခြားလက္ခဏာ core complex မှာ Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13) ဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ ပရိုတိန်း W နှင့် PufX တွင် ထင်ရှားသော homology မရှိဘဲ ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ LH1 ဖွဲ့စည်းပုံများအပေါ် သိသာထင်ရှားသော သက်ရောက်မှုရှိသည်။ PufX သည် N-terminal cytoplasmic domain ရှိသော single TMH တစ်ခုဖြစ်ပြီး၊ Rps. palustris LH116αβ-16 နှင့် ကိုက်ညီသော အနေအထားတွင် RC-H subunit (13) ၏ cytoplasmic side နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိသည်။ PufX သည် RC-LH1 နှင့် cytochrome bcl complex အကြား quinone/quinolone ဖလှယ်မှုအတွက် channel တစ်ခုကို ဖန်တီးပေးပြီး Rba. sphaeroides core complex (13) အားလုံးတွင် ရှိနေပါသည်။ monomer-monomer interface သည် Rba တွင် ရှိသော်လည်း။ sphaeroides RC-LH1-PufX dimer သည် RC-LH114-W ရှိ ပရိုတင်း W ၏ ချည်နှောင်မှုနေရာတွင် တည်ရှိပြီး PufX နှင့် ပရိုတင်း-W မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော ကွာဟချက်သည် ညီမျှသော အနေအထားတွင် ရှိသည် (ပုံ S7A)။ RC-LH114-W ရှိ ကွာဟချက်သည် Pseudomonas rosea LH1 ၏ ယူဆချက်ဆိုင်ရာ quinone channel (8) နှင့်လည်း ချိန်ညှိထားပြီး၊ ၎င်းကို ပရိုတင်း W သို့မဟုတ် PufX နှင့် မသက်ဆိုင်သော peptides များဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသည် (ပုံ S7B)။ ထို့အပြင်၊ Blc ရှိ quinone channel။ γ subunit (7) တစ်ခုကို ဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် ဖွဲ့စည်းထားသော emerald green LH1 သည် အလားတူ အနေအထားတွင် ရှိသည် (ပုံ S7C)။ မတူညီသော ပရိုတင်းများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်သော်လည်း၊ RC-LH1 complex ရှိ ဘုံအနေအထားတွင် ဤ quinone/quinolol channels များ ပေါ်လာခြင်းသည် convergent evolution ၏ ဥပမာတစ်ခုဖြစ်ပုံရပြီး ပရိုတင်း W မှ ဖန်တီးထားသော ကွာဟချက်သည် quinone channel အဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
LH114-W ကွင်းဆက်ရှိ ကွာဟချက်သည် ပရိုတင်းများကဲ့သို့ ပရိုတင်းအပေါက်မှတစ်ဆင့် ဒိုမိန်းနှစ်ခုကို ချိတ်ဆက်မည့်အစား RC-LH114-W ကွန်ပလက်စ်နှင့် အစုအဝေးအမြှေးပါး၏ အတွင်းပိုင်းနေရာအကြားတွင် စဉ်ဆက်မပြတ်အမြှေးပါးဒေသတစ်ခု ဖွဲ့စည်းနိုင်စေသည် (ပုံ 1G)။ RC-LH116 ကွန်ပလက်စ်သည် ပိတ်ထားသော Tch. အပ်ကဲ့သို့သော ကွန်ပလက်စ် (22) နှင့် ဆင်တူသည် (ပုံ 1H)။ အမြှေးပါးမှတစ်ဆင့် quinone ပျံ့နှံ့မှုသည် ကျဉ်းမြောင်းသော ပရိုတင်းချန်နယ်မှတစ်ဆင့် ပျံ့နှံ့မှုထက် ပိုမိုမြန်ဆန်သောကြောင့်၊ ပွင့်နေသော LH114-W ကွင်းဆက်သည် ပိတ်ထားသော LH116 ကွင်းဆက်ထက် RC လည်ပတ်မှု ပိုမိုမြန်ဆန်စေပြီး RC ထဲသို့ quinone ပျံ့နှံ့မှုကို ပိုမိုကန့်သတ်ထားနိုင်သည်။ ပရိုတင်း W သည် RC မှတစ်ဆင့် quinone များပြောင်းလဲခြင်းကို သက်ရောက်မှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ ubiquinone 2 (UQ2) ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုပေါ်တွင် cytochrome oxidation assay ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့သည် (isoprene အမြီးတိုသော သဘာဝ UQ10 ၏ analogue တစ်ခု) (ပုံ 2E)။ chelated quinone ရှိနေခြင်းက ထင်ရှားသော Michaelis constant (RC-LH114-W နှင့် RC-LH116 တို့သည် 0.2±0.1μM နှင့် 0.5±0.2μM အသီးသီးအတွက် သင့်လျော်သည်) ၏ အမြင့်ဆုံးနှုန်းသည် RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ထက် 28±5% ပိုကြီးပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် အစပိုင်းတွင် ပရိုတင်း-W သည် core complex (16) ၏ 10% ခန့်တွင် ရှိနေသည်ဟု ခန့်မှန်းခဲ့သည်။ ဤနေရာတွင် အလင်းနည်းသောဆဲလ်၊ အလင်းအလတ်စားဆဲလ်နှင့် အလင်းမြင့်သောဆဲလ်များ၏ occupancy rates များသည် 15±0.6%၊ 11±1% နှင့် 0.9±0.5 အသီးသီး % (ပုံ 2F) ဖြစ်သည်။ mass spectrometry ၏ ပမာဏဆိုင်ရာ နှိုင်းယှဉ်ချက်အရ histidine tag ထည့်သွင်းခြင်းသည် wild-type strains များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက protein-W ၏ relative opportunity ကို မလျှော့ချနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည် (P = 0.59)၊ ထို့ကြောင့် ဤအဆင့်များသည် modified protein-W ၏ artifact မဟုတ်ပါ (ပုံ S10)။ သို့သော် RC-LH1 complex ရှိ protein-W ၏ ဤ occupancy နည်းပါးခြင်းသည် RC အချို့အား အရှိန်မြှင့်နှုန်းဖြင့် flip လုပ်စေပြီး RC-LH116 complex ရှိ quinone/quinolone ဖလှယ်မှု နှေးကွေးခြင်းကို လျော့ပါးစေသည်။ အလင်းမြင့်သောဆဲလ် occupancy rate သည် မကြာသေးမီက transcriptomics data နှင့် မကိုက်ညီကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သတိပြုမိခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် အလင်းပြင်းသောအောက်တွင် pufW gene expression တိုးလာကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ S11) (23)။ pufW ကူးယူခြင်းနှင့် RC-LH1 complex ထဲသို့ protein-W ထည့်သွင်းခြင်းကြား ကွာခြားချက်သည် ရှုပ်ထွေးပြီး ပရိုတင်း၏ ရှုပ်ထွေးသော ထိန်းညှိမှုကို ထင်ဟပ်စေနိုင်သည်။
RC-LH114-W တွင်၊ cardiolipin (CDL) ၆ ခု၊ phosphatidylcholine (POPC) ၇ ခု၊ ​​phosphatidylglycerol (POPG) ၁ ခု နှင့် β-DDM မော်လီကျူး ၂၉ ခုကို ၎င်းတွင် ခွဲဝေပြီး ပုံစံထုတ်ထားသည်။ RC-LH116 (ပုံ ၅၊ A နှင့် B)။ ဤဖွဲ့စည်းပုံနှစ်ခုတွင်၊ CDL သည် complex ၏ cytoplasmic ဘက်ခြမ်းတွင် နီးပါးတည်ရှိပြီး POPC၊ POPG နှင့် β-DDM များသည် luminal ဘက်ခြမ်းတွင် အများအားဖြင့်တည်ရှိသည်။ RC-LH114-W complex ၏ αβ-1 မှ αβ-6 ဒေသတွင် lipid နှင့် detergent မော်လီကျူးနှစ်ခုကို ခွဲထုတ်ထားသည် (ပုံ ၅A) နှင့် RC-LH116 ၏ equivalent region တွင် ငါးခုကို ခွဲထုတ်ထားသည် (ပုံ ၅B)။ ရှုပ်ထွေးမှု၏ အခြားတစ်ဖက်တွင် RC နှင့် αβ-7 မှ αβ-13 အကြား စုပုံနေသော lipid များ၊ အဓိကအားဖြင့် CDL များကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါသည် (ပုံ ၅၊ A နှင့် B)။ အခြားသော ဖွဲ့စည်းပုံအရ ပြေလည်သွားသော lipid များနှင့် အဝတ်လျှော်ဆပ်ပြာများသည် LH1 ring ၏ အပြင်ဘက်တွင် တည်ရှိပြီး ကောင်းစွာပြေလည်သွားသော acyl chain များသည် LH1 subunits များအကြား ပျံ့နှံ့သွားပြီး RC-LH114-W တွင် β-DDM အဖြစ် ယာယီသတ်မှတ်ထားပြီး β-DDM နှင့် POPC-LH116 ရောစပ်ထားသော RC တွင် β-DDM အဖြစ် သတ်မှတ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဖွဲ့စည်းပုံတွင် chelating lipid များနှင့် အဝတ်လျှော်ဆပ်ပြာများ၏ အလားတူနေရာများက ၎င်းတို့သည် ဇီဝကမ္မဗေဒအရ သက်ဆိုင်ရာ ချည်နှောင်သည့်နေရာများဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ S12A)။ Tch ရှိ ညီမျှသောမော်လီကျူးများ၏ နေရာများသည်လည်း ကောင်းမွန်သော တသမတ်တည်းရှိသည်။ Gentle နှင့် Trv။ မျိုးကွဲ 970 RC-LH1s (ပုံ S12၊ B မှ E) (9၊ 12) နှင့် lipid head အုပ်စု၏ hydrogen-bonding residues များသည် sequence alignment တွင် အတော်လေး ကောင်းမွန်သော ထိန်းသိမ်းမှုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ S13)၊ RC နှင့် ချိတ်ဆက်သော Conserved CDL (24)၊ ဤနေရာများကို RC-LH1 complex တွင် ထိန်းသိမ်းနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
(A နှင့် B) RC-LH114-W (A) နှင့် RC-LH116 (B) peptide များကို ကာတွန်းများဖြင့် ကိုယ်စားပြုပြီး pigment များကို ပုံ ၁ ရှိ အရောင်ပေါင်းစပ်မှုကို အသုံးပြု၍ rod များဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်။ Lipids များကို အနီရောင်ဖြင့် ပြသထားပြီး detergents များကို မီးခိုးရောင်ဖြင့် ပြသထားသည်။ RC QA နှင့် QB နေရာများနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော UQ သည် အဝါရောင်ဖြစ်ပြီး သီးခြား UQ သည် အပြာရောင်ဖြစ်သည်။ (C နှင့် D) lipids များကို ချန်လှပ်ထားသော (A) နှင့် (B) ကဲ့သို့ မြင်ကွင်းများဖြစ်သည်။ (E မှ G) RC-LH116 မှ Q1(E)၊ Q2(F) နှင့် Q3(G) ၏ ချဲ့ထားသော မြင်ကွင်းတွင် တစ်ခုနှင့်တစ်ခု လွှမ်းမိုးသော ဘေးချင်းကွင်းဆက်များ ပါရှိသည်။ ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို အနက်ရောင် အစက်ချမျဉ်းများအဖြစ် ပြသထားသည်။
RC-LH116 တွင်၊ အားသွင်းခွဲထုတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တွင် အီလက်ထရွန်လွှဲပြောင်းမှုတွင်ပါဝင်သော RC QA နှင့် QB UQ နှစ်မျိုးလုံးကို ၎င်းတို့၏ ချည်နှောင်သည့်နေရာများတွင် ပြိုကွဲစေသည်။ သို့သော် RC-LH114-W တွင် QB quinone ကို မဖြေရှင်းရသေးဘဲ အောက်တွင် အသေးစိတ်ဆွေးနွေးပါမည်။ QA နှင့် QB quinones များအပြင်၊ chelated UQ မော်လီကျူးနှစ်ခု (RC နှင့် LH1 ကွင်းများကြားတွင်တည်ရှိသည်) ကို ၎င်းတို့၏ ကောင်းမွန်စွာဖြေရှင်းထားသော ဦးခေါင်းအုပ်စုများ (Q1 နှင့် Q2 တွင်အသီးသီးတည်ရှိသည်) အလိုက် RC-LH114-W ဖွဲ့စည်းပုံတွင် ခွဲဝေပေးထားသည်။ (ပုံ 5C)။ isoprene ယူနစ်နှစ်ခုကို Q1 သို့ သတ်မှတ်ပေးပြီး၊ သိပ်သည်းဆမြေပုံသည် Q2 ၏ isoprene အမြီး ၁၀ ခုလုံးကို ဖြေရှင်းပေးသည်။ RC-LH116 ၏ဖွဲ့စည်းပုံတွင်၊ chelated UQ10 မော်လီကျူးသုံးခု (Q1 မှ Q3၊ ပုံ 5D) ကို ဖြေရှင်းပြီး မော်လီကျူးအားလုံးသည် အမြီးတစ်လျှောက်တွင် ရှင်းလင်းသောသိပ်သည်းဆရှိသည် (ပုံ 5၊ D မှ G)။ ဖွဲ့စည်းပုံနှစ်ခုတွင်၊ Q1 နှင့် Q2 ၏ quinone ဦးခေါင်းအုပ်စုများ၏ အနေအထားများသည် အလွန်ကောင်းမွန်သော တသမတ်တည်းရှိမှုရှိပြီး (ပုံ S12F)၊ ၎င်းတို့သည် RC နှင့်သာ အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိသည်။ Q1 သည် RC-LH114-W (ပုံ 1G နှင့် 5၊ C၊ D နှင့် E) ၏ W gap ၏ ဝင်ပေါက်တွင် တည်ရှိပြီး Q2 သည် QB ချည်နှောင်သည့်နေရာအနီးတွင် တည်ရှိသည် (ပုံ 5၊ C၊ D) နှင့် F)။ ထိန်းသိမ်းထားသော L-Trp143 နှင့် L-Trp269 အကြွင်းအကျန်များသည် Q1 နှင့် Q2 နှင့် အလွန်နီးကပ်ပြီး π-stacking အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု အလားအလာကို ပေးစွမ်းသည် (ပုံ 5၊ E နှင့် F နှင့် ပုံ S12)။ L-Gln88၊ Q1 ၏ distal oxygen မှ 3.0 Å သည် ခိုင်မာသော ဟိုက်ဒရိုဂျင် နှောင်ကြိုးကို ပေးစွမ်းသည် (ပုံ 5E)။ ဤအကြွင်းအကျန်ကို အဝေးဆုံး ဆက်နွယ်မှုမှလွဲ၍ RC အားလုံးတွင် ထိန်းသိမ်းထားသည် (ပုံ S13)။ L-Ser91 ကို အခြား RC အများစုတွင် Thr အတွက် ကွန်ဆာဗေးတစ်နည်းဖြင့် အစားထိုးထားသည် (ပုံ S13)၊ Q1 ၏ မီသိုင်းအောက်ဆီဂျင်မှ 3.8 အန်စထရွမ်ရှိပြီး အားနည်းသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို ပေးစွမ်းနိုင်သည် (ပုံ 5E)။ Q3 သည် သီးခြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု မရှိပုံရသော်လည်း RC-M subunit နှင့် LH1-α subunit 5 မှ 6 အကြားရှိ hydrophobic ဧရိယာတွင် တည်ရှိသည် (ပုံ 5၊ D နှင့် G)။ Q1၊ Q2 နှင့် Q3 သို့မဟုတ် အနီးအနားရှိ chelated quinones များကိုလည်း Tch. Gentle၊ Trv. Strain 970 နှင့် Blc တို့တွင် ဖြေရှင်းပြီးဖြစ်သည်။ iris ဖွဲ့စည်းပုံ (9၊ 10၊ 12) သည် RC-LH1 complex တွင် ထိန်းသိမ်းထားသော auxiliary quinone binding site ကို ညွှန်ပြသည် (ပုံ S12G)။ RC-LH116 ရှိ ပြိုကွဲသွားသော UQ ငါးခုသည် high performance liquid chromatography (HPLC) မှ ဆုံးဖြတ်ထားသော complex တစ်ခုစီ၏ 5.8±0.7 နှင့် ကောင်းမွန်စွာ ကိုက်ညီပြီး၊ RC-LH114-W ရှိ ပြိုကွဲသွားသော UQ သုံးခုသည် တိုင်းတာထားသောတန်ဖိုး 6.2±0.3 (ပုံ S14) ထက် နိမ့်ကျနေသည်က ဖွဲ့စည်းပုံတွင် မဖြေရှင်းရသေးသော UQ မော်လီကျူးများရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
pseudo-symmetric L နှင့် M polypeptides များတွင် TMH ငါးခုစီပါဝင်ပြီး BChl dimer တစ်ခု၊ BChl monomers နှစ်ခု၊ bacteriophage (BPh) monomers နှစ်ခု၊ non-Heme iron တစ်ခုနှင့် UQ10 မော်လီကျူး တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခုကို ပေါင်းစပ်ထားသော heterodimer တစ်ခုကို ဖွဲ့စည်းသည်။ terminal ketone အုပ်စုပေါ်တွင် ဟိုက်ဒရိုဂျင်ချည်နှောင်မှုများ ရှိနေခြင်းနှင့် Rps တွင် သိရှိထားသော စုဆောင်းမှုမှတစ်ဆင့်၊ carotenoids များကို cis-3,4-dehydroorhodopin ဟု အမည်ပေးထားသော M-subunit တွင် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ Species (25). RC-H ၏ အပြင်ဘက်အမြှေးပါးဒိုမိန်းကို TMH တစ်ခုတည်းဖြင့် အမြှေးပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ RC ဖွဲ့စည်းပုံသည် ဆက်စပ်မျိုးစိတ်များ၏ subunit RC သုံးခု (ဥပမာ Rba) နှင့် ဆင်တူသည်။ sphaeroides (PDB ID: 3I4D)။ BChl နှင့် BPh ၏ macrocycles၊ carotenoid backbone နှင့် non-heme iron တို့သည် ဤဖွဲ့စည်းပုံများ၏ resolution range အတွင်း ထပ်တူကျပြီး QA site ရှိ UQ10 head group နှင့် RC-LH116 ရှိ QB quinone တို့သည်လည်း ထပ်တူကျသည် (ပုံ S15)။
QB site occupancy rates ကွဲပြားသော RC structure နှစ်ခု ရရှိနိုင်မှုသည် QB quinone ချိတ်ဆက်မှုနှင့်အတူ တသမတ်တည်း conformational ပြောင်းလဲမှုများကို စစ်ဆေးရန် အခွင့်အရေးအသစ်တစ်ခုကို ပေးပါသည်။ RC-LH116 complex တွင် QB quinone သည် fully bound “proximal” position (26) တွင် တည်ရှိသော်လည်း RC-LH114-W ခွဲထွက်မှုတွင် QB quinone မရှိပါ။ RC-LH114-W တွင် QB quinone မရှိပါ။ ၎င်းသည် အံ့သြစရာကောင်းသည်မှာ complex သည် structurally resolved QB quinone ရှိသော RC-LH116 complex ထက် ပိုမိုတက်ကြွသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ LH1 rings နှစ်ခုသည် quinones ခြောက်ခုခန့်ကို chelate လုပ်သော်လည်း၊ ငါးခုသည် closed RC-LH116 ring တွင် structurally resolved ဖြစ်ပြီး၊ သုံးခုသာ open RC-LH114-W ring တွင် structurally limited ဖြစ်သည်။ ဤ structural disorder မြင့်တက်လာခြင်းသည် RC-LH114-W QB sites များ ပိုမိုမြန်ဆန်စွာ အစားထိုးခြင်း၊ complex တွင် quinone kinetics ပိုမိုမြန်ဆန်ခြင်းနှင့် LH1 loop ကို ဖြတ်ကျော်နိုင်ခြေ မြင့်တက်လာခြင်းတို့ကို ထင်ဟပ်စေနိုင်သည်။ RC-LH114-W ရဲ့ RC QB site မှာ UQ မရှိခြင်းဟာ ပိုမိုရှုပ်ထွေးပြီး ပိုမိုတက်ကြွတဲ့ complex တစ်ခုရဲ့ ရလဒ်ဖြစ်နိုင်ပြီး RC-LH114-W ရဲ့ QB site ဟာ UQ turnover မှာ ချက်ချင်းရပ်တန့်သွားတယ်လို့ ကျွန်ုပ်တို့ အကြံပြုပါတယ်။ သီးခြားအဆင့် (QB site သို့ ဝင်ပေါက်ကို ပိတ်လိုက်ပါပြီ) ဟာ ဒီလုပ်ဆောင်ချက်ရဲ့ ပုံသဏ္ဍာန်ကို ထင်ဟပ်စေပါတယ်။
QB မပါဘဲ၊ L-Phe217 သည် UQ10 ချိတ်ဆက်မှုနှင့် မကိုက်ညီသော အနေအထားသို့ လှည့်သွားမည်ဖြစ်ပြီး၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းသည် အမြီး၏ ပထမဆုံး isoprene ယူနစ်နှင့် spatial collision ဖြစ်စေမည်ဖြစ်သောကြောင့်ဖြစ်သည် (ပုံ 6A)။ ထို့အပြင်၊ ထင်ရှားသော အဓိက conformational ပြောင်းလဲမှုများသည် အထူးသဖြင့် L-Phe217 ကို QB ချိတ်ဆက်အိတ်ကပ်သို့ ရွှေ့လိုက်သည့် helix de (TMH D နှင့် E အကြားရှိ loop ရှိ တိုတောင်းသော helix) နှင့် L-Tyr223 လည်ပတ်ခြင်း (ပုံ 6A) သည် ထင်ရှားသည်။ M-Asp45 framework နှင့် hydrogen bond ကို ဖြတ်တောက်ပြီး QB ချိတ်ဆက်သည့်နေရာ၏ ဝင်ပေါက်ကို ပိတ်ရန်ဖြစ်သည် (ပုံ 6B)။ Helix de သည် ၎င်း၏အောက်ခြေတွင် pivots များရှိပြီး L-Ser209 ၏ Cα သည် 0.33Å ရွှေ့သွားပြီး L-Val221Cα သည် 3.52Å ရွှေ့သွားသည်။ TMH D နှင့် E တွင် မြင်သာသောပြောင်းလဲမှုများ မရှိပါ၊ ၎င်းတို့သည် structure နှစ်ခုလုံးတွင် ထပ်တူကျနိုင်သည် (ပုံ 6A)။ ကျွန်ုပ်တို့သိသလောက်တော့ ဒါက သဘာဝ RC မှာ QB နေရာကို ပိတ်တဲ့ ပထမဆုံးဖွဲ့စည်းပုံပါ။ ပြီးပြည့်စုံတဲ့ (QB-bound) ဖွဲ့စည်းပုံနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ကြည့်မယ်ဆိုရင် quinone လျော့ကျမသွားခင် quinone ထဲကို ဝင်ဖို့ conformational change တစ်ခု လိုအပ်တယ်ဆိုတာ ပြသနေပါတယ်။ L-Phe217 ဟာ quinone head group နဲ့ π-stacking interaction တစ်ခု ဖွဲ့စည်းဖို့ လည်ပတ်ပြီး helix က အပြင်ဘက်ကို ရွေ့သွားတာကြောင့် L-Gly222 ရဲ့ skeleton နဲ့ L-Tyr223 ရဲ့ side chain ဟာ တည်ငြိမ်တဲ့ hydrogen bond structure ရှိတဲ့ hydrogen bond network တစ်ခုကို ဖွဲ့စည်းနိုင်ပါတယ် (ပုံ ၆၊ A နဲ့ C)။
(A) ဟိုလိုဂရမ် (L ကွင်းဆက်၊ လိမ္မော်ရောင်/M ကွင်းဆက်၊ ပန်းခရမ်းရောင်) နှင့် apo (မီးခိုးရောင်) ဖွဲ့စည်းပုံတို့၏ ထပ်တူကျနေသော ကာတွန်း၊ ၎င်းတွင် အဓိက အကြွင်းအကျန်များကို ချောင်းပုံသဏ္ဍာန်ဖြင့် ပြသထားသည်။ UQ10 ကို အဝါရောင်ဘားဖြင့် ကိုယ်စားပြုသည်။ အစက်ချမျဉ်းကြောင်းသည် ဖွဲ့စည်းပုံတစ်ခုလုံးတွင် ဖွဲ့စည်းထားသော ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးများကို ညွှန်ပြသည်။ (B နှင့် C) Apolipoprotein နှင့် လက်စွပ်ဖွဲ့စည်းပုံတစ်ခုလုံး၏ မျက်နှာပြင်ကိုယ်စားပြုမှု၊ L-Phe217 ကို အပြာရောင်နှင့် အနီရောင်ဖြင့် L-Tyr223 ၏ ဘေးချင်းကွင်းဆက်အောက်ဆီဂျင်ကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။ L အောက်ယူနစ်ခွဲသည် လိမ္မော်ရောင်ဖြစ်သည်။ M နှင့် H အောက်ယူနစ်ခွဲများသည် အရောင်မရှိပါ။ (D နှင့် E) Apolipoprotein (D) နှင့် RC QB နေရာတစ်ခုလုံး (E) [(A) အသီးသီးဖြင့် အရောင်ခြယ်] နှင့် Thermophilus thermophilus PSII (အစိမ်း၊ ပလတ်စတစ် quinone ပါသော အပြာရောင်၊ PDB ID: 3WU2) Align (58)။
မမျှော်လင့်ဘဲ၊ LH1 မပါသော QB-deficient RC များ၏ဖွဲ့စည်းပုံများစွာရရှိနိုင်သော်လည်း၊ ဤလေ့လာမှုတွင်တွေ့ရှိရသော conformational ပြောင်းလဲမှုများကိုယခင်ကအစီရင်ခံတင်ပြခြင်းမရှိပါ။ ၎င်းတို့တွင် Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) နှင့် Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) မှ QB depletion structure ပါဝင်ပြီး ၎င်းတို့အားလုံးသည် ၎င်းတို့၏ QB ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ተመሳሳይနီးပါးဖြစ်သည်။ 3PRC ကို အနီးကပ်စစ်ဆေးခြင်းအားဖြင့် LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ဆပ်ပြာမော်လီကျူးများသည် QB အနေအထား၏ဝင်ပေါက်တွင် ချည်နှောင်ထားပြီး၊ ၎င်းသည် closed conformation သို့ပြန်လည်စီစဉ်ခြင်းကို တားဆီးနိုင်သည်။ LDAO သည် 1EYS သို့မဟုတ် 1OGV တွင် တူညီသောအနေအထားတွင် မပြိုကွဲသော်လည်း၊ ဤ RC များကို တူညီသောဆပ်ပြာကို အသုံးပြု၍ ပြင်ဆင်ထားသောကြောင့် တူညီသောအကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ Rba ၏ crystal structure။ Sphaeroides RC သည် cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) နှင့် တွဲဖက်ပုံဆောင်ခဲဖွဲ့ထားသည်တွင်လည်း ပိတ်ထားသော QB site ရှိပုံရသည်။ သို့သော် ဤကိစ္စတွင် RC-M polypeptide ၏ N-terminal ဒေသ (Q helix ရှိ Tyr residue ၏ H bond မှတစ်ဆင့် QB binding site နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိသည်) သည် သဘာဝမကျသော conformation ကို လက်ခံပြီး QB conformational change ကို နောက်ထပ် မလေ့လာပါ (30)။ စိတ်ချရသောအချက်မှာ RC-LH114-W structure တွင် M polypeptide ၏ ဤကဲ့သို့သော deformation ကို ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရပါ၊ ၎င်းသည် RC-LH116 RC ၏ N-terminal ဒေသနှင့် အတော်လေး ဆင်တူပါသည်။ detergent-based LH1 antenna ကို ဖယ်ရှားပြီးနောက် PDB ရှိ apolipoprotein RC များကို ဖြေရှင်းခဲ့ပြီး RC နှင့် ပတ်ဝန်းကျင် LH1 ring ၏ အတွင်းပိုင်းမျက်နှာပြင်ကြားရှိ gap ရှိ internal quinone pools နှင့် lipids များကို ဖယ်ရှားခဲ့ကြောင်း သတိပြုသင့်သည် (31, 32)။ RC သည် တည်ငြိမ်မှုနည်းပြီး ပြင်ဆင်မှုလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း မကြာခဏ ပျောက်ဆုံးလေ့ရှိသော ပြိုကွဲနိုင်သော QB quinone မှလွဲ၍ cofactors အားလုံးကို ထိန်းသိမ်းထားသောကြောင့် လုပ်ဆောင်နိုင်ဆဲဖြစ်သည် (33)။ ထို့အပြင်၊ RC မှ LH1 နှင့် သဘာဝ cyclic lipids များကို ဖယ်ရှားခြင်းသည် charge-separated P+QB-state ၏ သက်တမ်းတိုတောင်းခြင်းကဲ့သို့သော လုပ်ဆောင်ချက်များကို သက်ရောက်မှုရှိနိုင်ကြောင်း သိရှိရသည် (31၊ 34၊ 35)။ ထို့ကြောင့်၊ RC ကိုဝန်းရံထားသော ဒေသတွင်း LH1 ring ရှိနေခြင်းသည် “ပိတ်ထားသော” QB site ကို ထိန်းသိမ်းထားပြီး QB အနီးရှိ ဒေသတွင်းပတ်ဝန်းကျင်ကို ထိန်းသိမ်းနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။
apolipoprotein (QB quinone မပါ) နှင့် ပြီးပြည့်စုံသောဖွဲ့စည်းပုံသည် QB site ၏ လည်ပတ်မှု၏ snapshot နှစ်ခုကိုသာ ကိုယ်စားပြုသော်လည်း၊ substrate inhibition ကို တားဆီးရန် hydroquinone ဖြင့် ပြန်လည်ချိတ်ဆက်ခြင်းကို ကာကွယ်ရန် gated လုပ်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြချက်များရှိပါသည်။ apolipoprotein ၏ QB site အနီးရှိ quinolol နှင့် quinone တို့၏ အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုသည် ကွဲပြားနိုင်ပြီး၊ ၎င်းသည် RC မှ ငြင်းပယ်ခြင်းကို ဦးတည်စေသည်။ conformational ပြောင်းလဲမှုများသည် quinones များ၏ ချည်နှောင်မှုနှင့် လျှော့ချမှုတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်ဟု ကြာမြင့်စွာကတည်းက အဆိုပြုထားခဲ့သည်။ မှောင်မိုက်သော လိုက်လျောညီထွေဖြစ်မှုပြီးနောက် quinones များကို လျှော့ချရန် frozen RCs များ၏ စွမ်းရည် ချို့ယွင်းနေသည် (36); X-ray crystallography သည် ဤပျက်စီးမှုသည် QB quinones များသည် active proximal position (26), 37) မှ 4.5 Å ခန့်ရှိ “distal” conformation တွင် ပိတ်မိနေခြင်းကြောင့်ဖြစ်ကြောင်း ပြသသည်။ ဤ distal binding conformation သည် apolipoprotein နှင့် full ring structure အကြားရှိ intermediate state ၏ snapshot တစ်ခုဖြစ်ပြီး quinone နှင့် ကနဦး အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု နှင့် QB site ၏ ဖွင့်ခြင်းကို လိုက်နာသည်။
အချို့သော phototrophic ဘက်တီးရီးယားများနှင့် cyanobacteria၊ ရေညှိနှင့် အပင်များ၏ PSII complex တွင်တွေ့ရှိရသော type II RC သည် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ထိန်းသိမ်းမှုရှိသည် (38)။ ပုံ 6 (D နှင့် E) တွင်ပြထားသော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ချိန်ညှိမှုသည် PSII RC များနှင့် ဘက်တီးရီးယား RC complex ၏ QB site အကြား ဆင်တူမှုကို အလေးပေးဖော်ပြသည်။ ဤနှိုင်းယှဉ်မှုသည် quinone ချည်နှောင်မှုနှင့် လျှော့ချမှု၏ အနီးကပ်ဆက်စပ်နေသော စနစ်များကို လေ့လာရန်အတွက် မော်ဒယ်တစ်ခုဖြစ်ခဲ့သည်မှာ ကြာမြင့်ပါပြီ။ ယခင်ထုတ်ဝေမှုများက conformational ပြောင်းလဲမှုများသည် quinones ၏ PSII လျှော့ချမှုနှင့်အတူ လိုက်ပါလာကြောင်း အကြံပြုထားသည် (39၊ 40)။ ထို့ကြောင့် RC ၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ထိန်းသိမ်းမှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားလျှင်၊ ယခင်က မမြင်တွေ့ခဲ့ရသော ဤချည်နှောင်မှုယန္တရားသည် အောက်ဆီဂျင်ပါဝင်သော phototrophic အပင်များတွင် PSII RC ၏ QB site အတွက်လည်း အသုံးချနိုင်သည်။
Rps ΔpufW (အညွှန်းမတပ်ထားသော pufW ဖျက်ခြင်း) နှင့် PufW-His (သဘာဝ pufW locus မှ ဖော်ပြထားသော C-terminal 10x His-tagged protein-W) မျိုးကွဲများ။ palustris CGA009 ကို ကျွန်ုပ်တို့၏ ယခင်လုပ်ငန်း (16) တွင် ဖော်ပြထားပါသည်။ ဤမျိုးကွဲများနှင့် isogenic wild-type parent ကို PYE (တစ်ခုလျှင် 5 g liter -1) (LB တွင် -80 °C တွင် သိမ်းဆည်းထားသော၊ 50% (w/v) glycerol) ပရိုတင်း၊ yeast extract နှင့် succinate) agar [1.5% (w/v)] ပန်းကန်ပေါ်တွင် ဆဲလ်အနည်းငယ်ကို ခြစ်ခြင်းဖြင့် ရေခဲသေတ္တာမှ ပြန်လည်ရယူခဲ့သည်။ ပန်းကန်ကို anaerobic အခြေအနေများအောက်တွင် အခန်းအပူချိန်တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် တစ်ညလုံးထားပြီးနောက် OSRAM 116-W halogen မီးသီးများ (RS Components, UK) မှ ပံ့ပိုးပေးသော အဖြူရောင်အလင်း (~50 μmolm-2 s-1) ဖြင့် တစ်ခုတည်းသော ကိုလိုနီပေါ်လာသည်အထိ ၃ ရက်မှ ၅ ရက်အထိ ထွန်းလင်းပေးခဲ့သည်။ ကိုလိုနီတစ်ခုတည်းကို အသုံးပြု၍ M22+ အလတ်စား (41) ၁၀ ml ကို 0.1% (w/v) casamino acids (ယခုမှစ၍ M22 ဟုရည်ညွှန်းသည်) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ ယဉ်ကျေးမှုကို အောက်ဆီဂျင်နည်းသောအခြေအနေတွင် ၃၄°C ရှိ မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၁၈၀ rpm ဖြင့် ၄၈ နာရီကြာ လှုပ်ခါခြင်းဖြင့် စိုက်ပျိုးပြီးနောက် ယဉ်ကျေးမှု ၇၀ ml ကို အလားတူအခြေအနေတွင် ၂၄ နာရီကြာ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ 1 ml ပမာဏရှိသော semi-aerobic ယဉ်ကျေးမှုကို အသုံးပြု၍ M22 အလတ်စား ၃၀ ml ကို ၃၀ ml universal screw-top ပွင့်လင်းသောဖန်ပုလင်းထဲတွင် ထည့်သွင်းပြီး ပိုးသတ်ထားသော သံလိုက်အား မွှေတံဖြင့် ၄၈ နာရီကြာ မွှေနှောက်ခြင်း (~50μmolm-2 s-1) ဖြင့် ဓာတ်ရောင်ခြည်ပေးခဲ့သည်။ ထို့နောက် ယဉ်ကျေးမှု ၃၀ ml ကို အလားတူအခြေအနေတွင် ယဉ်ကျေးမှု ၁ လီတာခန့်ဖြင့် ထည့်သွင်းခဲ့ပြီး ထို့နောက် ~200 μmolm-2 s-1 တွင် မီးထွန်းထားသော ယဉ်ကျေးမှု ၉ လီတာခန့်ကို ၇၂ နာရီကြာ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို 7132 RCF တွင် မိနစ် 30 ကြာ ဗဟိုခွာစက်ဖြင့် စုဆောင်းခဲ့ပြီး၊ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ၏ 10 ml ခန့်တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ကာ လိုအပ်သည်အထိ -20°C တွင် သိမ်းဆည်းခဲ့သည်။
အရည်ပျော်ပြီးနောက်၊ deoxyribonuclease I (Merck, UK)၊ lysozyme (Merck, UK) နှင့် Roche holoenzyme protease inhibitor ဆေးပြားနှစ်ပြား (Merck, UK) တို့၏ ပုံဆောင်ခဲအချို့ကို ပြန်လည်ပျော်ဝင်စေသောဆဲလ်များထဲသို့ထည့်ပါ။ 20,000 psi ပြင်သစ်ဖိအားဆဲလ် (Aminco, USA) တွင်၊ ဆဲလ်များကို ၈ ကြိမ်မှ ၁၂ ကြိမ်အထိ ရောနှောခဲ့သည်။ မကွဲသေးသောဆဲလ်များနှင့် မပျော်ဝင်နိုင်သော အပျက်အစီးများကို 18,500 RCF တွင် ၄°C တွင် ၁၅ မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် ဖယ်ရှားပြီးနောက်၊ အမြှေးပါးကို pigmented lysate မှ 113,000 RCF တွင် ၄၃,၀၀၀°C တွင် ၂ နာရီကြာ centrifugation ဖြင့် အေးခဲစေခဲ့သည်။ ပျော်ဝင်နိုင်သော အပိုင်းအစကို စွန့်ပစ်ပြီး အရောင်ရှိသောအမြှေးပါးကို 20 mM tris-HCl (pH 8.0) 100 မှ 200 ml တွင် ပြန်လည်ပျော်ဝင်စေပြီး မြင်သာသော အစုအဝေးများ မရှိသည်အထိ homogenize လုပ်ပါ။ ဆိုင်းငံ့ထားသောအမြှေးပါးကို 2% (w/v) β-DDM ပါဝင်သော 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် 4°C တွင် 1 နာရီကြာ ညင်သာစွာမွှေပြီး 4 နာရီကြာထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် 70°C တွင် 150,000 RCF ကို 4°C တွင် 1 နာရီကြာ ပျော်ဝင်စေရန် centrifuge လုပ်ကာ ကျန်ရှိနေသော insoluble ပစ္စည်းများ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။
ΔpufW မျိုးကွဲမှ ပျော်ဝင်နိုင်သော အမြှေးပါးကို 0.03% (w / v) β-DDM ပါဝင်သော 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ပါဝင်သော ကော်လံသုံးခုပါသည့် 50 ml DEAE Sepharose ion exchange column တွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။ CV binding buffer နှစ်ခုဖြင့် column ကို ဆေးကြောပြီးနောက် 50 mM NaCl ပါဝင်သော binding buffer နှစ်ခုဖြင့် column ကို ဆေးကြောခဲ့သည်။ RC-LH116 complex ကို 1.75 CV တွင် 150 မှ 300 mM NaCl (binding buffer တွင်) linear gradient ဖြင့် elut လုပ်ခဲ့ပြီး ကျန်ရှိနေသော binding complex ကို 0.5 CV တွင် 300 mM NaCl ပါဝင်သော binding buffer ဖြင့် elut လုပ်ခဲ့သည်။ ၂၅၀ မှ ၁၀၀၀ nm အကြားရှိ absorption spectrum ကို စုဆောင်းပါ၊ ၈၈၀ မှ ၂၈၀ nm တွင် absorbance ratio (A880/A280) ၁ ထက်ပိုများသော အပိုင်းအစကို သိမ်းဆည်းထားပါ၊ binding buffer တွင် နှစ်ကြိမ်ရောစပ်ပြီး DEAE column တွင် On purification တွင် အလားတူလုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို ထပ်မံအသုံးပြုပါ။ A880/A280 အချိုး ၁.၇ ထက်မြင့်သော နှင့် A880/A805 အချိုး ၃.၀ ထက်မြင့်သော အပိုင်းအစများကို ရောစပ်ပါ၊ အိုင်းယွန်းလဲလှယ်မှု၏ တတိယအချီကို လုပ်ဆောင်ပါ၊ A880/A280 အချိုး ၂.၂ ထက်မြင့်သော နှင့် A880/A805 အချိုး ၅.၀ ထက်မြင့်သော အပိုင်းအစများကို သိမ်းဆည်းထားပါ။ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းသန့်စင်ထားသော ဒြပ်ပေါင်းကို Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK) တွင် ~2 ml အထိ စုစည်းပြီး 200 mM NaCl buffer ပါရှိသော Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) ပေါ်တွင် တင်ကာ 1.5 CV တွင် ထို buffer တွင် elastin လုပ်ခဲ့သည်။ size exclusion fraction ၏ absorption spectra များကို စုဆောင်းပြီး absorption spectra များကို 2.4 အချိုးထက်ကျော်လွန်သော A880/A280 နှင့် 5.8 မှ 100 အချိုးထက်ကျော်လွန်သော A880/A805 အချိုးများဖြင့် စုစည်းကာ cryo-TEM grid ပြင်ဆင်ခြင်း သို့မဟုတ် သိုလှောင်ခြင်းအတွက် ချက်ချင်းအသုံးပြုပါ။ လိုအပ်သည်အထိ -80°C တွင် သိမ်းဆည်းပါ။
PufW-His မျိုးကွဲမှ ပျော်ဝင်စေသော အမြှေးပါးကို IMAC buffer (GE Healthcare) တွင် 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0)၊ 200 mM NaCl နှင့် 0.03% (w/w) ပါဝင်သော) 20 ml ပါဝင်သော HisPrep FF Ni-NTA Sepharose column (20 mM tris-HCl (pH 8.0)) ဖြင့် အသုံးပြုခဲ့သည်။ v) β-DDM]။ ကော်လံကို IMAC buffer CV ငါးခုဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက် 10 mM histidine ပါဝင်သော IMAC buffer CV ငါးခုဖြင့် ဆေးကြောခဲ့သည်။ core complex ကို 100 mM histidine ပါဝင်သော IMAC buffer ငါးခုဖြင့် ကော်လံမှ ထုတ်ယူခဲ့သည်။ RC-LH114-W complex ပါဝင်သော fraction ကို Amicon 100,000 MWCO filter (Merck, UK) တပ်ဆင်ထားသော မွှေထားသော tank တွင် ~10 ml အထိ စုစည်းပြီး binding buffer ဖြင့် 20 ကြိမ် ပျော်ဝင်စေပြီးနောက် 25 ml သို့ ထည့်ပါ။ DEAE Sepharose column တွင် buffer နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော CV လေးခုကို ကြိုတင်အသုံးပြုခဲ့သည်။ CV binding buffer လေးခုဖြင့် column ကိုဆေးကြောပြီးနောက် 0 မှ 100 mM NaCl (binding buffer တွင်) linear gradient ပေါ်တွင် CV ရှစ်ခုပေါ်တွင် complex ကို elute လုပ်ပြီးနောက် 100 mM binding buffer ပါရှိသော ကျန် CV လေးခုကို elute လုပ်ပါသည်။ 2.4 ထက်မြင့်သော A880/A280 အချိုးနှင့် 4.6 ထက်မြင့်သော A880/A805 အချိုးတို့နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော sodium chloride ပေါ်တွင် elute လုပ်ထားသော ကျန်ရှိသော complex များကို Amicon 100,000 MWCO centrifugal filter တွင် ~2 ml အထိ စုစည်းပြီး 1.5 CV IMAC ကို ကြိုတင်ဖြည့်ခဲ့သည်။ Superdex 200 16/600 size exclusion column ကို ချိန်ညှိပြီးနောက် 1.5 CV ပေါ်ရှိ တူညီသော buffer တွင် elut လုပ်ခဲ့သည်။ အရွယ်အစား-ဖယ်ထုတ်မှု အပိုင်းအစများ၏ စုပ်ယူမှုရောင်စဉ်များကို စုဆောင်းပြီး စုပ်ယူမှုရောင်စဉ်များကို A880/A280 အချိုး 2.1 နှင့် A880/A805 အချိုး 4.6 မှ 100 A880 ဖြင့် စုစည်းပါ၊ ၎င်းတို့ကို အေးခဲထားသော TEM grid ပြင်ဆင်မှုအတွက် ချက်ချင်းအသုံးပြုသည် သို့မဟုတ် လိုအပ်သည်အထိ -80°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
အပူချိန်နိမ့် TEM ဇယားကွက်များကို ပြင်ဆင်ရန်အတွက် Leica EM GP immersion freezer ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဒြပ်ပေါင်းကို IMAC buffer တွင် A880 50 အထိ ရောစပ်ပြီးနောက် 5μl ကို glow-discharge လုပ်ထားသော QUANTIFOIL 1.2/1.3 carbon-coated copper mesh (Agar Scientific, UK) ပေါ်သို့ တင်ခဲ့သည်။ ဇယားကွက်ကို 20°C နှင့် 60% relative humidity တွင် 30 s ကြာ incubate လုပ်ပြီးနောက် 3 s ကြာ blot လုပ်ပြီး အခြောက်ခံကာ -176°C ရှိ liquid ethane တွင် ငြိမ်းသတ်ခဲ့သည်။
RC-LH114-W ရှုပ်ထွေးမှု၏ အချက်အလက်များကို eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) တွင် Titan Krios မိုက်ခရိုစကုပ်ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် 300kV ၏ အရှိန်မြှင့်ဗို့အားတွင် အလုပ်လုပ်ပြီး၊ 130,000× ၏ nominal magnification နှင့် 20 eV ၏ gap ကို ရွေးချယ်ပါ။ K2 peak detector ပါရှိသော Gatan 968 GIF Quantum ကို ဒေတာစုဆောင်းရန်အတွက် counting mode တွင် ရုပ်ပုံများကို မှတ်တမ်းတင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ချိန်ညှိထားသော pixel အရွယ်အစားမှာ 1.048Å ဖြစ်ပြီး dose rate မှာ 3.83 e-Å-2s-1 ဖြစ်သည်။ ရုပ်ရှင်ကို ၁၁ စက္ကန့်အတွင်း စုဆောင်းပြီး အပိုင်း ၄၀ ပိုင်းခွဲခဲ့သည်။ ကာဗွန်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော ဧရိယာကို အသုံးပြု၍ မိုက်ခရိုစကုပ်ကို ပြန်လည် focus လုပ်ပြီးနောက် အပေါက်တစ်ပေါက်လျှင် ရုပ်ရှင်သုံးကားကို စုဆောင်းခဲ့သည်။ စုစုပေါင်း ရုပ်ရှင် ၃၁၃၀ ကို စုဆောင်းခဲ့ပြီး၊ -1 မှ -3μm အကြား defocus တန်ဖိုးများ ရှိသည်။
RC-LH116 ရှုပ်ထွေးမှုအတွက် အချက်အလက်များကို Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK) တွင် တူညီသော မိုက်ခရိုစကုပ်ကို အသုံးပြု၍ စုဆောင်းခဲ့သည်။ အချက်အလက်များကို 130 k ချဲ့ထွင်မှုဖြင့် ရေတွက်မုဒ်တွင် စုဆောင်းခဲ့ပြီး၊ pixel အရွယ်အစားကို 4.6 e-Å-2s-1 ပမာဏဖြင့် 1.065 Å သို့ ချိန်ညှိခဲ့သည်။ ရုပ်ရှင်ကို ၁၂ စက္ကန့်အတွင်း မှတ်တမ်းတင်ခဲ့ပြီး အပိုင်း ၄၈ ပိုင်း ပိုင်းခြားခဲ့သည်။ စုစုပေါင်း ရုပ်ရှင် ၃၃၅၉ ကားကို စုဆောင်းခဲ့ပြီး -1 မှ -3μm အကြားရှိ defocus တန်ဖိုးများ ရှိသည်။
ဒေတာလုပ်ဆောင်မှုအားလုံးကို Relion 3.0 pipeline (42) တွင် လုပ်ဆောင်သည်။ dose weighting ဖြင့် beam motion ကို ပြင်ဆင်ရန် Motioncorr 2 (43) ကိုအသုံးပြုပြီးနောက် CTF (contrast transfer function) parameter ကိုဆုံးဖြတ်ရန် CTFFIND 4.1 (44) ကိုအသုံးပြုသည်။ ဤကနဦးလုပ်ဆောင်မှုအဆင့်များပြီးနောက် ပုံမှန် photomicrograph များကို ပုံ ၂ တွင်ပြသထားသည်။ S16။ အလိုအလျောက်ရွေးချယ်မှုပုံစံကို 250-pixel frame နှင့် reference two-dimensional (2D) classification မရှိသော အမှုန် ၁၀၀၀ ၏ pixel ၂၅၀ ခန့်ကို ကိုယ်တိုင်ရွေးချယ်ခြင်းဖြင့် ထုတ်ပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် နမူနာညစ်ညမ်းမှုနှင့် ကိုက်ညီသော သို့မဟုတ် ခွဲခြားသိမြင်နိုင်သော ဝိသေသလက္ခဏာများမရှိသော ခွဲခြားမှုများကို ငြင်းပယ်သည်။ ထို့နောက် microphotograph အားလုံးတွင် အလိုအလျောက်ရွေးချယ်မှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး RC-LH114-W တွင် အမှုန် ၈၄၉,၃၅၉ ရှိပြီး RC-LH116 complex တွင် အမှုန် ၄၇၆,၅၄၇ ရှိသည်။ ရွေးချယ်ထားသော အမှုန်အားလုံးကို non-reference 2D အမျိုးအစားခွဲခြားမှု နှစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ လုပ်ဆောင်မှုတစ်ခုစီပြီးနောက် ကာဗွန်ဧရိယာနှင့် ကိုက်ညီသော၊ နမူနာညစ်ညမ်းမှု၊ ထင်ရှားသောအင်္ဂါရပ်များမရှိခြင်း သို့မဟုတ် ပြင်းထန်စွာထပ်နေသော အမှုန်များကို ငြင်းပယ်ခဲ့ပြီး ရလဒ်အနေဖြင့် 772,033 (90.9%) နှင့် 359,678 (75.5%) အသီးသီးရရှိမည်ဖြစ်သည်။ အမှုန်များကို RC-LH114-W နှင့် RC-LH116 ၏ 3D အမျိုးအစားခွဲခြားမှုအတွက် အသုံးပြုသည်။ ကနဦး 3D ရည်ညွှန်းမော်ဒယ်ကို stochastic gradient descent နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ ကနဦးမော်ဒယ်ကို ရည်ညွှန်းအဖြစ်အသုံးပြု၍ ရွေးချယ်ထားသော အမှုန်များကို 3D တွင် အမျိုးအစားလေးမျိုးခွဲခြားထားသည်။ ဤအမျိုးအစားရှိ မော်ဒယ်ကို ရည်ညွှန်းအဖြစ်အသုံးပြု၍ အကြီးဆုံးအမျိုးအစားရှိ အမှုန်များတွင် 3D refining ကို လုပ်ဆောင်ပြီးနောက် solvent ဧရိယာကို ဖုံးအုပ်ရန် ကနဦး 15Å low-pass filter ကို အသုံးပြုပါ၊ soft edges ၆ ခုထည့်ပါ၊ ထို့နောက် pixels များကို post-process လုပ်ကာ top detector ၏ Gatan K2 peak Modulation transfer function ကို ပြင်ဆင်ပါ။ RC-LH114-W dataset အတွက်၊ ဤကနဦးမော်ဒယ်ကို မျက်နှာဖုံး၏အနားများတွင် ပြင်းထန်သောသိပ်သည်းဆကို ဖယ်ရှားခြင်းဖြင့် ပြုပြင်ခဲ့သည် (UCSF Chimera ရှိ core complex density မှ ပြတ်တောက်သွားသည်)။ ရလဒ်မော်ဒယ်များ (RC-LH114-W နှင့် RC-LH116 ၏ resolution များသည် အသီးသီး 3.91 နှင့် 4.16 Å ဖြစ်သည်) ကို 3D classification ၏ ဒုတိယအကျော့အတွက် reference အဖြစ် အသုံးပြုသည်။ အသုံးပြုထားသော အမှုန်များကို ကနဦး 3D class အဖြစ် အုပ်စုဖွဲ့ထားပြီး ရပ်ကွက်နှင့် ပြင်းထန်သော ဆက်စပ်မှု မပါဝင်ပါ။ ထပ်နေခြင်း သို့မဟုတ် ထင်ရှားသော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အင်္ဂါရပ်များ မရှိခြင်း။ 3D classification ၏ ဒုတိယအကျော့အပြီးတွင်၊ resolution အမြင့်ဆုံးရှိသော အမျိုးအစားကို ရွေးချယ်ခဲ့သည် [RC-LH114-W အတွက်၊ အမျိုးအစားတစ်ခုမှာ အမှုန် ၃၇၇,၇၀၃ ခု (၄၄.၅%) ဖြစ်ပြီး၊ RC-LH116 အတွက်၊ အမျိုးအစားနှစ်ခုရှိပြီး၊ စုစုပေါင်း အမှုန် ၂၆၀,၇၅၂ ခု (၅၄.၇%) ရှိပြီး၊ ကနဦးလည်ပတ်ပြီးနောက် အနည်းငယ်ကွာခြားချက်ဖြင့် ချိန်ညှိသည့်အခါတွင်သာ အတူတူပင်ဖြစ်သည်]။ ရွေးချယ်ထားသော အမှုန်များကို 400-pixel box တွင် ပြန်လည်ထုတ်ယူပြီး 3D refining ဖြင့် သန့်စင်သည်။ solvent mask ကို ကနဦး 15Å low-pass filter၊ 3 pixel map expansion နှင့် 3 pixel soft mask တို့ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်သည်။ per-particle CTF refinement၊ per-particle motion correction နှင့် per-particle CTF refinement ဒုတိယအကျော့၊ 3D refinement၊ solvent masking နှင့် post-processing တို့ကို အသုံးပြု၍ ရလဒ် texture ကို ပိုမိုသန့်စင်ရန် တစ်ဆင့်ချင်းစီ လုပ်ဆောင်သည်။ FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) cut-off တန်ဖိုး 0.143 ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် RC-LH114-W နှင့် RC-LH116 ၏ နောက်ဆုံးမော်ဒယ်များ၏ resolution များသည် အသီးသီး 2.65 နှင့် 2.80Å ဖြစ်သည်။ နောက်ဆုံးမော်ဒယ်၏ FSC curve ကို ပုံ ၂ တွင် ပြသထားသည်။ S17။
ပရိုတိန်းအစီအစဥ်အားလုံးကို UniProtKB မှ ဒေါင်းလုဒ်လုပ်ထားသည်- LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)။ SWISS-MODEL (45) ကို RC ၏ homology model တစ်ခုတည်ဆောက်ရန်အသုံးပြုခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတွင် RC-L၊ RC-M နှင့် RC-H တို့၏ ပရိုတိန်းအစီအစဥ်များနှင့် Rba ၏ crystal structure တို့ပါဝင်သည်။ sphaeroides RC ကို template အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည် (PDB ID: 5LSE) (46)။ UCSF Chimera ရှိ “fit map” tool ကို အသုံးပြု၍ ထုတ်လုပ်ထားသော မော်ဒယ်ကို မြေပုံ (47) နှင့် ကိုက်ညီစေရန်၊ ပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ရန်နှင့် cofactor [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), UQ10 အမျိုးအစား တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်မျိုး (U10), non-heme iron (Fe) တစ်ခုနှင့် 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK) တစ်ခု] ကို ထည့်သွင်းရန် Coot (48) ကို အသုံးပြုပါ။ QAK ကို monomer library တွင် မရရှိနိုင်သောကြောင့်၊ PHENIX (49) ရှိ eLBOW tool ကို အသုံးပြု၍ parameterize လုပ်ခဲ့သည်။
ထို့နောက် LH1 subunit ကို တည်ဆောက်ခဲ့သည်။ အစပိုင်းတွင် PHENIX (49) ရှိ အလိုအလျောက်တည်ဆောက်ရေးကိရိယာကို မြေပုံနှင့် LH1-α နှင့် LH1-β ပရိုတိန်း sequence များကို input အဖြစ်အသုံးပြု၍ LH1 sequence ၏ အစိတ်အပိုင်းကို အလိုအလျောက်တည်ဆောက်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ အပြည့်စုံဆုံး LH1 subunit ကို ရွေးချယ်ပြီး extract လုပ်ပြီး Coot ထဲသို့ load လုပ်ပါ၊ ပျောက်ဆုံးနေသော sequence ကို ကိုယ်တိုင်ထည့်ပါ၊ BCls a (BCL) နှစ်ခုနှင့် spirilloxanthin (CRT) တစ်ခု [သက်ဆိုင်ရာ Rps အရ LH1 complex ၏ သိပ်သည်းဆနှင့် သိရှိထားသော carotenoid ပါဝင်မှု။ မျိုးစိတ် (17)] မထည့်မီ ဖွဲ့စည်းပုံတစ်ခုလုံးကို ကိုယ်တိုင် refine လုပ်ပါ။ LH1 subunit အပြည့်အစုံကို ကူးယူပြီး UCSF Chimera “Docking Map Tool” ကို အသုံးပြု၍ LH1 သိပ်သည်းဆ၏ မော်ဒယ်မဟုတ်သော ဧရိယာတွင် dock လုပ်ပါ၊ ထို့နောက် Coot တွင် refine လုပ်ပါ။ LH1 subunits အားလုံးကို မော်ဒယ်လ်လုပ်ပြီးသည်အထိ လုပ်ငန်းစဉ်ကို ပြန်လုပ်ပါ။ RC-LH114-W ဖွဲ့စည်းပုံအတွက်၊ Coot ရှိ ခွဲဝေမထားသော သိပ်သည်းဆကို ထုတ်ယူခြင်းဖြင့်၊ USCF Chimera မြေပုံရှိ ကျန်ရှိနေသော ပရိုတင်းမဟုတ်သော အစိတ်အပိုင်းများမှ ပရိုတင်းကို အပိုင်းပိုင်းခွဲပြီး Autobuild tool ကို ကနဦးမော်ဒယ်နှင့် ကျန်ရှိနေသော subunits (protein-W) Modeling ကို တည်ဆောက်ရန် အသုံးပြုသည်။ PHENIX (49) တွင်။ Coot (48) ရှိ ရလဒ်မော်ဒယ်သို့ ပျောက်ဆုံးနေသော sequence များကို ထည့်ပြီးပါက subunit တစ်ခုလုံးကို ကိုယ်တိုင် refine လုပ်ပါ။ ကျန်ရှိနေသော ခွဲဝေမထားသော သိပ်သည်းဆသည် lipids (PDB monomer library ID of CDL = CDL၊ POPC = 6PL နှင့် POPG = PGT)၊ β-DDM detergent (LMT) နှင့် UQ10 မော်လီကျူးများ (U10) တို့၏ ပေါင်းစပ်မှုနှင့် ကိုက်ညီသည်။ မော်ဒယ်စာရင်းအင်းများနှင့် fit ၏ visual quality ကို နောက်ထပ်တိုးတက်အောင် မလုပ်နိုင်တော့သည်အထိ ပြီးပြည့်စုံသော ကနဦးမော်ဒယ်ကို ပြီးပြည့်စုံစေရန် Coot (48) ရှိ PHENIX optimization (49) နှင့် manual optimization ကို အသုံးပြုပါ။ နောက်ဆုံးတွင်၊ local map ကို ထက်မြက်စေရန် LocScale (50) ကို အသုံးပြုပြီးနောက်၊ ခွဲဝေမထားသော သိပ်သည်းဆနှင့် automatic နှင့် manual optimization ကို မော်ဒယ်လ်လုပ်ခြင်း၏ အခြားစက်ဝန်းများစွာကို လုပ်ဆောင်ပါ။
သက်ဆိုင်ရာ သိပ်သည်းဆများအတွင်း ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ peptides၊ cofactors နှင့် အခြား lipids နှင့် quinones များကို ပုံ ၁ နှင့် ၂ တွင် ပြသထားသည်။ S18 မှ S23 အထိ။ နောက်ဆုံးမော်ဒယ်၏ စာရင်းအင်းအချက်အလက်များကို ဇယား S1 တွင် ပြသထားသည်။
အခြားနည်းဖြင့် သတ်မှတ်ထားခြင်းမရှိပါက၊ UV/Vis/NIR absorption spectra များကို Cary60 spectrophotometer (Agilent, USA) တွင် 250 nm မှ 1000 nm အထိ 1 nm အကွာအဝေးနှင့် integration time 0.1s တွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။
နမူနာကို quartz cuvette ထဲတွင် 2 mm လမ်းကြောင်းဖြင့် A880 သို့ 1 သို့ ရောစပ်ပြီး 400 မှ 1000 nm အကြား absorption spectrum ကို စုဆောင်းပါ။ circular dichroic spectra များကို Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco၊ ဂျပန်) တွင် 20 nm min-1 ၏ scan rate ဖြင့် 400 nm မှ 950 nm အကြား 1 nm အကွာအဝေးများတွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။
မိုလာ extinction coefficient ကို core complex ကို A880 ခန့်မှန်းခြေ 50 အထိ ရောစပ်ခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည်။ 10μl ပမာဏကို 990μl binding buffer သို့မဟုတ် methanol တွင် ရောစပ်ပြီး BChl degradation ကို လျှော့ချရန် absorption spectrum ကို ချက်ချင်းစုဆောင်းပါ။ မီသနော နမူနာတစ်ခုစီ၏ BChl ပါဝင်မှုကို 54.8 mM-1 cm-1 ၏ 771 nm တွင် extinction coefficient ဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့ပြီး extinction coefficient ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (51)။ တိုင်းတာထားသော BChl ပါဝင်မှုကို 32 (RC-LH114-W) သို့မဟုတ် 36 (RC-LH116) ဖြင့် စားပြီးနောက် buffer Extinction coefficient တွင် စုဆောင်းထားသော နမူနာတူ၏ absorption spectrum ကို ဆုံးဖြတ်ရန် အသုံးပြုသည်။ parallel။ နမူနာတစ်ခုစီအတွက် ထပ်ခါတလဲလဲ တိုင်းတာမှုများ ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး BChl Qy အမြင့်ဆုံး၏ ပျမ်းမျှ absorbance ကို တွက်ချက်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။ 878 nm တွင် တိုင်းတာထားသော RC-LH114-W ၏ မျိုးသုဉ်းကိန်းမှာ 3280±140 mM-1 cm-1 ဖြစ်ပြီး၊ 880 nm တွင် တိုင်းတာထားသော RC-LH116 ၏ မျိုးသုဉ်းကိန်းမှာ 3800±30 mM-1 cm-1 ဖြစ်သည်။
UQ10 ကို (52) ရှိ နည်းလမ်းအတိုင်း ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် Agilent 1200 HPLC စနစ်ကို အသုံးပြု၍ reverse phase HPLC (RP-HPLC) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ 0.02% (w/v) ferric chloride ပါဝင်သော 50:50 methanol:chloroform 50μl တွင် RC-LH116 သို့မဟုတ် RC-LH114-W ၏ 0.02 nmol ခန့်ကို ပျော်ဝင်စေပြီး၊ ကြိုတင်ချိန်ညှိထားသော Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ကို ထိုးသွင်းပါ။ ×25 cm column ပေါ်တွင် HPLC ပျော်ရည် (80:20 methanol:2-propanol) တွင် 40°C ရှိ 1 ml-1 min-1 တွင် ပျော်ဝင်စေသည်။ 275 nm (UQ10)၊ 450 nm (carotenoids) နှင့် 780 nm (BChl) တွင် absorbance ကို စောင့်ကြည့်ရန် HPLC ပျော်ရည်တွင် isocratic elution ကို လုပ်ဆောင်ပါ။ ၂၅.၅ မိနစ်တွင် 275 nm chromatogram ရှိ အမြင့်ဆုံးအထွတ်အထိပ်ကို ပေါင်းစပ်ထားပြီး၊ အခြားထောက်လှမ်းနိုင်သော ဒြပ်ပေါင်းများ မပါဝင်ပါ။ ပေါင်းစပ်ဧရိယာကို 0 မှ 5.8 nmol အထိ သန့်စင်သော စံနှုန်းများ ထိုးသွင်းခြင်းမှ တွက်ချက်ထားသော ချိန်ညှိမျဉ်းကွေးကို ရည်ညွှန်း၍ ထုတ်ယူထားသော UQ10 ၏ မိုလာပမာဏကို တွက်ချက်ရန် အသုံးပြုသည် (ပုံ S14)။ နမူနာတစ်ခုစီကို ထပ်တူသုံးခုဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပြီး အစီရင်ခံထားသော အမှားသည် ပျမ်းမျှ၏ SD နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။
အများဆုံး Qy စုပ်ယူမှု 0.1 ရှိသော RC-LH1 ဒြပ်ပေါင်းပါဝင်သော ပျော်ရည်ကို 30 μM လျှော့ချထားသော မြင်းနှလုံး cytochrome c2 (Merck, UK) နှင့် 0 မှ 50 μMUQ2 (Merck, UK) တို့ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားသည်။ UQ2 ပါဝင်မှုတစ်ခုစီတွင် 1-ml နမူနာသုံးခုကို ပြင်ဆင်ပြီး တိုင်းတာခြင်းမပြုမီ မှောင်မိုက်မှုနှင့် လုံးဝလိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် 4°C တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် တစ်ညလုံးထားခဲ့သည်။ ပျော်ရည်ကို 300 nm flame/500 line grating၊ 1.24 mm inlet၊ 0.12 mm middle နှင့် 0.6 mm outlet slits များတပ်ဆင်ထားသော OLIS RSM1000 modular spectrophotometer ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ excitation light ကိုဖယ်ထုတ်ရန် နမူနာ phototube နှင့် reference photomultiplier tube ၏ဝင်ပေါက်တွင် 600 nm long pass filter ကိုထားရှိသည်။ absorbance ကို 0.15 s integration time ဖြင့် 550 nm တွင် စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။ လှုံ့ဆော်မှုအလင်းကို 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) မှ DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) မှတစ်ဆင့် 90% ပြင်းအားဖြင့် fiber optic cable မှတစ်ဆင့် ထုတ်လွှတ်ပြီး အလင်းရင်းမြစ်သို့ 90° ထောင့်ဖြင့် ထုတ်လွှတ်သည်။ နမူနာမှ ကနဦးစုပ်ယူမထားသော အလင်းကို ပြန်ပို့ရန်အတွက် တိုင်းတာသည့်ရောင်ခြည်သည် မှန်နှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သည်။ 50 s ၏ အလင်းရောင်မတိုင်မီ 10 s တွင် absorbance ကို စောင့်ကြည့်ပါ။ ထို့နောက် quinolol သည် cytochrome c23 + ကို အလိုအလျောက် လျှော့ချပေးသည့် အတိုင်းအတာကို အကဲဖြတ်ရန် မှောင်မိုက်ထဲတွင် 60 s အထိ absorbance ကို ဆက်လက်စောင့်ကြည့်ခဲ့သည် (raw data အတွက် Figure S8 ကိုကြည့်ပါ)။
UQ2 ပါဝင်မှုပေါ် မူတည်၍ 0.5 မှ 10 စက္ကန့်အတွင်း linear initial rate ကို fitting လုပ်ခြင်းဖြင့် data ကို process လုပ်ခဲ့ပြီး UQ2 ပါဝင်မှုတစ်ခုစီတွင် နမူနာသုံးခုလုံး၏ rate များကို ပျမ်းမျှခဲ့သည်။ သက်ဆိုင်ရာ extinction coefficient ဖြင့် တွက်ချက်ထားသော RC-LH1 ပါဝင်မှုကို rate ကို catalytic efficiency အဖြစ်ပြောင်းလဲရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) တွင် plot လုပ်ကာ Michaelis-Menten model သို့ fit လုပ်ကာ ထင်ရှားသော Km နှင့် Kcat တန်ဖိုးများကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
ယာယီစုပ်ယူမှုတိုင်းတာမှုများအတွက် RC-LH1 နမူနာကို 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) နှင့် 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) ပါဝင်သော IMAC buffer တွင် ~2μM အထိ ရောစပ်ခဲ့သည်။ Ascorbic acid ကို sacrificial electron donor အဖြစ်အသုံးပြုပြီး tert-butaclofen ကို QB inhibitor အဖြစ်အသုံးပြုကာ main RC donor သည် တိုင်းတာမှုလုပ်ငန်းစဉ်တစ်လျှောက်လုံး လျှော့ချထားရန် (ဆိုလိုသည်မှာ photooxidized မဖြစ်စေရန်) သေချာစေသည်။ လေဆာလမ်းကြောင်းရှိ နမူနာတွင် လှုံ့ဆော်မှု pulses များအကြား မှောင်မိုက်သော adaptation အတွက် အချိန်လုံလောက်စွာရှိကြောင်း သေချာစေရန်အတွက် နမူနာ 3 ml ခန့်ကို 2 mm optical path length ရှိသော custom rotating cell (အချင်း 0.1 မီတာခန့်၊ 350 RPM) ထဲသို့ ထည့်သည်။ Ti: Sapphire laser system (Spectra Physics, USA) ကို ချဲ့ထွင်ရန် ~100-fs laser pulses များကို အသုံးပြု၍ 1 kHz (NIR အတွက် 20 nJ သို့မဟုတ် Vis အတွက် 100 nJ) ထပ်ခါတလဲလဲနှုန်းဖြင့် 880 nm တွင် နမူနာကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။ ဒေတာမစုဆောင်းမီ နမူနာကို လှုံ့ဆော်မှုအလင်းရောင်နှင့် မိနစ် ၃၀ ခန့်ထိတွေ့စေပါ။ ထိတွေ့မှုသည် QA ကို မလှုပ်ရှားစေပါ (QA ကို တစ်ကြိမ် သို့မဟုတ် နှစ်ကြိမ် လျော့ကျစေနိုင်သည်)။ သို့သော် မှောင်မိုက်သော လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ကြာရှည်စွာလုပ်ဆောင်ပြီးနောက် RC သည် QA လုပ်ဆောင်ချက်သို့ ဖြည်းဖြည်းချင်းပြန်သွားသောကြောင့် ဤလုပ်ငန်းစဉ်သည် ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်ကြောင်း ကျေးဇူးပြု၍ သတိပြုပါ။ Helios spectrometer (Ultrafast Systems, USA) ကို -10 မှ 7000 ps အထိ နှောင့်နှေးချိန်ရှိသော transient spectra များကို တိုင်းတာရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဒေတာအစုံများကို အုပ်စုခွဲရန်၊ ထို့နောက် ပေါင်းစည်းပြီး စံသတ်မှတ်ရန် Surface Xplorer software (Ultrafast Systems, USA) ကိုအသုံးပြုပါ။ ပေါင်းစပ်ဒေတာအစုံကိုအသုံးပြုရန် CarpetView software package (Light Conversion Ltd., Lithuania) ကို အသုံးပြုပါ၊ သို့မဟုတ် Origin (OriginLab, USA) ရှိ single-wavelength spectral evolution နှင့် ကိုက်ညီစေရန် တူရိယာတုံ့ပြန်မှုနှင့် exponents များစွာကို ပေါင်းစပ်ပေးသည့် function တစ်ခုကို အသုံးပြုပါ။
(53) အထက်တွင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း၊ RC နှင့် peripheral LH2 antenna နှစ်မျိုးလုံးမပါရှိသော LH1 complex ပါ၀င်သည့် photosynthetic film တစ်ခုကို ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ membrane ကို 20 mM tris (pH 8.0) ဖြင့် ရောစပ်ပြီးနောက် 2 mm optical path ရှိသော quartz cuvette ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ 30nJ laser pulse ကို 540 nm တွင် -10 မှ 7000 ps အထိ delay time ဖြင့် လှုံ့ဆော်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Rps. pal နမူနာအတွက် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း data set ကို စီမံဆောင်ရွက်သည်။
အမြှေးပါးကို 150,000 RCF တွင် 4°C တွင် 2 နာရီကြာ centrifugation ဖြင့် အမှုန်အမွှားများဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ပြီးနောက် 880 nm ရှိ ၎င်း၏ absorbance ကို 20 mM tris-HCl (pH 8.0) နှင့် 200 mM NaCl တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်။ 4°C တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် 1 နာရီကြာ 2% (w/v) β-DDM ဖြင့် ဖြည်းဖြည်းချင်းမွှေခြင်းဖြင့် အမြှေးပါးကို ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ နမူနာကို 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) တွင် 2.5 mg ml-1 ပရိုတင်းပါဝင်မှုအထိ ရောစပ်ခဲ့သည် (Bio-Rad analysis)။ ယခင်ထုတ်ဝေခဲ့သော နည်းလမ်း (54) မှ နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး 50 μg ပရိုတင်းကို 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK) ပါဝင်သော 50 μl TEAB အဖြစ်သို့ ရောစပ်ခြင်းဖြင့် စတင်ခဲ့သည်။ ၆၀ စက္ကန့်ကြာ sonication ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ ၎င်းကို 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) ဖြင့် 37°C တွင် 30 မိနစ်ကြာ လျှော့ချခဲ့သည်။ S-alkylation အတွက်၊ 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ဖြင့် နမူနာကို incubate လုပ်ပြီး 200 mM isopropanol stock solution မှ အခန်းအပူချိန်တွင် 10 မိနစ်ခန့် ထည့်ပါ။ 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) ကို ထည့်ပြီး 37°C တွင် 3 နာရီကြာ incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် proteolytic digestion ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ laurate surfactant ကို 50 μl ethyl acetate နှင့် 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ကို ထည့်ပြီး 60 စက္ကန့်ကြာ vortexing လုပ်ခြင်းဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့သည်။ phase separation ကို 15,700 RCF တွင် 5 မိနစ်ကြာ centrifugation ဖြင့် မြှင့်တင်ခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ၊ peptide ပါ၀င်သော အောက်ပိုင်းအဆင့်ကို ဂရုတစိုက် စုပ်ယူပြီး ဆားဓာတ်ကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ vacuum centrifugation ဖြင့် အခြောက်ခံပြီးနောက်၊ နမူနာကို 0.5% TFA နှင့် 3% acetonitrile တွင် ပျော်ဝင်စေပြီး၊ 500 ng ကို ယခင်က အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသော system parameters များကို အသုံးပြု၍ mass spectrometry နှင့်အတူ nanoflow RP chromatography ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
Rps. palustris proteome database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) ကို ရှာဖွေရန်အတွက် ပရိုတင်း ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်းအတွက် MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ကို အသုံးပြုပါ။ mass spectrometry proteomics data ကို PRIDE partner repository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) မှတစ်ဆင့် ProteomeXchange Alliance တွင် dataset identifier PXD020402 အောက်၌ သိမ်းဆည်းထားပါသည်။
RPLC ဖြင့် electrospray ionization mass spectrometry နှင့် တွဲဖက်၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် RC-LH1 complex ကို wild-type Rps မှ ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။ ယခင်ကထုတ်ဝေခဲ့သောနည်းလမ်း (16) ကို အသုံးပြု၍ palustris ဆဲလ်များတွင်ထုတ်လုပ်သော ပရိုတိန်းပါဝင်မှုသည် 20 mM Hepes (pH 7.8)၊ 100 mM NaCl နှင့် 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM တွင် 2 mg ml-1 ဖြစ်သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ protocol အရ၊ precipitation နည်းလမ်းဖြင့် 10 μg ပရိုတိန်းကို ထုတ်ယူရန်နှင့် precipitation ကို 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA)၊ 20% (v / v) Acetonitrile နှင့် 20% (v/v) ရေတွင် ပျော်ဝင်စေရန် 2D purification kit (GE Healthcare, USA) ကိုအသုံးပြု၍ precipitation နည်းလမ်းဖြင့် 10 μg ပရိုတိန်းကို ထုတ်ယူပြီး precipitation ကို 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA)၊ 20% (v / v) Acetonitrile နှင့် 20% (v/v) ရေတွင် ပျော်ဝင်စေခဲ့သည်။ ငါးမိုက်ခရိုလီတာများကို RPLC (Dionex RSLC) ဖြင့် mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker) နှင့် တွဲဖက်၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ၆၀°C နှင့် ၁၀၀μlmin -၁ တွင် ခွဲထုတ်ရန်အတွက် MabPac 1.2×100 mm column (Thermo Fisher Scientific, UK) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲထုတ်ပါ။ 90%(v/v) acetonitrile TFA တွင် 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA နှင့် 0.02%(v/v)] နှင့် 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA နှင့် 0.02%(v/v)] ကို gradient ဖြင့် ခွဲထုတ်ပါ။ စံ electrospray ionization source နှင့် default parameter များကို မိနစ် ၆၀ ကျော် အသုံးပြုခြင်းဖြင့် mass spectrometer သည် 100 မှ 2750 m/z (mass-to-charge ratio) ကို ရရှိသည်။ ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/) ၏ အကူအညီဖြင့် mass spectrum ကို complex ၏ subunits များသို့ map လုပ်ပါ။
ဆဲလ်များကို 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1)၊ medium (30μMm-2 s-1) သို့မဟုတ် high (300μMm-2 s-1) အလင်းရောင်အောက်တွင် 72 နာရီကြာ ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ M22 medium (အမိုးနီယမ်ဆာလဖိတ်ကို ချန်လှပ်ထားပြီး ဆိုဒီယမ်ဆက်စီနိတ်ကို ဆိုဒီယမ်အက်စီတိတ်ဖြင့် အစားထိုးထားသော M22 medium) ကို 100 ml screw-top ပုလင်း (23) တွင် ထည့်သွင်းထားသည်။ 30 စက္ကန့်ကြာ ငါးကြိမ်စက်ဝန်းတွင် 0.1 မိုက်ခရွန်ဖန်ပုတီးများကို 1:1 အချိုးဖြင့် ဆဲလ်များကို ပြိုကွဲစေရန်အတွက် ပုတီးစိတ်ပြီး ရေခဲပေါ်တွင် 5 မိနစ် အအေးခံခဲ့သည်။ မပျော်ဝင်နိုင်သော အရာဝတ္ထု၊ မကွဲသေးသော ဆဲလ်များနှင့် ဖန်ပုတီးများကို 16,000 RCF တွင် benchtop microcentrifuge တွင် 10 မိနစ်ကြာ centrifuge လုပ်ခြင်းဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ အမြှေးပါးကို Ti 70.1 rotor တွင် 100,000 RCF ပါရှိသော 20 mM tris-HCl (pH 8.0) တွင် 40/15% (w/w) sucrose gradient ဖြင့် 10 နာရီကြာ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်လုပ်ငန်း၊ PufW (16) ပေါ်ရှိ His tag ၏ immunodetection တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် သန့်စင်ထားသော core complex (11.8 nM) သို့မဟုတ် RC ၏ செறிவுக்குக்குக்குக்குக் (လျှော့ချထားသော ခြားနားချက် spectrum ကိုနုတ်ပြီး stained gel ပေါ်ရှိ load နှင့်ကိုက်ညီခြင်းဖြင့်ဆုံးဖြတ်သည်) ပါဝင်သော membrane ကို နှစ်ကြိမ်ရောစပ်ခဲ့သည်။ ပရိုတင်းများကို 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK) တွင် ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ RC-L subunit ကို load လုပ်ပြီး visualize လုပ်ရန် gel ကို Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ဖြင့် stain လုပ်ခဲ့သည်။ ဒုတိယ gel ရှိပရိုတင်းကို immunoassay အတွက် methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) သို့လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ PVDF အမြှေးပါးကို 50 mM tris-HCl (pH 7.6)၊ 150 mM NaCl၊ 0.2% (v / v) Tween-20 နှင့် 5% (w / v) skimmed milk powder တို့တွင် ပိတ်ဆို့ပြီးနောက် anti-His primary antibody (1:1000 A190-114A၊ Bethyl Laboratories၊ USA တွင် antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6)၊ 150 mM NaCl နှင့် 0.05% (v/v) Tween-20] ကို ရောစပ်ပြီး 1:1000 A190-114A တွင်) ၄ နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ antibody buffer တွင် ၅ မိနစ် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက်၊ membrane ကို horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (antibody buffer တွင် 1:10,000 ရောစပ်ပြီး) နှင့် ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) နှင့် Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) တို့ကို အသုံးပြု၍ ထောက်လှမ်းနိုင်စေရန် incubate လုပ်ခဲ့သည်။
ImageJ (57) တွင် စွန်းထင်းနေသော ဂျယ် သို့မဟုတ် immunoassay လမ်းကြောင်းတစ်ခုစီ၏ ပြင်းထန်မှုဖြန့်ဖြူးမှုကို ရေးဆွဲခြင်း၊ အထွတ်အထိပ်အောက်ရှိ ဧရိယာကို ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် RC-L (စွန်းထင်းနေသော ဂျယ်) နှင့် Protein-W (immunoassay) ၏ ပြင်းထန်မှုအချိုးကို တွက်ချက်ခြင်းဖြင့် ပုံကို စီမံဆောင်ရွက်ပါ။ သန့်စင်သော RC-LH114-W နမူနာတွင် RC-L မှ ပရိုတင်း-W အချိုးသည် 1:1 ဖြစ်သည်ဟု ယူဆပြီး ဒေတာအစုံတစ်ခုလုံးကို ယင်းအတိုင်း ပုံမှန်ဖြစ်စေခြင်းဖြင့် ဤအချိုးများကို မိုလာအချိုးများအဖြစ် ပြောင်းလဲခဲ့သည်။
ဤဆောင်းပါးအတွက် ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများအတွက် http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ကိုကြည့်ပါ။
ဤသည်မှာ Creative Commons Attribution License ၏ စည်းကမ်းချက်များအောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသော အခမဲ့ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုနိုင်သော ဆောင်းပါးတစ်ပုဒ်ဖြစ်သည်။ မူရင်းလက်ရာကို သင့်လျော်စွာ ကိုးကားဖော်ပြထားပါက မည်သည့်မီဒီယာတွင်မဆို ကန့်သတ်ချက်မရှိ အသုံးပြုခြင်း၊ ဖြန့်ဝေခြင်းနှင့် ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခြင်းတို့ကို ခွင့်ပြုထားသည်။
မှတ်ချက်- စာမျက်နှာသို့ သင်အကြံပြုထားသော ပုဂ္ဂိုလ်သည် သင်သည် အီးမေးလ်ကို မြင်စေလိုကြောင်းနှင့် ၎င်းသည် spam မဟုတ်ကြောင်း သိရှိစေရန်အတွက် သင့်အီးမေးလ်လိပ်စာကို ပေးရန်သာ ကျွန်ုပ်တို့ တောင်းဆိုပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မည်သည့်အီးမေးလ်လိပ်စာကိုမျှ မရယူပါ။
ဒီမေးခွန်းကို သင်ဟာ လာရောက်လည်ပတ်သူ ဟုတ်မဟုတ် စမ်းသပ်ဖို့နဲ့ အလိုအလျောက် spam တင်သွင်းမှုကို ကာကွယ်ဖို့ အသုံးပြုပါတယ်။
David JK Swainsbury၊ Park Qian၊ Philip J. Jackson၊ Kaitlyn M. Faries၊ Dariusz M. Niedzwiedzki၊ Elizabeth C. Martin၊ David A. Farmer၊ Lorna A. Malone၊ Rebecca F. Thompson၊ Neil A. Ranson၊ Daniel P Canniffe၊ Mark J. Dickman၊ Dewey Holten၊ Christine Kirmaier၊ Andrew Hitchcock၊ C. Neil Hunter
ဓာတ်ပြုမှုစင်တာရှိ light trap 1 complex ၏ မြင့်မားသော resolution ရှိသည့်ဖွဲ့စည်းပုံသည် quinone ဒိုင်းနမစ်အတွက် အသိအမြင်အသစ်များကို ပေးပါသည်။
David JK Swainsbury၊ Park Qian၊ Philip J. Jackson၊ Kaitlyn M. Faries၊ Dariusz M. Niedzwiedzki၊ Elizabeth C. Martin၊ David A. Farmer၊ Lorna A. Malone၊ Rebecca F. Thompson၊ Neil A. Ranson၊ Daniel P Canniffe၊ Mark J. Dickman၊ Dewey Holten၊ Christine Kirmaier၊ Andrew Hitchcock၊ C. Neil Hunter
ဓာတ်ပြုမှုစင်တာရှိ light trap 1 complex ၏ မြင့်မားသော resolution ရှိသည့်ဖွဲ့စည်းပုံသည် quinone ဒိုင်းနမစ်အတွက် အသိအမြင်အသစ်များကို ပေးပါသည်။
© 2021 သိပ္ပံတိုးတက်မှုအတွက် အမေရိကန်အသင်း။ မူပိုင်ခွင့်ကိုလက်ဝယ်ထားသည်။ AAAS သည် HINARI၊ AGORA၊ OARE၊ CHORUS၊ CLOCKSS၊ CrossRef နှင့် COUNTER ၏ ပါတနာဖြစ်သည်။ ScienceAdvances ISSN 2375-2548။